中藥研究中的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

中藥研究中的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

中藥是經(jīng)過多年在中醫(yī)臨床實踐的總結(jié)而總結(jié)的治療方法。經(jīng)過2000多年的臨床應(yīng)用，中醫(yī)的有效性、實用性和科學(xué)性是毋庸置疑的。中藥可以說是中國傳統(tǒng)文化的寶貴財富。但是,中藥是典型的復(fù)雜物質(zhì)體系,其復(fù)雜性使對其作用機制的研究非常困難。首先,中藥的來源具有多樣性其來源以植物藥為主,其次是動物藥、礦物藥等。各種來源的原料藥導(dǎo)致中藥中化學(xué)成分多種多樣化合物的多樣性又繼而導(dǎo)致中藥表現(xiàn)出有多個效應(yīng)器官、多種作用和多個作用靶點。另外,中藥的臨床應(yīng)用形式多以復(fù)方為主,復(fù)方中多味藥的配伍應(yīng)用使得中藥的研究更為復(fù)雜和困難。復(fù)方的研究中既需要研究各單方中各化學(xué)成分的生物活性,又需要研究各單方之間的配伍規(guī)律及其協(xié)同作用方式等。因此,中藥復(fù)雜體系的作用機制研究中迫切需要應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展的新技術(shù)和新手段,探索適合中藥研究的新方法和新模式,才有可能真正揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制,使其“復(fù)雜而可知”。中藥包括復(fù)方的現(xiàn)代化研究一直是中醫(yī)藥界多年來關(guān)注的焦點和研究的熱點。近年來,我國政府已經(jīng)制定了一系列與中藥及其復(fù)方現(xiàn)代化研究相關(guān)的綱領(lǐng)性文件和全局性規(guī)劃。在2007年的《中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》中明確提出“充分運用中國所具有的中醫(yī)、西醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合三支力量共同發(fā)展的歷史積累和獨特經(jīng)驗,以及現(xiàn)代系統(tǒng)科學(xué)與復(fù)雜科學(xué)等理論和方法,對中醫(yī)藥學(xué)蘊含的生命科學(xué)問題開展廣泛深入的研究和探索在豐富和發(fā)展中醫(yī)藥理論和方法學(xué)體系的同時,爭取在與中醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵相關(guān)的若干問題上取得突破”。同一時期,2007年7月NATURE雜志一篇專門談?wù)撝嗅t(yī)藥的文章里也指出,“中醫(yī)藥要想取得突破性進展,必須依靠系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)”。系統(tǒng)生物學(xué)(SystemsBiology)的概念于1999年由LeroyHood提出,是指對一個生物系統(tǒng)中所有組成成分(基因、mRNA、蛋白質(zhì)等)的構(gòu)成及其在特定條件下這些組分之間的相互關(guān)系的研究,其認識生物的觀點是從局部觀走向整體觀。系統(tǒng)生物學(xué)認為生物系統(tǒng)具有“整體、層次、整合、動態(tài)”的特點,生物機體內(nèi)存在通過層次之間、網(wǎng)絡(luò)之間、系統(tǒng)之間的整合和聯(lián)系建立的無數(shù)個大小網(wǎng)絡(luò),而不同網(wǎng)絡(luò)之間的信息整合和傳遞使基因或蛋白質(zhì)產(chǎn)生出最終的生物學(xué)功能。系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)平臺是各種組學(xué)如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等正是這些組學(xué)技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了大量的生物學(xué)數(shù)據(jù),在對這些數(shù)據(jù)的分析(利用生物信息學(xué))中可以獲得對細胞、組織、器官和生物體不同水平的各種分子結(jié)構(gòu)和功能及其相互作用的了解,并通過計算生物學(xué)/生物信息學(xué)來描述和預(yù)測生物功能、表型和行為。系統(tǒng)生物學(xué)應(yīng)用于中藥研究的研究思路的提出,為中藥復(fù)雜體系的研究提供了嶄新的思路和方法,成為目前中藥現(xiàn)代化研究的熱點。迄今為止,不少科研工作者都在系統(tǒng)生物學(xué)思路指導(dǎo)下開展了對中藥復(fù)雜體系的研究。目前,在基因組測序已經(jīng)完成即對基因組靜態(tài)的堿基序列已經(jīng)清楚之后,系統(tǒng)生物學(xué)已經(jīng)進入了后基因時代,蛋白質(zhì)組學(xué)等基因功能學(xué)的研究成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的重點。以下重點介紹蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容、研究技術(shù)及其在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用。