逍遙散及其功效拆方對(duì)cums抑郁模型大鼠行為活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響

逍遙散及其功效拆方對(duì)cums抑郁模型大鼠行為活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響

逍遙散是宋代太平惠民和菊花的配方。它由柴胡、薄荷、當(dāng)歸、白芍和白術(shù)組成。它具有平肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，對(duì)肝氣郁結(jié)、氣血健脾非常有效。臨床應(yīng)用于抑郁癥、胃腸神經(jīng)官能癥和年綜合征。屬于“抑郁綜合征”。臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí),逍遙散具有確切的抗抑郁作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),逍遙散全方及其君藥(柴胡)、臣藥(當(dāng)歸、白芍)對(duì)CUMS模型大鼠和行為絕望模型小鼠表現(xiàn)出較好的抗抑郁作用,而逍遙散去柴胡-當(dāng)歸-白芍藥組的抗抑郁作用不顯著。為進(jìn)一步探討逍遙散的配伍合理性和治法科學(xué)性,本研究通過“功效拆方”的研究模式,觀察逍遙散及其功效拆方對(duì)CUMS模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響,以期初步闡釋逍遙散的治法、配伍特點(diǎn)。1材料表面1.1用藥、構(gòu)成、濃縮組逍遙散組成依照《方劑學(xué)》所載(所含藥物均以60kg成人日用量為準(zhǔn)):柴胡9g,薄荷1.5g,當(dāng)歸9g,白芍9g,白術(shù)9g,茯苓9g,炙甘草4.5g,生姜9g。所用藥物飲片購自成都太極大藥房,經(jīng)本校嚴(yán)鑄云教授鑒定符合2010版藥典要求。各組藥物構(gòu)成如下:全方組(逍遙散)、疏肝藥組(柴胡+薄荷)、養(yǎng)血藥組(當(dāng)歸+白芍)、疏肝藥+健脾藥(柴胡+薄荷+白術(shù)+茯苓+生姜+炙甘草)、養(yǎng)血藥+健脾藥組(當(dāng)歸+白芍+白術(shù)+茯苓+生姜+炙甘草)。各組藥物按組成要求分別取相應(yīng)適量的藥材,以8倍于藥材總量的水浸泡30min,加熱煮沸后文火煎煮60min,趁熱過濾藥液;再加6倍量水,依同法分別煎煮40min和30min;合并3次濾液,60℃條件下減壓濃縮至所需濃度,置4℃冰箱備用。各組藥物劑量均按上述所載成人日用量的30倍進(jìn)行計(jì)算。鹽酸阿米替林,批號(hào)039K1600,Sigma公司,劑量10mg·kg-1。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器Wistar大鼠,SPF級(jí),雄性,體重(200±20)g,四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,合格證號(hào)SCXK(川)2008-24。1.3視頻跟蹤及分析系統(tǒng)RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮公司);MT-visionMorris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技公司);Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)(美國MediaCybernetics,Inc);敞箱(100cm×100cm自制木箱,底部等分100個(gè)10cm×10cm小格)。2方法2.1各組大鼠的造模及給藥方案大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4d后按體重分層隨機(jī)分為8組:空白組、模型組、阿米替林(10mg·kg-1)、逍遙散組(30g·kg-1)、疏肝藥組(5.25g·kg-1)、養(yǎng)血藥組(9g·kg-1)、疏肝藥+健脾藥組(21g·kg-1)、養(yǎng)血藥+健脾藥組(24.75g·kg-1)。除空白組大鼠合籠飼養(yǎng)外,其余各組大鼠均單只單籠飼養(yǎng)。分組后開始造模,從造模第3周開始,受試藥物組大鼠每日灌胃給藥1次,灌胃體積10mL·kg-1體重,空白組和模型組大鼠每日灌胃給予等容積蒸餾水,連續(xù)給藥4周。