生物化學(xué)課件：第七章 蛋白質(zhì)的分離純化與分析

第七章蛋白質(zhì)的分離純化與分析什么是蛋白質(zhì)的分離純化分離：將蛋白質(zhì)混合物分成單一的蛋白成分。純化：得到單一蛋白的純品。為什么要純化蛋白質(zhì)？研究特定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能（酶、生物活性蛋白，etc）制備抗體蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用怎樣純化蛋白質(zhì)？生化學(xué)家根據(jù)特定蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的性質(zhì)差異，來分離或純化它?？扇苄浴⒌入婞c(diǎn)、分子大小、生物學(xué)性質(zhì)……可溶性：硫酸銨沉淀等電點(diǎn)：離子交換層析分子大?。耗z過濾層析生物學(xué)性質(zhì)：親和層析蛋白質(zhì)純化的基本設(shè)計原則原料應(yīng)易得到，并盡可能富含目的蛋白；應(yīng)有特異性的蛋白質(zhì)檢測方法（最重要的因素，決定了純化能否成功）；分級分離，先粗后細(xì)；純化條件盡量溫和，避免蛋白失活。蛋白質(zhì)的檢測方法蛋白質(zhì)的活性檢測方法：必須快，必須是特異性的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測方法：western-blot，前提是有特異的抗體分離純化的一般程序前處理（取決于采用的材料）動物材料處理：剔除結(jié)締組織和脂肪組織種子處理：去種皮，有機(jī)溶劑脫脂動物細(xì)胞破碎：勻漿器、超聲波處理植物組織：研磨，纖維素酶細(xì)菌破碎：超聲波，溶菌酶如果蛋白質(zhì)定位于某一細(xì)胞器，可用差速離心法將其分離。相對離心力/×g時間/min沉降的組分1

0005真核細(xì)胞4

00010葉綠體、細(xì)胞碎片、細(xì)胞核15

00020線粒體、細(xì)菌30

00030溶酶體、細(xì)菌細(xì)胞碎片100

0003～10h核糖體粗分級分離（rough

fractionation）獲得蛋白質(zhì)提取液后，用一定方法，將蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開來。常用方法：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級分離等特點(diǎn)：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)（包括脫鹽），又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。細(xì)分級分離（fine

fractionation）主要方法：層析：凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析等

蛋白質(zhì)的層析分離層析（chromatography）chrome意為“色彩”，graphy源自希臘文，意為“寫”?！皩游觥本褪恰吧V”。層析最早由俄國植物學(xué)家Цвет于1903年創(chuàng)造，1941年英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge提出分配層析，此后這種方法得到很大的發(fā)展。層析是利用物質(zhì)在固定相與流動相之間不同的分配比例，達(dá)到分離目的的技術(shù)。固定相：固定相是層析的基質(zhì)。通常是固體（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。

紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用；柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。怎樣純化蛋白質(zhì)？生化學(xué)家根據(jù)特定蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的性質(zhì)差異，來分離或純化它。可溶性、等電點(diǎn)、分子大小、生物學(xué)性質(zhì)……可溶性：硫酸銨沉淀等電點(diǎn)：離子交換層析分子大?。耗z過濾層析生物學(xué)性質(zhì)：親和層析1.離子交換層析離子交換層析利用物質(zhì)的電荷與層析載體（離子交換劑）電荷之間的相互作用而達(dá)到分離純化的目的，屬于吸附層析。離子交換層析的固定相稱為離子交換劑，由基質(zhì)和基團(tuán)兩部分組成。基質(zhì)：纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二乙烯苯等高分子聚合物；基團(tuán)：共價結(jié)合在基質(zhì)上的帶電基團(tuán)，可分為正電基團(tuán)和負(fù)電基團(tuán)。Ion-ExchangechromatographyIfpHmobilephase=7.2

Thenchargeoftheproteins:(-)(-)(+)(+)--++++++++------++++++++++++Anionexchangecolumn=+chargedIncreasedsaltconcentrationIon-Exchangechromatography--+++++++--Na+Na+Na+Na+Na+Na+++++++Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-++++++------Na+Na+Na+基本操作過程樣品制備，裝柱與平衡上樣（樣品溶解于A液中）洗脫：穿透峰，洗脫峰收集、鑒定離子交換層析有兩種洗脫方式分步洗脫：用間斷地遞增的不同離子強(qiáng)度的流動相分次洗脫樣品蛋白的方法；梯度洗脫：連續(xù)改變流動相離子強(qiáng)度的方法。目前隨著層析的自動化，梯度洗脫成為大多數(shù)情況下的首選方案。分步洗脫梯度洗脫2.凝膠過濾層析利用分子量不同的蛋白質(zhì)，通過凝膠分子篩時速度不同來分離蛋白質(zhì)的方法。固定相：凝膠顆粒（gel

