多肽合成技術(shù)

多肽合成技術(shù)多肽化學(xué)已經(jīng)走過了一百數(shù)年的光輝歷程，19，EmilFischer首先開始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時在多肽合成方面的知識太少，進(jìn)展也相稱緩慢當(dāng)時合成采用了苯甲酰，乙酰保護(hù)，脫去相稱困難，并且容易造成肽鏈斷裂。直到1932年，MaxBergmann等人開始使用芐氧羰基（Z）來保護(hù)α-氨基，該保護(hù)基能夠在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動了有機(jī)化學(xué)家們對多肽合成辦法以及保護(hù)基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐富，人們合成了大量的生物活性多肽，涉及催產(chǎn)素（oxytocin），胰島素等，同時在多肽合成辦法以及氨基酸保護(hù)基上面也獲得了不少成績，這為后來的固相合成辦法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也就是這個階段，F(xiàn)redSanger發(fā)明了氨基酸序列測定辦法，并為此獲得了1958年的Nobel化學(xué)獎。還是他后來發(fā)明了DNA序列檢測辦法，并于1980年再次獲得了Nobel化學(xué)獎，成為到現(xiàn)在為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成辦法（SPPS），這個在多肽化學(xué)上含有里程碑意義的合成辦法，一出來，就由于其合成方便，快速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選辦法，隨即的發(fā)展也證明了該辦法不僅僅是一種合成辦法，并且也帶來了有機(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科，固相有機(jī)合成（SPOS）。固然，Merrifield也因此榮獲了1984年的Nobel化學(xué)獎。也正是Merrifield，他通過了重復(fù)的篩選，最后屏棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（BOC）用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，其能夠在酸性條件下定量的脫除，反映也非?？焖?，在30min就能夠反映完全。由于叔丁氧羰基（BOC）辦法中，氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)大多基于芐基（Bzl），因此也稱為BOC-Bzl方略。同時，Merrifield在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了第一臺全自動多肽合成儀，并初次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個氨基酸）。隨即的多肽化學(xué)研究重要集中在固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究。1972，LouCarpino首先將9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下能夠快速脫除，10min就能夠反映完全，并且由于其反映條件溫和，快速得到廣泛使用，到了20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成為了固相多肽合成中的首選合成辦法。該辦法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（But），因此，也稱為FMOC-But方略。同時，在多肽合成樹脂，縮合試劑以及氨基酸保護(hù)，涉及合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也獲得了豐碩的成果。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)一步，對于多肽化學(xué)的規(guī)定不僅僅是合成辦法，而更多的集中在多肽標(biāo)記與修飾辦法，以及蛋白構(gòu)造與功效模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。多肽化學(xué)合成的基本介紹多肽化學(xué)合成辦法，涉及液相和固相兩種辦法。液相合成辦法現(xiàn)在重要采用BOC和Z兩種保護(hù)辦法，現(xiàn)在重要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對與固相合成，含有保護(hù)基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較，液相合成重要缺點(diǎn)是，合成范疇小，普通都集中在10個氨基酸以內(nèi)的多肽合成，尚有合成中需要對中間體進(jìn)行提純，時間長，工作量大。固相合成辦法現(xiàn)在重要采用FMOC和BOC兩種辦法，它含有合成方便，快速，容易實(shí)現(xiàn)自動化，并且能夠比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽。

1.1．氨基酸保護(hù)基

20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈能夠分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常核心，直接決定了合成能夠成功的核心。由于常見的20中氨基酸中有諸多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，普通規(guī)定，這些保護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定，無副反映，合成結(jié)束后能夠完全定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸涉及：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也能夠不保護(hù)，由于吲哚性質(zhì)比較穩(wěn)定。固然在特殊的狀況下，有些氨基酸也能夠不保護(hù)，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。

表1常見3種氨基脫除條件TFAHBr/TFAH2/Pd-CPiperidine/DMFBocyynnZnyynFmocnyny

圖1常見3種氨基保護(hù)基構(gòu)造

氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多，同一種側(cè)鏈有多個不同的保護(hù)基，能夠在不同的條件下選擇性的脫除，這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上含有很重要的意義。并且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成辦法有親密的關(guān)系，液相和固相不同，固相中BOC和FMOC方略也不同，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn)用與搭配。有關(guān)側(cè)鏈保護(hù)基的使用，請參考王德心的《固相有機(jī)合成——原理及應(yīng)用指南》第四章，我們這里重要介紹Cys，Lys，Asp的幾個保護(hù)基及其脫除辦法。Cys最常見的保護(hù)基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個保護(hù)基能夠完畢多對二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護(hù)基有：Boc，F(xiàn)moc，Trt，Dde，Allyl，這對于固相合成環(huán)肽提供了諸多正交的保護(hù)方略。Asp最常見的保護(hù)基有：Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多個正交的保護(hù)方略。