糖水偏愛試驗(yàn)在造模前及之后的每周固定時(shí)間進(jìn)行,體重測(cè)定在造模前和每周糖水偏愛實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行,自主活動(dòng)測(cè)定在給藥前、給藥2周、給藥4周進(jìn)行,Morris水迷宮測(cè)試在造模第6周開始進(jìn)行。2.2未同時(shí)點(diǎn)刺激因子的確定參考文獻(xiàn)稍作改進(jìn),刺激因子包括以下14種:異物放置、噪音(10dB)+電刺激(1mA)、通宵照明、禁食、冷刺激(4℃)、熱刺激(45℃)、水平震蕩、潮濕墊料、禁水、明暗循環(huán)、異味刺激、合籠、禁食+禁水、鼠籠傾斜(45°)。應(yīng)用DPSv3.01統(tǒng)計(jì)軟件將14種刺激因子隨機(jī)分配到每周7d,每日安排2種刺激,使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。每周每日安排不同,共執(zhí)行6周,空白組不給予任何刺激。2.3大鼠行駛格數(shù)和大/小雙方向輔助觀察參考文獻(xiàn)稍作改進(jìn),將大鼠放入自制敞箱的固定位置,適應(yīng)2min后觀察并記錄隨后4min內(nèi)大鼠的爬行格數(shù)(大鼠雙后肢進(jìn)入下一格記為爬行1格)和站立次數(shù)(大鼠雙前肢抬離箱底記為站立1次)。2.4底糖固定和采集參考文獻(xiàn)稍作改進(jìn),造模前對(duì)大鼠進(jìn)行1次1%糖水偏好訓(xùn)練(大鼠單只放于鼠盒內(nèi),每個(gè)鼠盒放置事先稱重的2個(gè)水瓶:分別裝有純水和1%糖水,喂水1h后撤除)。于CUMS造模程序開始前測(cè)定糖水偏愛百分比基線水平(即第1次測(cè)定,方法同訓(xùn)練),造模開始后于每周固定時(shí)間測(cè)定糖水偏愛百分比。糖水偏好訓(xùn)練和糖水偏愛百分比測(cè)試均于大鼠禁食禁水24h后進(jìn)行。2.5體重測(cè)于造模前和每周糖水偏愛實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行體重稱量并記錄。以大鼠體重增長(zhǎng)度(本周體重-前1周體重)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。2.6逃避刑期實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。于造模第6周開始對(duì)大鼠進(jìn)行定位航行測(cè)試:受試大鼠頭部標(biāo)記苦味酸,依次從4個(gè)象限將大鼠面向池壁輕輕放入池中,測(cè)定120s內(nèi)大鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間(即逃避潛伏期,escapelatency),如120s內(nèi)大鼠不能觸到平臺(tái),則實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái),記錄逃避潛伏期為120s,所有大鼠均在平臺(tái)停留10s,每天1次(含4個(gè)象限,即4輪),連續(xù)4d,以第4天逃避潛伏期代表大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。并在第4天定位航行測(cè)試之后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):撤除平臺(tái),從原平臺(tái)象限對(duì)側(cè)池壁中點(diǎn)將大鼠放入水中,記錄120s內(nèi)大鼠在原平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和距離,以及進(jìn)入原平臺(tái)、原平臺(tái)象限的次數(shù)。以目標(biāo)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)均以u(píng)e0af±s表示,采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性時(shí)采用單因素方差分析,不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1連續(xù)給藥4周的作用與空白組比較,給藥前(即造模2周)、給藥2周及4周時(shí)模型組大鼠的自主活動(dòng)量(爬行格數(shù)、站立次數(shù))顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,給藥2周及4周時(shí),所有受試藥物均表現(xiàn)出顯著增加模型動(dòng)物爬行格數(shù)和站立次數(shù)的作用(P<0.01),提示藥物能對(duì)抗模型動(dòng)物自主活動(dòng)的低下。