逍遙散及其功效拆方對cums抑郁模型大鼠行為活動和學習記憶能力的影響

逍遙散及其功效拆方對cums抑郁模型大鼠行為活動和學習記憶能力的影響

逍遙散是宋代太平惠民和菊花的配方。它由柴胡、薄荷、當歸、白芍和白術組成。它具有平肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，對肝氣郁結、氣血健脾非常有效。臨床應用于抑郁癥、胃腸神經(jīng)官能癥和年綜合征。屬于“抑郁綜合征”。臨床觀察和實驗研究已證實,逍遙散具有確切的抗抑郁作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),逍遙散全方及其君藥(柴胡)、臣藥(當歸、白芍)對CUMS模型大鼠和行為絕望模型小鼠表現(xiàn)出較好的抗抑郁作用,而逍遙散去柴胡-當歸-白芍藥組的抗抑郁作用不顯著。為進一步探討逍遙散的配伍合理性和治法科學性,本研究通過“功效拆方”的研究模式,觀察逍遙散及其功效拆方對CUMS模型大鼠行為學指標的影響,以期初步闡釋逍遙散的治法、配伍特點。1材料表面1.1用藥、構成、濃縮組逍遙散組成依照《方劑學》所載(所含藥物均以60kg成人日用量為準):柴胡9g,薄荷1.5g,當歸9g,白芍9g,白術9g,茯苓9g,炙甘草4.5g,生姜9g。所用藥物飲片購自成都太極大藥房,經(jīng)本校嚴鑄云教授鑒定符合2010版藥典要求。各組藥物構成如下:全方組(逍遙散)、疏肝藥組(柴胡+薄荷)、養(yǎng)血藥組(當歸+白芍)、疏肝藥+健脾藥(柴胡+薄荷+白術+茯苓+生姜+炙甘草)、養(yǎng)血藥+健脾藥組(當歸+白芍+白術+茯苓+生姜+炙甘草)。各組藥物按組成要求分別取相應適量的藥材,以8倍于藥材總量的水浸泡30min,加熱煮沸后文火煎煮60min,趁熱過濾藥液;再加6倍量水,依同法分別煎煮40min和30min;合并3次濾液,60℃條件下減壓濃縮至所需濃度,置4℃冰箱備用。各組藥物劑量均按上述所載成人日用量的30倍進行計算。鹽酸阿米替林,批號039K1600,Sigma公司,劑量10mg·kg-1。1.2實驗動物及儀器Wistar大鼠,SPF級,雄性,體重(200±20)g,四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究中心提供,合格證號SCXK(川)2008-24。1.3視頻跟蹤及分析系統(tǒng)RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮公司);MT-visionMorris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技公司);Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)(美國MediaCybernetics,Inc);敞箱(100cm×100cm自制木箱,底部等分100個10cm×10cm小格)。2方法2.1各組大鼠的造模及給藥方案大鼠適應性飼養(yǎng)4d后按體重分層隨機分為8組:空白組、模型組、阿米替林(10mg·kg-1)、逍遙散組(30g·kg-1)、疏肝藥組(5.25g·kg-1)、養(yǎng)血藥組(9g·kg-1)、疏肝藥+健脾藥組(21g·kg-1)、養(yǎng)血藥+健脾藥組(24.75g·kg-1)。除空白組大鼠合籠飼養(yǎng)外,其余各組大鼠均單只單籠飼養(yǎng)。分組后開始造模,從造模第3周開始,受試藥物組大鼠每日灌胃給藥1次,灌胃體積10mL·kg-1體重,空白組和模型組大鼠每日灌胃給予等容積蒸餾水,連續(xù)給藥4周。糖水偏愛試驗在造模前及之后的每周固定時間進行,體重測定在造模前和每周糖水偏愛實驗之前進行,自主活動測定在給藥前、給藥2周、給藥4周進行,Morris水迷宮測試在造模第6周開始進行。2.2未同時點刺激因子的確定參考文獻稍作改進,刺激因子包括以下14種:異物放置、噪音(10dB)+電刺激(1mA)、通宵照明、禁食、冷刺激(4℃)、熱刺激(45℃)、水平震蕩、潮濕墊料、禁水、明暗循環(huán)、異味刺激、合籠、禁食+禁水、鼠籠傾斜(45°)。應用DPSv3.01統(tǒng)計軟件將14種刺激因子隨機分配到每周7d,每日安排2種刺激,使動物不能預料刺激的發(fā)生。每周每日安排不同,共執(zhí)行6周,空白組不給予任何刺激。2.3大鼠行駛格數(shù)和大/小雙方向輔助觀察參考文獻稍作改進,將大鼠放入自制敞箱的固定位置,適應2min后觀察并記錄隨后4min內(nèi)大鼠的爬行格數(shù)(大鼠雙后肢進入下一格記為爬行1格)和站立次數(shù)(大鼠雙前肢抬離箱底記為站立1次)。