bead），多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔決定了凝膠的分級分離范圍，即能被該凝膠分離的蛋白質(zhì)混合物的Mr范圍，如SephadexG-50的分離范圍是1500～30000。常用的凝膠有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。Size-exclusionchromatographySize-exclusionchromatographyAbsorbanceat280isusedtoidentifyprotein-containingfractions.Youcanalsoperformanenzymespecificassay.要根據(jù)待分離物質(zhì)的分子量，選擇特定的凝膠過濾基質(zhì)；凝膠過濾層析不僅可用于親水性分子的分離，也可用于疏水性分子的分離，當(dāng)用于疏水性分子分離時，該類層析往往被稱為“凝膠通透層析”；凝膠過濾層析可提供樣品的分子量信息；凝膠過濾的上樣量一般在柱床體積的1～5％；凝膠過濾的樣品濃度越大越好，但一般不要超過100mg/ml。凝膠過濾的注意事項3.親和層析以樣品的生物活性為依據(jù)的分離方法。生物分子的特點(diǎn)是有專一的活性，如酶與底物的結(jié)合，抗原與抗體，激素與受體，糖與凝集素……等。將上述作用體系的一方連接到層析基質(zhì)上，使之固定化，就有可能分離純化專一作用的另一方。AffinitychromatographyMakesuseofspecificbindinginteractionsbetweenmolecules1-Incubatecrudesamplewiththeimmobilizedligand

2-Washawaynonboundsamplecomponentsfromsolidsupport3-EluteCommonlyusedaffinitycolumns:Ni2+

bindstopolyHistines(example6xHis)Specificantibodies(anti-Flagtag)glutathionebindstoGSTProteinAorGbindsantibodiesAffinitychromatography谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶親和層析Possibleelutionstrategies:pHIonstrenghDenatureCompetitorligandoranalogAffinitychromatographyNi-NTAcolumnsThehighaffinityoftheNi-NTAresinsfor6xHis-taggedproteinsorpeptidesisdueto:1-thestrengthwithwhichtheseionsareheldtotheNTAresinNTAhasatetradentatechelatinggroupthatoccupiesfourofsixsitesinthenickelcoordinationsphere2-thespecificityoftheinteractionbetweenhistidineresiduesandimmobilizednickelions在各種表達(dá)載體上都帶有各種標(biāo)簽蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它們不僅可用于鑒定蛋白表達(dá)與否，更可用于與之相連的目標(biāo)蛋白的純化；通過免疫親和層析技術(shù)，只需一步，即可純化帶有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白。親和層析是基因工程中最常用的純化技術(shù)高效與簡便：一旦固定化配體制備好后，操作使用非常方便；親和層析是高度濃縮的過程；可從樣品中去除大量雜質(zhì)；可在活性物質(zhì)中去除理化性質(zhì)幾乎完全相同的但已失活的那些“雜質(zhì)”。親和層析的優(yōu)點(diǎn)免疫親和層析：將蛋白質(zhì)抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原蛋白的純化；凝集素親和層析：凝集素是一大類能專一性和糖類和糖復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，固定化凝集素可用于糖蛋白純化；染料親和層析：有多種染料可與各種類型的酶結(jié)合，又不受酶的作用，可用于多種蛋白的分離。親和層析中的三大通用技術(shù)染料親和色譜介質(zhì)的制備配基性質(zhì)、染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素。以下途徑可以實(shí)現(xiàn)制備：采用瓊脂糖凝膠，染料連接在-OH上，該過程可在一定條件下直接完成。染料也可通過活性基團(tuán)和基質(zhì)偶聯(lián)，該方法可引入高密度的染料。吸附蛋白質(zhì)量增多選擇親和作用力較小的染料有利于解吸4.疏水層析與反向?qū)游龅鞍踪|(zhì)具有親水與疏水兩重性，如果在層析基質(zhì)上接上疏水的基團(tuán)，就能在一定條件下與某些蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)相互作用，使之吸附，而達(dá)到分離純化的目的。一般情況下，是高鹽吸附（1～2M硫酸銨），降低流動相的鹽濃度，使樣品洗脫。疏水層析的機(jī)制與離子交換層析正好相反，因此兩者是互補(bǔ)的。反向?qū)游觯蚍Q反相色譜，reverse

phase

chromatography。當(dāng)反相色譜用于蛋白質(zhì)分離時，其原理與疏水層析基本相同，區(qū)別在于：疏水層析的配基疏水性較弱（苯基等），所以高鹽吸附，低鹽洗脫；反相色譜配基疏水性強(qiáng)（C18等），所以需要使用有機(jī)溶劑洗脫。反向?qū)游雠c疏水層析原理相同根據(jù)流動相和固定相相對極性不同，液相色譜分為正相色譜和反相色譜。流動相極性大于固定相極性的情況，稱為反相色譜。非極性鍵合相色譜可作反相色譜。在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最廣泛，現(xiàn)代液相色譜分析工作的70%以上是在非極性鍵合固定相上進(jìn)行的。反相色譜分離蛋白質(zhì)的原理反相色譜是最高效的蛋白質(zhì)層析技術(shù)之一2.