其中,給藥2周時(shí)疏肝藥的作用明顯優(yōu)于逍遙散和其余功效拆方(P<0.01);給藥4周時(shí),疏肝藥的作用僅優(yōu)于養(yǎng)血藥和養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01),且逍遙散和疏肝藥+健脾藥的作用也優(yōu)于養(yǎng)血藥及養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01)。見圖1~2。3.2影響cums模型中大鼠糖的消耗3.3影響cums模型大鼠體重的增加3.4出現(xiàn)2個(gè)被試藥物p1定位航行測(cè)試中,與空白組比較可見模型組動(dòng)物的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01);與模型組比較,所有藥物組的逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.01)。逍遙散、疏肝藥、疏肝藥+健脾藥三者作用均優(yōu)于養(yǎng)血藥與養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01)。空間探索測(cè)試中,與空白組比較,模型組動(dòng)物的目標(biāo)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比與有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)均顯著降低(P<0.01),提示模型動(dòng)物空間辨識(shí)能力低下;與模型組比較,所有受試藥物對(duì)上述指標(biāo)均能顯著提高(P<0.01);逍遙散、疏肝藥、疏肝藥+健脾藥三者作用均優(yōu)于養(yǎng)血藥與養(yǎng)血藥+健脾藥(P<0.01)。見表3。4功效拆方分析本實(shí)驗(yàn)所采用的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)大鼠模型,是目前國際公認(rèn)的經(jīng)典抑郁癥模型。其制作方法涉及10類基本應(yīng)激因子的施加:光照性質(zhì)和晝夜節(jié)律的改變、食水供應(yīng)的調(diào)整、飼養(yǎng)環(huán)境的變化、短暫足底電擊、冷環(huán)境、熱環(huán)境、噪音干擾、異常氣味、異常物品、強(qiáng)迫游泳。該模型制備的關(guān)鍵在于模擬了人類抑郁癥的核心癥狀即快感缺失,造模成功的標(biāo)志在于反映情緒或情感、神經(jīng)興奮性、學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力、食欲等水平指標(biāo)的異常改變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠的自主活動(dòng)能力、糖水偏愛百分比、體重增長(zhǎng)度及Morris水迷宮測(cè)試指標(biāo)均弱于正常對(duì)照組,提示該模型動(dòng)物的神經(jīng)興奮性下降、快感缺失、食欲下降及學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力出現(xiàn)低下表現(xiàn),與抑郁癥患者的臨床癥狀具有一定相似性,表明刺激因子對(duì)大鼠的行為能力具有干預(yù)作用,可認(rèn)為造模成功。經(jīng)典古方逍遙散,是臨床治療抑郁癥等神經(jīng)精神疾病和其他功能性疾病的常用方劑,其組方的基本思路立足于“肝郁”這一中心病理環(huán)節(jié)。中醫(yī)理論認(rèn)為,人的情志活動(dòng)(即情緒和情感的變化)與肝的功能關(guān)系密切。病理狀態(tài)下,情志異常易導(dǎo)致肝氣郁滯,而肝氣不疏則進(jìn)一步加重情緒、情感的波動(dòng),最終影響全身氣機(jī)。因此,通過疏發(fā)郁遏之肝氣,加之養(yǎng)血以補(bǔ)肝體助肝用,輔以健脾防止傳變,即可達(dá)到調(diào)暢情志、改善周身的作用。