分析化學課件：第十四章 平面色譜法

第十四章平面色譜法分析化學(下第三版)一、概述二、平面色譜技術(shù)參數(shù)三、平面色譜固定相與制備四、樣品的制備與點樣五、平面色譜的展開六、展開后處理與斑點定位七、定性分析方法八、紙色譜法簡介九、平面色譜法的特點及應用主要內(nèi)容第一節(jié)概述平面色譜法(planechromatography)是在平面上進行分離的一種色譜方法；主要包括薄層色譜法、紙色譜法和薄層電泳法。一般過程：

鋪板→活化→點樣→展開→定位(定性)/洗脫(定量)

平面色譜的分類及分離機理紙色譜法（PC,paperchromatography）：屬分配色譜薄層色譜法(TLC,thinlayerchromatography)：吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層、凝膠薄層薄層色譜法：經(jīng)典薄層、高效薄層(HPTLC)、高壓薄層(OPTLC)薄層電泳法(thinlayerelectrophoresis,了解)：主要用于生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、多肽、糖類）等帶電荷的物質(zhì)。第二節(jié)平面色譜的主要技術(shù)參數(shù)一、定性參數(shù)二、相平衡參數(shù)三、面效參數(shù)四、分離參數(shù)一、定性參數(shù)(qualityparameters)1.比移值Rf(Retentionfactor)續(xù)前討論

Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)。

色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說明組分的色譜保留行為續(xù)前1）Rf范圍：0<Rf<1

（組分遷移速度和距離小于展開劑遷移速度和距離）

Rf=0.2——0.8（常用）

0.3——0.5（最佳）2)影響Rf的因素:被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),薄層板的性質(zhì),展開劑的性質(zhì),溫度,展開劑蒸汽等續(xù)前2.相對比移值Rs(了解)討論參考物與被測組分在完全相同條件下展開可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1二、相平衡參數(shù)相平衡參數(shù)：分配系數(shù)K和容量因子kR’表示單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率，也可以表示組分分子在平面上移動的速度.Rf＝L/L0=ut/u0t，定時展開時R’＝Rf討論

⑴

Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)，K↑大，Rf↓?、票影逡欢?，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，對于極性組分，

展開劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）展開劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀紫疵摚?/p>

⑶Rf＝1K或k=0組分在前沿

Rf＝0K或k=∞組分在原點（三）面效參數(shù)1、理論塔板數(shù)

n=16(L/W)2L:原點到斑點中心的距離

W：組分斑點的縱向?qū)挾?、塔板高度

H=L0/nL0：原點到展開劑前沿的距離

n越大，H越小。（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)兩相鄰斑點中心的距離與兩斑點平均寬度的比值

L1

、L2:分別為原點至兩半斑點中心的距離，W1、W2斑點的寬度。2.分離數(shù)(separationnumberSN，了解)定義：相鄰斑點分離度為1.177時，在Rf=0(原點)到Rf=1(溶劑前沿)之間能容納的色譜斑點數(shù)。

一般薄層板的分離數(shù)為7~10，高效薄層板可達10~20。SN是衡量分離容量的重要參數(shù)第三節(jié)平面色譜固定相與制備一、平面色譜常用吸附劑(absorbent)：

多孔、微粒狀物質(zhì),吸附能力與吸附中心的多少及氫鍵形成能力的大小有關(guān)

1.硅膠

2.氧化鋁

3.聚酰胺1.硅膠（SiO2·H2O,silicagel）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

特性：

1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→強極性吸附中心，不易洗脫吸附活性次序：活潑型>束縛型>游離型

2）吸水→失活→105～110OC烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力適用：分析酸性或中性物質(zhì)

續(xù)前2.氧化鋁堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁pH＞7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)3.聚酰胺氫鍵作用氫鍵能力↑強，組分比移值越小二、吸附劑的選擇原則