2.4底糖固定和采集參考文獻稍作改進,造模前對大鼠進行1次1%糖水偏好訓練(大鼠單只放于鼠盒內(nèi),每個鼠盒放置事先稱重的2個水瓶:分別裝有純水和1%糖水,喂水1h后撤除)。于CUMS造模程序開始前測定糖水偏愛百分比基線水平(即第1次測定,方法同訓練),造模開始后于每周固定時間測定糖水偏愛百分比。糖水偏好訓練和糖水偏愛百分比測試均于大鼠禁食禁水24h后進行。2.5體重測于造模前和每周糖水偏愛實驗之前進行體重稱量并記錄。以大鼠體重增長度(本周體重-前1周體重)作為評價指標。2.6逃避刑期實驗測定大鼠的空間學習記憶能力。于造模第6周開始對大鼠進行定位航行測試:受試大鼠頭部標記苦味酸,依次從4個象限將大鼠面向池壁輕輕放入池中,測定120s內(nèi)大鼠找到平臺所需的時間(即逃避潛伏期,escapelatency),如120s內(nèi)大鼠不能觸到平臺,則實驗者將其引上平臺,記錄逃避潛伏期為120s,所有大鼠均在平臺停留10s,每天1次(含4個象限,即4輪),連續(xù)4d,以第4天逃避潛伏期代表大鼠的學習記憶成績。并在第4天定位航行測試之后進行空間探索實驗:撤除平臺,從原平臺象限對側(cè)池壁中點將大鼠放入水中,記錄120s內(nèi)大鼠在原平臺象限的游泳時間和距離,以及進入原平臺、原平臺象限的次數(shù)。以目標象限運動距離百分比和有效區(qū)域進入次數(shù)作為評價指標。2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)均以ue0af±s表示,采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性時采用單因素方差分析,不符合正態(tài)分布或方差不齊時采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。3結果3.1連續(xù)給藥4周的作用與空白組比較,給藥前(即造模2周)、給藥2周及4周時模型組大鼠的自主活動量(爬行格數(shù)、站立次數(shù))顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,給藥2周及4周時,所有受試藥物均表現(xiàn)出顯著增加模型動物爬行格數(shù)和站立次數(shù)的作用(P<0.01),提示藥物能對抗模型動物自主活動的低下。其中,給藥2周時疏肝藥的作用明顯優(yōu)于逍遙散和其余功效拆方(P<0.01);給藥4周時,疏肝藥的作用僅優(yōu)于養(yǎng)血藥和養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01),且逍遙散和疏肝藥+健脾藥的作用也優(yōu)于養(yǎng)血藥及養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01)。見圖1~2。3.2影響cums模型中大鼠糖的消耗3.3影響cums模型大鼠體重的增加3.4出現(xiàn)2個被試藥物p1定位航行測試中,與空白組比較可見模型組動物的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01);與模型組比較,所有藥物組的逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.01)。逍遙散、疏肝藥、疏肝藥+健脾藥三者作用均優(yōu)于養(yǎng)血藥與養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01)。空間探索測試中,與空白組比較,模型組動物的目標象限運動距離百分比與有效區(qū)域進入次數(shù)均顯著降低(P<0.01),提示模型動物空間辨識能力低下;與模型組比較,所有受試藥物對上述指標均能顯著提高(P<0.01);逍遙散、疏肝藥、疏肝藥+健脾藥三者作用均優(yōu)于養(yǎng)血藥與養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01)。見表3。4功效拆方分析本實驗所采用的慢性不可預知溫和應激(CUMS)大鼠模型,是目前國際公認的經(jīng)典抑郁癥模型。其制作方法涉及10類基本應激因子的施加:光照性質(zhì)和晝夜節(jié)律的改變、食水供應的調(diào)整、飼養(yǎng)環(huán)境的變化、短暫足底電擊、冷環(huán)境、熱環(huán)境、噪音干擾、異常氣味、異常物品、強迫游泳。該模型制備的關鍵在于模擬了人類抑郁癥的核心癥狀即快感缺失,造模成功的標志在于反映情緒或情感、神經(jīng)興奮性、學習記憶及認知能力、食欲等水平指標的異常改變。