表2巰基常見保護(hù)基

簡稱構(gòu)造脫除條件TrtTFA，HCl/HOAc，I2/MeOHAcmI2/MeOH，Hg2+MobHF，TFMSA，Hg2+表3氨基常見保護(hù)基

簡稱構(gòu)造脫除條件TrtTFA，HOAc，HCOOHBocHCl/HOAc，TFA/DCMFmocPip/DMF，NaOH/MeOHDdeH2NNH2/DMFAllylPd（Ph3P）4，嗎啉/THF表3羧基常見保護(hù)基

簡稱構(gòu)造脫除條件OtbuTFA，HOAc，HCOOHOBzlH2/Pd，HF，TFMSAOMeNaOH/MeOHOAllPd（Ph3P）4，嗎啉/THFOFmPip/DMF，DBU/DMF1.2．多肽縮合試劑

現(xiàn)在多肽合成中，重要采用羧基活化辦法來完畢接肽反映，最早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱酸酐以及混合酸酐的辦法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反映試劑危險以及制備比較復(fù)雜，逐步被后來的縮合試劑取代，按照其構(gòu)造能夠分為兩種：縮合試劑重要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。

重要涉及：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反映，由于反映中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，因此普通不用在固相合成中，但是由于其價格便宜，在液相合成中，能夠通過過濾除去，應(yīng)用仍然相稱廣泛。EDC.HCl由于其水溶解性的特點(diǎn)，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，并且也相稱成功。但是該類型的縮合試劑的一種最大的缺點(diǎn)，就是如果單獨(dú)使用，會有比較多的副反映，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑，能夠?qū)⑵涓狈从晨刂圃诤艿偷姆懂?。其反映機(jī)理以下：

圖2DIC活化反映機(jī)理

鎓鹽型縮合試劑反映活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，重要涉及：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機(jī)堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才干活化氨基酸。其反映機(jī)理以下：

圖3TBTU活化反映機(jī)理

1.3．多肽合成辦法比較

液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上含有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，并且由于是在均相中進(jìn)行反映，能夠選擇的反映條件更加豐富，象某些催化氫化，堿性水解等條件，都能夠使用，這在固相中，使用卻由于反映效率低，以及副反映等因素，無法應(yīng)用。液相多肽合成中重要采用BOC和Z兩種反映方略。

圖4液相合成Glu-Trp

圖5FMOC固相合成Glu-Trp

固相多肽合成現(xiàn)在使用的重要有兩種方略：BOC和FMOC兩種。BOC辦法合成過程中，需要重復(fù)使用TFA脫BOC，并且在最后從樹脂上切割下來需要使用HF，由于HF必須使用專門的儀器進(jìn)行操作，并且切割過程中容易產(chǎn)生副反映，因此現(xiàn)在使用受到實(shí)驗(yàn)條件限制，使用也逐步減少。FMOC辦法反映條件溫和，在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就能夠進(jìn)行合成，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng)用。

固相合成中樹脂，普通都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交聯(lián)度在1-2%之間，現(xiàn)在使用的大多是1%，由于這種交聯(lián)度下，樹脂在DMF，DCM中含有較好的溶脹性能，立體上是一種空間網(wǎng)狀構(gòu)造，反映物分子能夠在樹脂內(nèi)部自由移動。樹脂中最核心的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上，一端作為反映位點(diǎn)?，F(xiàn)在廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC方略中，由于其對酸非常穩(wěn)定，需要在HF，TFMSA等強(qiáng)酸條件下才干夠切割下來。

圖6固相合成慣用樹脂

固相多肽合成中，重要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測辦法稱為Kaiser辦法，其檢測成果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。

Kaiser試劑涉及：

A，6%茚三酮的乙醇溶液

B，80%苯酚的乙醇溶液

C，2%0.001MKCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要通過茚三酮解決后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明尚有游離氨基，否則闡明連接完全。

