不同提取方法提取菊花總糖的比較研究

不同提取方法提取菊花總糖的比較研究

氨基化合物是自然界最常見的有機(jī)化合物。它不僅是植物組織的主要成分，也是人類和動物最重要的食物來源。與沉積物、蛋白質(zhì)和養(yǎng)分一起形成生命的分子基礎(chǔ)。多糖作為一種“生物應(yīng)答效應(yīng)物”,具有非常重要的生理活性。菊花多糖自古就可作為一種中草藥,被用來防治感冒、菌痢、腸炎、便秘、冠心病、高血壓等多種疾病,現(xiàn)代藥理研究表明菊花多糖是一種良好的氧自由基清除劑,具有良好的預(yù)防保健作用。常用的菊花多糖的提取方法多采用熱水提取法,張桂青等討論了常規(guī)條件下熱水浸提菊花多糖的最佳工藝條件。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展,超聲波和微波技術(shù)的應(yīng)用也逐漸滲透到植物有效成分的提取領(lǐng)域。超聲波法提取糖類化合物的主要原理是由于超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)能產(chǎn)生強(qiáng)大的沖擊波,促使細(xì)胞內(nèi)含物釋放到溶劑中,從而加速了細(xì)胞內(nèi)多糖的萃取過程。微波提取的作用原理是利用空間電場和磁場的高頻振蕩,加速被提取組分向提取溶劑界面的擴(kuò)散速率,從而提高提取效率。張海艷等采用微波提取海帶多糖,提高了提取率,降低了成本。唐娟等研究了超聲波協(xié)同纖維素酶提取黑木耳多糖的方法,得出了超聲波提取木耳多糖的最佳工藝。但將超聲波和微波應(yīng)用于菊花總糖提取的研究較少,我們在前人研究的基礎(chǔ)上,運(yùn)用超聲波、微波、常規(guī)熱水提取3種手段,并采取不同的工藝組合方法,提取菊花總糖。通過比較其得率大小,建立了菊花總糖的最佳提取工藝,為菊花糖類化合物的進(jìn)一步純化和精制打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實驗原材料菊花,購自北京林業(yè)大學(xué)科技有限公司。將菊花烘干、粉碎,作為菊花總糖提取實驗材料。1.2主試劑濃硫酸、苯酚、葡萄糖、α-萘酚、氫氧化鈉、硫酸銅,酒石酸鉀鈉,所用試劑均為分析純。1.3超聲波發(fā)生器和循環(huán)水生物污染721可見分光光度計(上海第三分析儀器廠);WP700(MS-2089T)微波爐(樂金電子(天津)電器有限公司);KQ-500B超聲波發(fā)生器(江蘇省昆山市電山湖鎮(zhèn));AR2140分析天平(美國Ohaus公司);SHB-循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);800B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。1.4菊花總糖提取菊花總糖粗提液的制備:稱取粉碎的菊花干粉15份(分為5組,每組3份,每份5g)作為提取樣品。分別用熱水提取法、超聲波法、微波法、超聲波預(yù)處理-熱水提取法和超聲波-微波聯(lián)用法提取菊花總糖。將每份總糖粗提液分別離心,抽濾,濃縮至60mL備用。1.5測定了菊花總糖含量1.5.1濃硫酸溶液的制備精確稱取干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖5mg,置于100mL容量瓶中,定容,搖勻。準(zhǔn)確從中分別吸取0.3,0.6,0.9,1.2,1.5,1.8mL分置于6個25mL容量瓶中定容,獲得6個梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。從中各吸取2.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0mL蒸餾水做空白),加入5%苯酚1.0mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0mL,搖勻置沸水浴15min,冷水中冷卻30min至室溫,于490nm波長處測定其吸光度。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值如表1。1.5.2濃硫酸與糖溶液的分離取5種菊花總糖粗提液各1mL,置于5支試管中,每管均加入5滴α-萘酚溶液,混勻。分別沿管壁慢慢加入濃硫酸1mL,使?jié)饬蛩崤c糖溶液清楚的分為兩層,觀察兩液面間的變化。取5只試管分別加入濃度為1.25mol/L的氫氧化鈉溶液(溶有濃度為0.6mol/L酒石酸鉀鈉)和濃度為0.14mo/L的硫酸銅溶液各1mL,混勻,再分別加入0.5mL粗提液,搖勻,沸水浴3min,觀察溶液顏色變化。1.5.3濃硫酸-苯酚分光光度法精確量取上述各濃縮液0.5mL,定容于100mL容量瓶中,作為樣品供試液。精確吸取各樣品供試液2mL,分別置于5支試管中(蒸餾水做空白),加入5%苯酚1.0mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0mL,搖勻置沸水浴15min,冷水中冷卻30min至室溫,于490nm波長處測定其吸光度。1.5.4穩(wěn)定性試驗取樣品供試液,按照“1.5.3”測定方法,將同一份反應(yīng)液間隔一定的時間,測定吸光度值。1.5.5提取液濃度的測定總糖得率=C·W·V/M,其中:C為溶液濃度(單位:mg/mL),W為稀釋倍數(shù),V為提取液的體積(單位:mL),M為稱取固體菊花干粉的質(zhì)量(單位:g)。1.5.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SAS軟件,對5種方法的提取率進(jìn)行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2.1時域方程介紹根據(jù)“1.5.1”的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出曲線方程如圖1。