1蛋白質(zhì)組的概念蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)研究可以稱為是生命科學(xué)研究進入后基因組時代的里程碑,同時也是功能基因組時代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)組(proteome)這一概念最早是由澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams學(xué)者在1994年第一屆意大利錫耶納蛋白質(zhì)會議上提出,并在1996年發(fā)表了相關(guān)綜述。蛋白質(zhì)組(proteome)是指在一種細胞、組織或生物體中的完整基因組所對應(yīng)的全套蛋白質(zhì),而蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)就相應(yīng)是指研究細胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組的組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。1.1蛋白質(zhì)組學(xué)和復(fù)配蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容包括表達蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、比較蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)四方面的內(nèi)容。(1)表達蛋白質(zhì)組學(xué)是指采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分離鑒定某一細胞、組織或完整生物體內(nèi)盡可能多以至于接近全部的蛋白質(zhì),建立完整的蛋白質(zhì)組表達譜以及相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。表達蛋白質(zhì)組學(xué)是從大規(guī)模、系統(tǒng)性的角度來研究蛋白質(zhì)組學(xué),這也更加符合蛋白質(zhì)組學(xué)研究的本質(zhì);但是由于蛋白質(zhì)的表達隨著時間和空間不斷變化,要徹底分析生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)將是一個難以實現(xiàn)的目標。(2)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)是指對通過表達蛋白質(zhì)組學(xué)得到的全部蛋白質(zhì)進行三維結(jié)構(gòu)的精確測定。(3)比較蛋白質(zhì)組學(xué)是采用蛋白質(zhì)組學(xué)整體分析技術(shù),針對不同時間和空間動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組進行比較,分析不同處理組之間蛋白質(zhì)組在表達水平、表達數(shù)量和修飾狀態(tài)的差異。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法考察不同時期不同環(huán)境下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的變化,繼而發(fā)現(xiàn)并研究差異表達的蛋白質(zhì)及其功能,不僅可以了解疾病的發(fā)病機制,尋找到與疾病診斷相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)和藥物治療相關(guān)的蛋白質(zhì)靶點,而且也可以揭示物理、化學(xué)和生物因素干擾疾病發(fā)生的分子機制。在藥物包括中藥的作用機制研究中,應(yīng)用最多的就是比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。(4)功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括蛋白質(zhì)修飾狀態(tài)(如磷酸化、糖基化、泛素化、乙?；?、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)表達后在細胞內(nèi)定位等的研究,從而構(gòu)建細胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的圖譜以及復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,其研究內(nèi)容日益細化。例如,蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的也是最常見的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,在哺乳動物細胞生命周期中,大約有1/3蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾。運用蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和分析方法研究蛋白質(zhì)的磷酸化修飾,可以從整體上觀察細胞或組織中蛋白質(zhì)磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化,由此衍生出磷酸化蛋白組學(xué)(phosphoproteomics)這一新研究領(lǐng)域。1.2蛋白質(zhì)的制備和分離蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)包括:(1)蛋白質(zhì)組樣品的制備;(2)蛋白質(zhì)組樣品的分離;(3)蛋白質(zhì)的生物質(zhì)譜鑒定;(4)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的鑒定。