尚有其它檢測游離氨基的辦法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。

圖7茚三酮檢測原理

固相合成完畢之后，必須選擇適宜的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然后通過冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，通過HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時候，選擇的切割辦法也不完全相似，普通都是選擇酸性條件下切割的條件，對于PAM，MBHA樹脂，普通采用HF切割，切割過程中需要添加對甲苯酚，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對于Wang，Rink-Amide，Trt樹脂，普通采用TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。這些添加試劑重要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反映過程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對部分氨基酸側(cè)鏈的攻打造成的副反映，比較容易產(chǎn)生副反映的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量普通10-15ml/g樹脂。慣用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反映普通是在室溫條件下2h-4h。

多肽合成過程中，部分氨基酸在活化的過程中會造成不同程度的消旋，特別容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，固然這些消旋化還和溶劑，溫度以及合成中的有機(jī)堿等因素有關(guān)。對于這些氨基酸，能夠通過采用高效縮合試劑，減少反映時間，能夠減少消旋的比例，普通條件選擇適宜，消旋化都能夠控制在5%以內(nèi)。消旋反映機(jī)理以下：

圖8消旋反映機(jī)理

DKP副反映出現(xiàn)在FMOC-Wang樹脂合成過程中，重要出現(xiàn)在第一種氨基酸為Pro的時候，當(dāng)?shù)诙€氨基酸脫FMOC的時候，α-氨基被游離出來之后，立刻對Wang樹脂的芐酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)胺解，生成六元環(huán)二酮哌嗪衍生物，同時從Wang樹脂上釋放出來，造成反映終止。該反映非?？焖?，文獻(xiàn)報道采用50%Pip/DMF，脫1min，4min的條件，但是我們實(shí)驗(yàn)證明在多數(shù)狀況下，即使是1min左右反映就超出了20%。因此普通在末端第一種氨基酸為Pro的時候，建議采用2-Cl-Trt樹脂合成，由于該樹脂巨大的空間阻力，能夠完全消除該副反映。這個副反映在BOC方略合成過程中，卻能夠完全避免，由于BOC在使用TFA脫除后，使氨基以TFA鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能攻打芐酯鍵。

圖9DKP反映機(jī)理

固相多肽合成中也經(jīng)常碰到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面的重要因素是由于多肽序列引發(fā)的，由于有些多肽序列在樹脂上形成β-折疊，變化了樹脂的溶脹性能，尚有可能將反映的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里面，這樣使得反映很難進(jìn)行，現(xiàn)在報道使用的重要辦法有：使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N胍啶/DMF溶液提高反映溫度，或采用微波辦法使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。使用溶脹性能更加好的PEG-PS樹脂，同時減少樹脂擔(dān)載量（0.05-0.2mmol/g）1.4．合成多肽分析鑒定辦法

多肽的分析鑒定辦法有多肽一級構(gòu)造，二級構(gòu)造鑒定，多肽一級構(gòu)造涉及：質(zhì)譜分析，氨基酸構(gòu)成分析，氨基酸序列分析。二級構(gòu)造涉及：圓二色譜（CD），NMR，X-衍射等辦法。

多肽的純度分析，普通都采用HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動相：A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脫梯度，5%B--65%B，時間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在C18上保存很弱，需要變化條件，這里重要有兩種辦法：一種變化分析梯度，能夠?qū)⑵鹗继荻雀臑?%，等度或小梯度洗脫；另外一種辦法是在流動相中加入強(qiáng)離子對試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。

質(zhì)譜分析的目的重要是確證分子量，固然采用MS/MS能夠部分的理解多肽序列的信息，但是這個需要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析才干比較精確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，需要采用軟電離技術(shù)，現(xiàn)在多肽分析重要使用了電噴霧（ESI-MS），基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS普通會給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數(shù)目有關(guān)，因此，經(jīng)常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。MALDI-MS能夠分析蛋白大分子，并且普通狀況下極少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)直接對應(yīng)了分子離子峰，容易分析。另外，普通在分析長肽或蛋白過程中，需要添加NH4，Na，K等離子，提高敏捷度，因此普通在MS中出現(xiàn)一組峰，分別對應(yīng)：（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。

氨基酸構(gòu)成分析普通需要產(chǎn)品的純度較高，它能夠給出多肽中氨基酸的種類，數(shù)目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110℃，用6M鹽酸水解16至72小時。酸水解即使很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，由于天冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也能夠?qū)⑻於０忿D(zhuǎn)換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸取光譜預(yù)計的，也能夠通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精確測定，要精確測量需要在蛋白質(zhì)水解之邁進(jìn)行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才干定量。

氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，重要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的堿性條件下對蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行解決，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反映，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸解決，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機(jī)溶劑（例如氯丁烷）從反映液中萃取出來，而去掉了一種N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一種穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一種氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反映過程，整個測序過程現(xiàn)在都是通過測序儀自動進(jìn)行。

圓二色譜是一種特殊的吸取譜，它通過測量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光譜，從而得到生物大分子的二級構(gòu)造，簡樸、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段（190-240nm），重要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長范疇的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。α-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處呈負(fù)峰，在190nm附近有一正峰。β-折疊構(gòu)象的CD譜，在217-218nm處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜在198nm附近有一負(fù)峰，在220nm附近有一小而寬的正峰。

隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計算機(jī)解決技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐步成為大分子構(gòu)造物質(zhì)分析的重要辦法之一。NMR可用于擬定氨基酸序列、分布以及構(gòu)象。現(xiàn)在，NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的，分析成果快速精確。

X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的直接信息，并且能夠判斷相對與絕對構(gòu)型。多肽標(biāo)記及修飾現(xiàn)在多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應(yīng)用在多肽藥品，多肽生物學(xué)，多肽抗體以及多肽試劑的研究中?，F(xiàn)在應(yīng)用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記（C13，H2），熒光標(biāo)記（FAM，F(xiàn)ITC），生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。

2.1．非放射性核素標(biāo)記

現(xiàn)在在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，由于其使用安全，放射性小。現(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸，能夠按照正常的多肽合成辦法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到多肽上。

2.2．熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡樸。因此，現(xiàn)在在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，熒光標(biāo)記辦法與熒光試劑的構(gòu)造有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的辦法與接肽反映相似，也采用HBTU/HOBt/DIEA辦法連接。但是對于FITC標(biāo)記，需要在連接FITC前，增加一種氨基己酸，避免在切割的過程中被TFA切割掉。

2.3．生物素標(biāo)記

生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到快速發(fā)展的一種新型生物反映放大系統(tǒng)。由于它含有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使多個示蹤免疫分析的特異性和敏捷度進(jìn)一步提高。重要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最慣用，固然，也能夠直接使用生物素也能夠標(biāo)記，由于其構(gòu)造上有個游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA辦法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。

2.4．磷酸肽合成

磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。現(xiàn)在磷酸肽合成普通都采用磷酸化氨基酸，現(xiàn)在使用的都是單芐基磷酸化氨基酸，Tyr也能夠直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接普通采用HBTU/HOBt/DIEA辦法，但是現(xiàn)在采用該辦法合成磷酸化也有缺點(diǎn)，特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化辦法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對于Tyr，Thr能夠直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反映，而Ser能夠采用Fmoc-Ser（trt），在1%TFA/DCM條件下能夠定量的脫除。后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨即在過氧酸下氧化生成磷?；?，完畢反映。蛋白構(gòu)造與功效模擬多肽多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功效的時候，總是先折疊出某些特殊的構(gòu)造，多肽類似物合成重要是為了模擬這些構(gòu)造，保持或提高生物活性，同時也為了變化多肽的穩(wěn)定性，提高其抗酶解能力。

3.1．α-螺旋多肽

α-螺旋是蛋白構(gòu)造中最為普通的一種，但是普通多肽在溶液中大多是無規(guī)卷曲的，現(xiàn)在使用最多的辦法是多肽保持α-螺旋構(gòu)造就是在多肽表面通過共價鍵將處在α-螺旋構(gòu)造的兩個氨基酸連接起來，選擇的位點(diǎn)（i，i+4或i，i+7），選擇的化學(xué)鍵涉及：二硫鍵，硫醚鍵，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM）等辦法。

二硫鍵廣泛存在與蛋白構(gòu)造中，對穩(wěn)定蛋白構(gòu)造含有非常重要的意義，二硫鍵普通是通過序列中的2個Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的辦法諸多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程，能夠通過Ellman檢測以及HPLC檢測辦法對其反映進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測。

硫醚鍵的形成能夠通過序列中的Lys，將溴乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上，運(yùn)用其和巰基的特異性反映，反映在緩沖溶液中進(jìn)行，快速高效。

多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成普通是運(yùn)用Lys，Asp（Glu）的選擇性保護(hù)，在固相上直接環(huán)化。