蛋白質(zhì)的電泳分離電泳（electrophoresis）帶電粒子在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH溶液中帶不同電荷，在直流電場中能夠泳動。電泳基本原理蛋白質(zhì)在電場中泳動時，受到兩種方向相反的力的作用：電場力F＝qE，q為帶電量，E為電場強(qiáng)度摩擦力Ff＝fv，f為摩擦系數(shù)，v為遷移速度當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)以恒速運(yùn)動時，F(xiàn)－Ff＝0，即qE＝fv，此時：v/E＝q/f＝q/6

r

在一定介質(zhì)中，蛋白質(zhì)的q/f是一個定值，因此v/E也是定值，它被稱為電泳遷移率，即：

＝v/E

可通過實(shí)驗(yàn)測定，蛋白質(zhì)的

值為0.1×10-4

～1.0×10-4

cm2·V-1·s-1，它是蛋白質(zhì)的特性之一。電泳的分類自由電泳（移動界面電泳）區(qū)帶電泳：在支持物上，蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶。穩(wěn)態(tài)電泳：蛋白質(zhì)遷移一段時間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，帶的寬度不再隨時間而改變。1.聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（bis）經(jīng)共聚合而成，此過程在TEMED和過硫酸銨催化下進(jìn)行。Acr在AP和TEMED的作用下形成單鏈，隨后通過bis的作用交叉互聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合成凝膠。凝膠的孔徑可在較寬范圍內(nèi)變化，以迎合不同的分離需要。根據(jù)凝膠的均勻性（孔徑、pH）可分為連續(xù)與不連續(xù)兩類；根據(jù)是否加蛋白質(zhì)變性劑，可分為變性與非變性兩類；根據(jù)是否加還原劑2-巰基乙醇或DTT，可分為還原與非還原兩類；還可根據(jù)電泳裝置的不同，分為圓盤電泳和平板電泳。PAGE的分類平板PAGE不連續(xù)平板PAGE，是使用最廣泛的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)，它由濃縮膠與分離膠兩部分組成。不連續(xù)PAGE有很高的分辨力，因?yàn)樗幸韵氯N效應(yīng)：濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)不連續(xù)PAGE制備凝膠樣品電泳目的蛋白檢測基本操作染色法：考馬斯亮藍(lán)染色法（多種類型可選）、銀染法；活性檢測法：適用于NativePAGE，其中蛋白質(zhì)保持天然活性，可用酶學(xué)方法檢測；免疫印跡法：用特異性抗體檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。PAGE的檢測方法多種多樣2.等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離的一種技術(shù)?；驹恚豪脙尚噪娊赓|(zhì)載體形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，使pH從正極到負(fù)極逐漸增加。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH位置帶電，因此在電場中可以移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到pH等于pI位點(diǎn)，其靜電荷為0，在電場中不再移動，據(jù)此可將不同pI的蛋白質(zhì)分離。優(yōu)點(diǎn)樣品加樣位置和體積不受限制；分辨率高于其它類型電泳；可測定pI值；缺點(diǎn)樣品在pI區(qū)域易沉淀，為增加樣品溶解度，可以在膠中加入尿素，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活；樣品前處理麻煩。等電聚焦的優(yōu)缺點(diǎn)3.雙向電泳將等電聚焦技術(shù)與SDS技術(shù)組合起來的新技術(shù)，是目前分離蛋白質(zhì)混合物最強(qiáng)大的技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)?；静襟E：第一相等電聚焦后，在等電聚焦的垂直的方向進(jìn)行第二相SDS。pH3------10（1）

IEF等電聚焦電泳（2）SDS（3）染色脫色考馬斯亮藍(lán)銀染可綜合利用層析和電泳分離純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的濃縮超濾法使用特制薄膜對溶液中的溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的技術(shù)。常用離心力使蛋白質(zhì)透過濾膜，而使蛋白質(zhì)截留在膜內(nèi)。冷凍干燥法在冷凍狀態(tài)下使樣品中水分升華而濃縮蛋白質(zhì)的技術(shù)，保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的最好方法。注意：必須保證蛋白質(zhì)始終處于冷凍狀態(tài)（在－70℃冰箱預(yù)冷），為提高溶解度可加賦形劑（右旋糖酐、甘露醇等）。吸收法采用吸水劑直接吸去蛋白質(zhì)溶液中的水。PEG、蔗糖、凝膠干粉等。沉淀法硫酸銨、PEG、有機(jī)溶劑沉淀；免疫沉淀。3.

蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定目前蛋白質(zhì)的直接定量分析技術(shù)只能測定樣品的總蛋白含量；目前沒有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考馬斯亮藍(lán)）、BCA法、紫外分光光度法等。1.Lowry法1951年Lowry在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎(chǔ)上建立原理：第一步反應(yīng)：在堿性溶液中蛋白與Cu2+反應(yīng)形成紫紅色的絡(luò)合物；第二步反應(yīng)：酚試劑（磷鉬酸和磷鎢酸混合液）與蛋白質(zhì)芳香族氨基酸反應(yīng)呈深藍(lán)色。優(yōu)點(diǎn)：同時分析多個樣品，簡便；靈敏度提高；避免酚試劑局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白質(zhì)含量測定偏差。缺點(diǎn)：要求溶液完全溶解透明；酚試劑在堿性溶液中穩(wěn)定性差，導(dǎo)致測定誤差；反應(yīng)受多種物質(zhì)干擾。2.Bradford法由Bradford等人于1976年建立。基本原理：考馬斯亮藍(lán)G-250在一定條件下可與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致其顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收峰從465nm移至595nm，其吸收度與蛋白質(zhì)濃度成正比。目前絕大多數(shù)公司都提供基于此原理的蛋白質(zhì)定量試劑盒。優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，配合酶標(biāo)儀，可同時測定多個樣品；可測定低達(dá)25

g/ml的蛋白質(zhì)樣品；對干擾劑不敏感；缺點(diǎn)：染料主要結(jié)合蛋白質(zhì)的疏水區(qū)，因此不同組成的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合比例不同。3.BCA法原理：第一步，在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)形成復(fù)合物；第二步，BCA試劑與該復(fù)合物反應(yīng)，生成深紫色化合物，在562nm處有吸收峰。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，線性范圍20～2000

g/ml；有試劑盒出售。2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉4.紫外分光光度法原理：蛋白質(zhì)中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽鍵在215nm附近有特異吸收。可通過測定該波長的光吸收度，計算蛋白質(zhì)濃度。C＝A/KL，其中A為吸光度，K為摩爾消光系數(shù)，L為光程。K值可通過各種方法得到（包括軟件分析等）。優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，且敏感度高（20

g/ml）；樣品不損失，測定后可繼續(xù)使用。缺點(diǎn)：核酸可干擾測定結(jié)果；不同蛋白質(zhì)芳香族氨基酸含量變動較大。5.

凱氏定氮法1883年，丹麥化學(xué)家Kjeldahl建立，基于蛋白質(zhì)的含氮量在16%左右。蛋白質(zhì)+硫酸→CO2+H2O+NH3→硫酸銨+強(qiáng)堿→氨優(yōu)點(diǎn)：適用樣品廣泛，結(jié)果可靠缺點(diǎn)：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值；蛋白質(zhì)氨基酸有偏差時（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。4.

蛋白質(zhì)分子量的測定1.SDS測定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS）和蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶的負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。

＝q/f＝q/6

r

，所有蛋白質(zhì)的遷移率都相同。在SDS中遷移的蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率的關(guān)系符合下述公式：lg

Mr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr為蛋白質(zhì)相對分子量，K、K1為常數(shù)，b為斜率，m為遷移率。注意：此公式也適用于核酸在瓊脂糖凝膠中的遷移在半對數(shù)坐標(biāo)紙上做出標(biāo)準(zhǔn)曲線注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率會根據(jù)所用凝膠濃度而發(fā)生微小的改變。2.凝膠過濾層析法測定分子量蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示：lg

Mr＝K1－K2

Ve在實(shí)驗(yàn)中，只要測得幾種蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的Ve，并以它們的lg

Mr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。SDS與凝膠過濾法是互補(bǔ)的凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時，SDS可測得蛋白質(zhì)每條多肽鏈的分子量。綜合應(yīng)用這兩種方法，可得到待測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息。例如：凝膠過濾法得到的蛋白質(zhì)分子量：180kDSDS（不加還原劑）結(jié)果：45kDSDS（加還原劑）結(jié)果：兩條蛋白帶（15kD和30kD）則結(jié)論是：該蛋白質(zhì)由4個相同的亞基組成，每個亞基由兩條多肽鏈經(jīng)二硫鍵連接而成，兩