1.2.1細胞蛋白的分離和純化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備的要求是盡可能完整地將所有蛋白質(zhì)從細胞或者組織中提取出來,是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首要步驟。常用樣品來源有體外培養(yǎng)細胞、活體組織標本、血清和體液等。使用體外培養(yǎng)細胞的優(yōu)點是能夠?qū)μ囟ǖ募毎M分或者亞組分進行分析,不足之處在于培養(yǎng)細胞不能完全反映體內(nèi)的真實情況,且受實驗條件等因素影響,研究結(jié)果存在偏差。從活體組織標本中提取細胞蛋白,應(yīng)避免血管組織、血細胞、周圍結(jié)締組織和間質(zhì)等的污染。如果需要進行組織中單類細胞的分離,可采用機械方法、免疫磁珠、熒光標記細胞分選或近來發(fā)展較快的且被普遍看好的激光捕獲微切割技術(shù)(1asercapturemicrodissection)方法進行。從復(fù)合組織中特異性分離出特定的單一細胞或細胞群體,這樣可以避免組織異質(zhì)性其他蛋白質(zhì)成分對于目標蛋白質(zhì)分析的干擾和影響,確保研究結(jié)果的可靠性。用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)樣品通常可采用細胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分,也可以進行樣品預(yù)分級,即采用差速離心和密度梯度離心等方法根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細胞中不同的細胞器定位進行分級,如可分離出細胞膜、細胞核、線粒體或高爾基體等細胞器的蛋白質(zhì)成分。其他預(yù)分方法還有如用親和層析的方法對有磷酸化修飾的蛋白質(zhì)進行富集,只進行磷酸化蛋白的研究等。1.2.2在蛋白質(zhì)組中分離樣品蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)主要包括基于蛋白質(zhì)的分離(以雙向電泳為例)和基于肽的分離(以先酶解后再進行液相色譜分離為例)兩大類。1.2.3質(zhì)化裝置的質(zhì)譜條件如果說在蛋白質(zhì)的分離中各種技術(shù)方法是并存的,那么在蛋白質(zhì)的鑒定中,質(zhì)譜作為主流技術(shù)的地位已無可爭議,質(zhì)譜已經(jīng)成為最常用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)早在20世紀初就已經(jīng)出現(xiàn),但當時一直應(yīng)用于有機小分子領(lǐng)域,直到20世紀80年代質(zhì)譜技術(shù)才漸漸進入生物大分子領(lǐng)域。隨著20多年來的發(fā)展和應(yīng)用,質(zhì)譜技術(shù)逐步取代傳統(tǒng)的氨基酸組成分析和Edman降解測序,成為蛋白質(zhì)鑒定的主流技術(shù)、核心技術(shù)和支撐技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是將蛋白質(zhì)樣品先經(jīng)過離子化后,然后根據(jù)不同離子間質(zhì)子與電荷之比(m/z)的差異來分離并確定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。因此,用于蛋白質(zhì)鑒定的各種質(zhì)譜儀均由樣品離子化裝置、離子檢測器以及質(zhì)量分析器3個最基本的部分組成。樣品離子化裝置采用典型的“軟電離”的方式電離蛋白質(zhì)樣品分子。所謂“軟電離”是指在蛋白質(zhì)樣品分子電離這一過程中,由于沒有直接的外界能量作用于樣品分子,所以對樣品分子結(jié)構(gòu)破壞較少,從而保留整個蛋白質(zhì)分子的完整性,不會形成碎片離子。蛋白質(zhì)樣品分子“軟電離”常用的兩種離子化方法是基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)和電噴霧離子化(ESI)以及由它衍生出的納電噴霧離子化(nano-ESI)。目前最常用的質(zhì)量分析器包括傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR/FT)、線性離子阱質(zhì)譜(LIT/LTQ)、四級桿離子阱質(zhì)譜(QIT)和飛行時間質(zhì)譜(TOF)4種。例如,配有基質(zhì)輔助激光解析/電離的飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)非常適用于鑒定2-DE分離的蛋白點,其原理是通過利用基質(zhì)吸收激光的能量從而使固相的蛋白質(zhì)樣品分子離子化,在電場作用下加速飛過飛行管道,進入質(zhì)量分析器的離子化肽段因為質(zhì)荷比(m/z)的差異而發(fā)生分離,樣品質(zhì)荷比(m/z)與飛行時間呈正比,根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而達到檢測目的。通過測量肽段離子的相關(guān)參數(shù),可以獲得蛋白質(zhì)樣品分子肽質(zhì)量指紋(PMF)、肽序列標簽(PST)或部分氨基酸序列等相關(guān)信息,然后通過適當?shù)能浖褜は嚓P(guān)的基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,實現(xiàn)對蛋白質(zhì)分子的定性鑒定。該方法操作簡單、高效、快速,其最大的優(yōu)點在于離子電荷通常為1~2個,而不是多電荷離子,這對于分子質(zhì)量較大的樣品而言,不會形成復(fù)雜的多電荷圖,有利對圖譜清楚的解析,適用于高通量大樣本的蛋白質(zhì)組的篩選與分析。