實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠的自主活動能力、糖水偏愛百分比、體重增長度及Morris水迷宮測試指標均弱于正常對照組,提示該模型動物的神經(jīng)興奮性下降、快感缺失、食欲下降及學習記憶、認知能力出現(xiàn)低下表現(xiàn),與抑郁癥患者的臨床癥狀具有一定相似性,表明刺激因子對大鼠的行為能力具有干預作用,可認為造模成功。經(jīng)典古方逍遙散,是臨床治療抑郁癥等神經(jīng)精神疾病和其他功能性疾病的常用方劑,其組方的基本思路立足于“肝郁”這一中心病理環(huán)節(jié)。中醫(yī)理論認為,人的情志活動(即情緒和情感的變化)與肝的功能關系密切。病理狀態(tài)下,情志異常易導致肝氣郁滯,而肝氣不疏則進一步加重情緒、情感的波動,最終影響全身氣機。因此,通過疏發(fā)郁遏之肝氣,加之養(yǎng)血以補肝體助肝用,輔以健脾防止傳變,即可達到調(diào)暢情志、改善周身的作用。本實驗所采用的“功效拆方”分析方法,即建立于該方構成基本思路之上,能體現(xiàn)該方治療抑郁癥的層次性。依據(jù)功效拆方原理,本研究將逍遙散拆分為疏肝藥(柴胡、薄荷)、養(yǎng)血藥(當歸、白芍)、逍遙散去養(yǎng)血藥(即疏肝藥+健脾藥,柴胡、薄荷、白術、茯苓、生姜、炙甘草)、逍遙散去疏肝藥(即養(yǎng)血藥+健脾藥,當歸、白芍、白術、茯苓、生姜、炙甘草)。通過比較逍遙散、疏肝藥、養(yǎng)血藥、逍遙散去養(yǎng)血藥(即疏肝藥+健脾藥)和逍遙散去疏肝藥(即養(yǎng)血藥+健脾藥)對CUMS模型大鼠行為學的影響,發(fā)現(xiàn)連續(xù)給藥4周,所有藥物均能顯著改善CUMS程序所致的大鼠自主活動減少、體重增長緩慢、糖水偏愛百分比降低及空間辨識學習能力的下降,其中逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥的療效分別與養(yǎng)血藥、逍遙散去疏肝藥相比,對上述指標的改善作用均顯著優(yōu)于后兩組,提示逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥3組藥物對模型動物行為學指標的改善作用較為顯著,其次為養(yǎng)血藥和逍遙散去疏肝藥組。逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥組均包含疏肝組分(柴胡、薄荷),而養(yǎng)血藥、逍遙散去疏肝藥組均包含養(yǎng)血組分(當歸、白芍),可以認為體現(xiàn)疏肝治法的柴胡-薄荷藥組是逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥3組藥物發(fā)揮抗抑郁作用的共同組分基礎;而體現(xiàn)養(yǎng)血治法的當歸-白芍藥組是養(yǎng)血藥、逍遙散去疏肝藥兩組藥物抗抑郁療效的共同組分基礎。由于在給藥2周時,疏肝藥對上述行為學指標的改善作用優(yōu)于逍遙散和其余功效拆方,進一步提示,雖然疏肝治法和養(yǎng)血治法均能反映逍遙散用于抑郁癥治療的中醫(yī)思路,但二者可能存在作用機制或途徑上的差異。既往研究提示,單味藥物柴胡有一定的抗抑郁作用,其有效成分屬皂苷類物質(zhì)(如柴胡皂苷A),其作用機制與影響腦內(nèi)5-HT,DA,NA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量,提高GSH-Px,CAT,SOD活力并減少MDA含量等抗氧化作用有關。由此可知,逍遙散中的柴胡可能是全方乃至拆方作用于抑郁癥病變過程的關鍵藥物。本實驗結果與課題組前期進行的逍遙散“君臣佐使”拆方、組方研究工作的結果具有一定的相似性:逍遙散抗抑郁作用的發(fā)揮與柴胡、當歸、白芍3種藥物有關。不同之處在于,本研究從聯(lián)系中醫(yī)臨床治法的角度,基于功效拆方研究模式,通過CUMS大鼠模型初步探討了體現(xiàn)逍遙散抗抑郁作用的2種基本治法———“疏肝”、“養(yǎng)血”的層次性,同時初步驗證了逍遙散治療肝郁證的中醫(yī)理論科學性。但本次實驗僅以動物行為學為觀察目標探究逍遙散及其功效拆方的抗抑郁作用,對逍遙散治法層次性的描述未涉及抗抑郁分子機制層面和藥物有效化學成分,是今后實驗研究中應深入探討的問題。表1所示:與空白組比較,給藥前模型組大鼠糖水消耗量明顯降低(P<0.01),提示模型動物的快感出現(xiàn)缺失。與模型組比較,各藥物組的糖水偏愛百分比均顯著增加(P<0.01)。給藥2周時,疏肝藥組糖水偏愛百分比的提高效應優(yōu)于逍遙散組和其他功效拆方組(P<0.05或P<0.01)