根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力被測物極性強——弱極性吸附劑被測物極性弱——強極性吸附劑三、薄層板的制備(preparationoftheplate)定性分析——窄條定量分析——10×20cm硅膠G——自含粘和劑硅膠H——不含粘和劑，鋪板時另加入CMC-Na硅膠GF254——含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠GF365——含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光第四節(jié)樣品制備與點樣一、點樣溶液的制備二、點樣方式與方法三、點樣工具一、點樣溶液的制備由于平面色譜一般為一次性使用，故樣品一般不需要復雜的前處理，應注意的幾個問題有：配制點樣溶液的溶劑對樣品的溶解度不宜過大，應盡量為有機溶劑，避免使用水；根據(jù)方法的靈敏度，配制合適的供試品溶液的濃度（0.01%~1.00%），必要時應進行稀釋和濃縮；選擇合適的檢測方式，可根據(jù)檢測方法的不同，對樣品進行必要的前處理，如衍生溶劑粘度不宜過高，且沸點適宜。二、點樣設(shè)備和點樣方式點狀點樣：是最為常用的點樣方式。定性分析可選用內(nèi)徑為0.5mm管口平整的毛細管或微量注射器點樣；定量分析可選用微量注射器或自動的微量點樣裝置進行。帶狀點樣：當樣品溶液的體積大、濃度稀時，可采用自動的點樣器進行帶狀點樣，常用來進行制備分離。適用于定量制備分析。自動點樣（了解）：全自動點樣裝置結(jié)合了現(xiàn)代最先進的電子及機械技術(shù)，能進行點狀點樣或帶狀點樣，采用計算機程序控制，靈活多用，定量結(jié)果精密準確。特殊的點樣方式（了解）熱微量抽提法：將一些藥物進行微量升華等熱微量分離轉(zhuǎn)移技術(shù)與薄層色譜法連用的方法。此法的優(yōu)點是大大縮短了提取生藥中揮發(fā)性成分前處理的時間，簡化了提取方法，減少了樣品用量，缺點是不宜用于非揮發(fā)性成分。此法亦可用于小量生藥的半定量分析，生藥成分的微量制備以及生藥的指紋鑒定等。流體提取法：物質(zhì)在超臨界流體中的溶解度由于壓縮氣體與溶質(zhì)分子間相互作用加強而大大增加。改變溫度和壓力就可改變超臨界流體的特性，因此可以分別在一定溫度和壓力條件下將不同極性的成分從樣品中提取出來，并與薄層連用。此法主要應用于中藥有效成分分析。點狀點樣a=20mmb=15mmc=10mm條狀點樣a=20mmb=15mmc=10mmd=5mm點樣示意圖三、點樣工具（了解）第五節(jié)平面色譜的展開一、展開劑的選擇二、展開方式三、展開缸四、影響展開的因素一、展開劑的選擇選擇原則：在相似相容原則下，兼顧溶劑的純度、穩(wěn)定性、粘度、蒸汽壓以及毒性等性質(zhì)展開劑中各組分的作用（了解）展開劑中比例較大的溶劑極性相對較小，起溶解溶質(zhì)和基本分離的作用，一般稱為底劑。展開劑中比例較小的溶劑，極性較大，對被分離物質(zhì)有較強的洗脫力，幫助化合物在薄層上移動，可以增大比移值，但不能提高分辨率，可稱為極性調(diào)節(jié)劑。展開劑中加入少量酸、堿，可抑制某些酸、堿性物質(zhì)或其鹽類的解離而產(chǎn)生斑點拖尾，稱為拖尾抑制劑。展開劑中加入丙酮等中等極性溶劑，可促使不相混合的溶劑混溶，并可降低展開劑的粘度，加快展速，助溶劑。二、展開方式線性展開上行展開下行展開雙向展開近水平展開環(huán)形展開：適用于比移值較小的組分展開多次展開單向多次增量多次展開階式展開連續(xù)展開分離－反應－分離超壓薄層旋轉(zhuǎn)薄層上行展開紙色譜下行展開裝置不同種元胡多次展開薄層色譜圖第一次展開第二次展開第三次展開三、展開缸展開缸的底部必須平整，薄層板放入后能呈水平；展開缸必須密閉，使展開缸內(nèi)能被展開劑蒸氣飽和且展開劑組成不變，得到理想的分離及重現(xiàn)的結(jié)果。磨口蓋要嚴密，必要時可涂少量凡士林或甘油淀粉糊密封，但須防止污染薄層板及展開劑。展開缸薄層展開缸常用方形及園形二種，方形者有不同尺寸及平底或夾心槽（雙槽）可供。圓形上端用鋼卡使玻璃蓋扣緊密封。雙槽展開缸使用時先將展開劑倒在槽的一側(cè)，將薄層板放入到另一側(cè)，密閉飽和一段時間后再將展開缸傾斜，使展開劑流入放有薄層板的一側(cè)，進行展開。雙槽展開缸1、先將板斜放入無展開劑的槽內(nèi)進行飽和2、飽和10~15min后傾斜展開缸，讓板浸入展開劑中展開圓形展開缸四種飽和方式：A不飽和；B部分飽和；C有濾紙直接展開法；D充分飽和ABCD四、影響展開的因素1、相對濕度2、溶劑蒸氣3、溫度4、展開方式5、展距6、展開缸的放置影響展開的因素1：相對濕度在吸附薄層中，特別是應用親水性吸附劑，展開的過程中，空氣的相對濕度以及展開室中的水蒸汽必須嚴格控制，因為水蒸汽與吸附劑之間有很大的親和力，即使是微量的水蒸汽對色譜分離結(jié)果也會產(chǎn)生較大影響。展開時最佳相對濕度范圍決定于溶質(zhì)和溶劑的極性。薄層展開時控制濕度應注意的問題（了解）記錄相對濕度：在色譜條件中除固定相、展開劑等條件外，將認為最佳分離條件時的相對濕度記錄下來，為以后工作提供參考?？刂葡鄬穸攘蛩崛芤悍o機鹽飽和溶液法薄層展開時控制濕度應注意的問題硫酸溶液控制濕度方法表影響展開的因素2：溶劑蒸氣平面色譜分離過程是在兩相未充分平衡的狀態(tài)下進行的，與柱色譜不同，氣相也參與了展開過程，因此薄層的展開過程比較復雜。也因此產(chǎn)生了一些現(xiàn)象如邊緣效應、雙展開前沿等。常規(guī)的平底展開室一般是用展開劑浸濕的濾紙貼在展開室內(nèi)壁，如果需要可用小燒杯盛與展開劑不同的揮發(fā)性酸、堿進行飽和或預平衡。另展開時，應注意展開室的密閉。影響展開的因素3：溫度展開時環(huán)境的溫度對紙色譜的影響較大，一方面是由于紙色譜展開時間較長，另一方面因為紙色譜屬于分配色譜，組分的分配系數(shù)受溫度的影響比較明顯，因此在進行紙色譜的展開時應注意保持恒定的溫度。溫度對薄層色譜的影響較紙色譜小，在吸附色譜上，溫度從20度變到4度即不影響展開時間，也不影響比移值，除了特殊要求，薄層色譜可在室溫下進行。影響展開的因素4：展開方式不同的展開方式，不同的展開條件對平面色譜的分離效果有明顯的影響。應根據(jù)樣品的理化性質(zhì)及分析要求選擇合適的展開方式。影響展開的因素5：展距一般紙色譜的展距為20～30cm,常規(guī)薄層展距未10～20cm，高效薄層展距為5～10cm，在這種展距內(nèi)得不到分離得組分，增加展距并非是解決問題得方法，因為分離度僅正比于展距得平方根，延長展距不僅延長了時間，而且會引起斑點擴散降低分離度?？梢酝ㄟ^改變展開方式或優(yōu)化展開劑，以得到理想的分離結(jié)果。影響展開的因素6：展開室的放置展開室應放在水平、穩(wěn)定的實驗臺上，不能有陽光直射，也不能在通風處放置，離開熱源，避免溫度波動對分離不利，光敏物質(zhì)的分離應將展開室置于暗處。第六節(jié)展開后處理與檢視一、展開后處理二、斑點檢視