以溶液濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出曲線方程為:A=12.74C+0.025(R2=0.997)2.2突出保護(hù)羧酸系統(tǒng)中的氧化酶對各種粗提液進(jìn)行糖類化合物鑒定,在提取液與濃硫酸的界面均出現(xiàn)紫色環(huán),說明提取液中含有糖類化合物;而且各個樣品溶液與氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液反應(yīng),均有磚紅色沉淀產(chǎn)生,說明提取液中含有還原性糖。2.3菊花總糖提取率測定取備好的菊花干粉3份(每份5g),置于3個燒瓶中,分別加入125mL水,85℃下,恒溫水浴鍋中回流提取2.5h,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進(jìn)行吸光度值測定,記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。計算總糖得率,其結(jié)果如表2。由表2可知,在上述實驗條件下,熱水法提取菊花總糖的得率是7.92%。2.4超聲法提取菊花總糖的效果取菊花干粉3份(每份5g),置于3只錐形瓶里,分別加水125mL,設(shè)定超聲波功率500W,在60℃溫度下間歇提取兩次,每次15min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進(jìn)行吸光度值測定,記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結(jié)果如表3。由表3可知,在上述實驗條件下超聲波法提取菊花總糖的得率是6.94%,比常規(guī)熱水法的提取率低0.98%。原因可能是用超聲波提取時,提取溫度為60℃,這個溫度低于熱水提取法的提取溫度85℃,菊花總糖未能充分溶解在溶劑中,從而導(dǎo)致提取率較低。2.5微波法提取總糖的最佳時間取菊花干粉3份(每份5g),置于3只燒杯中,分別加水125mL,設(shè)定微波輸出功率700W,置于解凍檔間歇提取3次,每次2min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進(jìn)行吸光度值測定,分別記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結(jié)果如表4。由表4可以看出,在上述實驗條件下,微波法提取總糖的得率是7.33%,比常規(guī)熱水法的提取率低0.59%。原因可能是由于植物結(jié)合水汽化溫度比較高,致使小部分糖分子焦化,從而導(dǎo)致提取率略低。但是兩者的提取率相差并不是很大。但是在試驗的過程中,用微波提取時,如果微波加熱時間控制不好,容易產(chǎn)生暴沸現(xiàn)象。在這種情況下就會導(dǎo)致物料損失,降低提取率,且操作安全性比較低。2.6超聲-熱水提取法和微波-微波聯(lián)用法提取菊花總糖的比較取菊花干粉3份(每份5g),置于3只錐形瓶中,分別加入125mL水,在超聲波功率500W,溫度60℃的實驗條件下間歇提取30min后轉(zhuǎn)移至燒瓶中,85℃下熱水回流提取30min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進(jìn)行吸光度值測定,分別記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結(jié)果如表5。由表5可知,在上述實驗條件下,超聲波預(yù)處理-熱水提取法提取菊花總糖得率達(dá)到9.86%,比常規(guī)熱水法的提取率高1.94%。原因可能是提取物先在超聲波作用下,使細(xì)胞破碎完全;再在85℃熱水中浸提,使糖類比較充分的溶解到提取劑中,從而使得率提高。該提取方法縮短了提取時間,提高了提取效率。取菊花干粉3份(每份5g),置于3只錐形瓶中,在超聲波功率500W,60℃條件下,超聲波法間歇提取30min后,再用微波間歇提取3次,每次2min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進(jìn)行吸光度值測定,記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結(jié)果如表6。由表6可以看出,在上述實驗條件下,超聲波-微波聯(lián)用法提取菊花總糖的得率為8.98%,比常規(guī)熱水法提取率高1.06%。但是,在試驗的過程中卻發(fā)現(xiàn):使用超聲波-微波聯(lián)用法提取菊花總糖時,提取液黏度比較高?？赡苁且驗閮烧咄瑫r作用,促使其他細(xì)胞內(nèi)容物連同糖類物質(zhì)一起釋放到溶劑中,致使提取液黏稠度增高,使分離操作的難度增加,不利于總糖的進(jìn)一步分離純化。2.7波后提取率測定在試驗的過程中,對每份粗提液進(jìn)行吸光度值測定時,每隔10min讀取一次吸光度值,連續(xù)測4次,實驗結(jié)果穩(wěn)定。使用SAS軟件對5組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果如表7。以常規(guī)熱水處理組做對照,由表7可以看出:超聲波處理組、微波處理組與常規(guī)熱水處理組相比較,提取率差異不顯著(p<0.05)。超聲波預(yù)處理-熱水處理組、超聲波-微波處理組與常規(guī)熱水處理組相比,結(jié)果差異顯著(p<0.05),提取率大于常規(guī)水提組。3超聲-微波法提取菊花多糖的最佳提取方法實驗結(jié)果顯示,用5種方法提取菊花總糖時,超聲波法、微波法的提取率與常規(guī)水提法相比,差異不是很大;而超聲波預(yù)處理-熱水提取法、超聲波-微波聯(lián)用法的提取率明顯高于常規(guī)熱水法的提取率。但是使用超聲波-微波法提取菊花多糖時,會造成提取液黏稠度增高,不利于下一步的分離純化。綜合各方面