本實(shí)驗(yàn)所采用的“功效拆方”分析方法,即建立于該方構(gòu)成基本思路之上,能體現(xiàn)該方治療抑郁癥的層次性。依據(jù)功效拆方原理,本研究將逍遙散拆分為疏肝藥(柴胡、薄荷)、養(yǎng)血藥(當(dāng)歸、白芍)、逍遙散去養(yǎng)血藥(即疏肝藥+健脾藥,柴胡、薄荷、白術(shù)、茯苓、生姜、炙甘草)、逍遙散去疏肝藥(即養(yǎng)血藥+健脾藥,當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、生姜、炙甘草)。通過比較逍遙散、疏肝藥、養(yǎng)血藥、逍遙散去養(yǎng)血藥(即疏肝藥+健脾藥)和逍遙散去疏肝藥(即養(yǎng)血藥+健脾藥)對(duì)CUMS模型大鼠行為學(xué)的影響,發(fā)現(xiàn)連續(xù)給藥4周,所有藥物均能顯著改善CUMS程序所致的大鼠自主活動(dòng)減少、體重增長(zhǎng)緩慢、糖水偏愛百分比降低及空間辨識(shí)學(xué)習(xí)能力的下降,其中逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥的療效分別與養(yǎng)血藥、逍遙散去疏肝藥相比,對(duì)上述指標(biāo)的改善作用均顯著優(yōu)于后兩組,提示逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥3組藥物對(duì)模型動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo)的改善作用較為顯著,其次為養(yǎng)血藥和逍遙散去疏肝藥組。逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥組均包含疏肝組分(柴胡、薄荷),而養(yǎng)血藥、逍遙散去疏肝藥組均包含養(yǎng)血組分(當(dāng)歸、白芍),可以認(rèn)為體現(xiàn)疏肝治法的柴胡-薄荷藥組是逍遙散、疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥3組藥物發(fā)揮抗抑郁作用的共同組分基礎(chǔ);而體現(xiàn)養(yǎng)血治法的當(dāng)歸-白芍藥組是養(yǎng)血藥、逍遙散去疏肝藥兩組藥物抗抑郁療效的共同組分基礎(chǔ)。由于在給藥2周時(shí),疏肝藥對(duì)上述行為學(xué)指標(biāo)的改善作用優(yōu)于逍遙散和其余功效拆方,進(jìn)一步提示,雖然疏肝治法和養(yǎng)血治法均能反映逍遙散用于抑郁癥治療的中醫(yī)思路,但二者可能存在作用機(jī)制或途徑上的差異。既往研究提示,單味藥物柴胡有一定的抗抑郁作用,其有效成分屬皂苷類物質(zhì)(如柴胡皂苷A),其作用機(jī)制與影響腦內(nèi)5-HT,DA,NA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量,提高GSH-Px,CAT,SOD活力并減少M(fèi)DA含量等抗氧化作用有關(guān)。由此可知,逍遙散中的柴胡可能是全方乃至拆方作用于抑郁癥病變過程的關(guān)鍵藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課題組前期進(jìn)行的逍遙散“君臣佐使”拆方、組方研究工作的結(jié)果具有一定的相似性:逍遙散抗抑郁作用的發(fā)揮與柴胡、當(dāng)歸、白芍3種藥物有關(guān)。不同之處在于,本研究從聯(lián)系中醫(yī)臨床治法的角度,基于功效拆方研究模式,通過CUMS大鼠模型初步探討了體現(xiàn)逍遙散抗抑郁作用的2種基本治法———“疏肝”、“養(yǎng)血”的層次性,同時(shí)初步驗(yàn)證了逍遙散治療肝郁證的中醫(yī)理論科學(xué)性。但本次實(shí)驗(yàn)僅以動(dòng)物行為學(xué)為觀察目標(biāo)探究逍遙散及其功效拆方的抗抑郁作用,對(duì)逍遙散治法層次性的描述未涉及抗抑郁分子機(jī)制層面和藥物有效化學(xué)成分,是今后實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)深入探討的問題。表1所示:與空白組比較,給藥前模型組大鼠糖水消耗量明顯降低(P<0.01),提示模型動(dòng)物的快感出現(xiàn)缺失。與模型組比較,各藥物組的糖水偏愛百分比均顯著增加(P<0.01)。給藥2周時(shí),疏肝藥組糖水偏愛百分比的提高效應(yīng)優(yōu)于逍遙散組和其他功效拆方組(P<0.05或P<0.01)