1、光學檢視

2、蒸氣檢視

3、試劑顯色

4、生物自顯影一、展開后處理1、到達目標展距，立即取出標記溶劑前沿；2、立即去除平面上的展開劑，以防定性參數(shù)測量錯誤以及斑點擴散等不良后果。二、斑點檢視1：光學檢測

此法使用方便，被檢出物質(zhì)不被破壞，適用于雙向展開，多次展開時的定位，也適用于洗脫定量時定位。是平面色譜定位的首選方法。吸收可見光組分可目視檢測；吸收紫外線組分可紫外光檢測；發(fā)射熒光組分可進行熒光檢測；吸收紫外線但無紫外光譜特征的組分可利用熒光板形成的暗斑檢測。光學檢測紫外燈檢出宜在暗室中進行，365nm常用于組分所固有或與試劑作用后產(chǎn)生的熒光，254nm則可因該組分吸收此波長的光呈現(xiàn)可見斑點。若樣品系用熒光板展開，則組分因其對板上熒光物質(zhì)的淬滅作用，將在亮的熒光背景上，呈現(xiàn)暗的斑點。光學檢測365nm254nm便攜式紫外檢測器(UVD)二、斑點檢視2：蒸氣顯色采用碘蒸氣顯示薄層板上有機物的斑點有很多優(yōu)點：簡單、快速靈敏、經(jīng)濟，它是非破壞性的，并且易于在板上勾畫斑點。

利用一些物質(zhì)的蒸氣與樣品作用生成不同顏色或產(chǎn)生熒光。反應有可逆和不可逆兩種，如常用的碘蒸氣。二、斑點檢視3：試劑顯色根據(jù)被檢出化合物的理化性質(zhì)選擇適當?shù)娘@色劑使之生成顏色或熒光穩(wěn)定、輪廓清楚、靈敏度高、專屬性強的斑點。此法是平面色譜中廣泛應用的方法。如氨基酸的顯色定位。氣壓式噴霧器二、斑點檢視4：生物自顯影具有生物活性的物質(zhì)，如抗菌素等，在紙或薄層上分離后與有相當?shù)奈⑸锏沫傊囵B(yǎng)基表面接觸，經(jīng)在一定溫度下培養(yǎng)后，有抗菌活性物質(zhì)處的微生物生長受到抑制，瓊脂表面出現(xiàn)抑菌點而得到定位。主要用于抗菌素的效價測定、中藥才鑒定等第七節(jié)定性與定量分析

1、定性分析——日光，紫外光，顯色

2、定量分析——洗脫法，薄層掃描法（了解）1、薄層定性分析斑點的比移值斑點的顯色特性：在自然光或紫外光下根據(jù)斑點的熒光或顏色定性，是中藥指紋圖譜的重要鑒別方法。原位光譜掃描：通過各種圖譜掃描，可對樣品和對照品進行對比定性。薄層和其它分析技術(shù)的聯(lián)用：如氣相色譜、液相色譜、電化學法及各種光譜法等，極大的增加了薄層的定性能力。定性每種組分的Rf值在一定條件下為一常數(shù)，但由于影響Rf值的因素較多，因此根據(jù)一種展開劑展開后得到的Rf值作為定性依據(jù)是不夠的，需要經(jīng)過兩種以上不同組成性質(zhì)的展開劑得到的Rf值并與對照標準品比較，相互一致時，才可認定該斑點與對照品是同一種化合物，如果二者的Rf值不同，可以作出不是同一化合物的結(jié)論。第八節(jié)紙色譜法(PaperChromatography,PC)將固定相放在紙上，以紙做載體進行點樣、展開、定性、和定量的液-液分配色譜法固定相：紙纖維吸附的水流動相：與水不互溶的有機溶劑（飽和正丁醇）分離機制：同液-液分配色譜定性參數(shù)：討論：Rf與組分性質(zhì)、流動相及溶解度有關(guān)極性組分→易保留，Rf?。鲃酉鄻O性↑，Rf↑）非極性組分→易流出，Rf大（流動相極性↑，Rf↓）第九節(jié)平面色譜的特點及應用（了解）一、平面色譜的特點二、薄層色譜在中藥分析中的應用三、薄層色譜在合成藥物分析中的應用四、薄層色譜在其他領(lǐng)域中的應用一、平面色譜法特點1：優(yōu)點由于固定相是一次性使用，樣品的前處理比較簡單對被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒有限制，應用廣泛平面色譜具有多路柱效應，可同時平行分離多個樣品分離樣品所需展開劑量極少，即節(jié)約溶劑又減少了污染固定相，特別是流動相選擇范圍寬，有利于不同性質(zhì)化合物的分離應用不同的展開方式有利于難分離物質(zhì)對的分離同一色譜是可根據(jù)分離化合物的性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測方式進行定性或定量。唯有薄層色譜技術(shù)可提供原始彩色圖像，不僅便于保存原始圖像并可通過色譜圖像分析提供多層面的信息，直觀性、可比性極強。一、平面色譜的特點2：重現(xiàn)性差層析結(jié)果受多種因素影響，如只作定性分離，則對每一步的要求和操作不很嚴格，如果要作含量測定、雜質(zhì)檢查，則每一步都要十分注意并嚴格操作，否則達不到定量