此外,該技術(shù)對于樣品中雜質(zhì)的容忍程度已相對較好,排除了因鹽類物質(zhì)以及組織不純等影響蛋白質(zhì)樣品分子解吸效率不穩(wěn)定的因素。但該技術(shù)對小分子量蛋白質(zhì)(特別是相對分子質(zhì)量<50000)檢測效果較差,鑒定到的蛋白質(zhì)分子量覆蓋度明顯小于其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。因此,鑒于不同質(zhì)量分析器在物理原理和分析性能方面有不同的特點,通過重組不同性能的質(zhì)量分析器,可以獲得Q-Q-Q、Q-Q-LIT、Q-TOF、TOF-TOF和LTQ-FTICR等多種“雜交”型的質(zhì)譜。近年來ThermoFisher公司生產(chǎn)的新型雜交型質(zhì)譜LTQ–Orbitrap是目前生物質(zhì)譜研究領(lǐng)域最優(yōu)秀的儀器之一。1.2.4國外設(shè)計結(jié)構(gòu)基因組計劃的啟動蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究對于深入理解蛋白質(zhì)功能與機理非常重要,同時也是基于結(jié)構(gòu)進行合理化藥物研發(fā)及設(shè)計的基礎(chǔ)。在國際上,美國首先提出大規(guī)模測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計劃,現(xiàn)在已進入第二期的產(chǎn)出階段,其他發(fā)達國家(歐盟和日本)也相繼啟動了自己的結(jié)構(gòu)基因組計劃。當前國際發(fā)展趨勢是以X射線衍射作為解析蛋白質(zhì)原子分辨率結(jié)構(gòu)的主要手段,核磁共振技術(shù)(NMR)和電鏡技術(shù)(EM)及其他新興技術(shù)為輔助手段。1.3生物組織學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用值得一提的是,在基因組學(xué)的發(fā)展過程中,基因組學(xué)和生物信息學(xué)的結(jié)合為科研工作者獲得了很多非常有價值的研究成果。與之相似,蛋白質(zhì)組學(xué)與生物信息學(xué)的結(jié)合也是蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的必需要求。生物信息學(xué)是生物學(xué)與信息科學(xué)、數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)等學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。生物信息學(xué)是通過采集、處理、儲存、分析和解釋由各種技術(shù)平臺(如大規(guī)模DNA測序、蛋白質(zhì)組研究等)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù),來闡明和理解這些數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義。生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用基本包括以下方面:(1)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫的建立和使用。例如可以建立并使用各種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)序列數(shù)據(jù)庫、空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)雙向電泳圖像數(shù)據(jù)庫、信號傳導(dǎo)及蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫、DNA和蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫等等;(2)蛋白質(zhì)未知結(jié)構(gòu)的預(yù)測。例如,可以根據(jù)蛋白質(zhì)的一級序列數(shù)據(jù)預(yù)測蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),主要是根據(jù)同源系列的比對和某些關(guān)鍵的氨基酸殘基的位置,以已知三維結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為依據(jù),預(yù)測未知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu);(3)蛋白質(zhì)未知功能的預(yù)測。生物信息學(xué)最常用的分析方法是模式識別,即利用存在于蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)中的某些特殊的特征模體來識別標志性的序列或者結(jié)構(gòu),以此建立模式,然后在已經(jīng)建立好的已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中,搜集與此相似的模式,來確定未知蛋白質(zhì)的歸屬,從而預(yù)測它的功能。比較的方法包括基于序列相似性比較、基于系統(tǒng)發(fā)育譜比較、基于結(jié)構(gòu)域融合比較、基于mRNA表達類型的比較等。2關(guān)于中藥中蛋白質(zhì)組的用途由于各種疾病的發(fā)生和藥物治療靶點大多數(shù)是在蛋白質(zhì)(酶、受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)水平,因此蛋白質(zhì)組學(xué)非常適用于研究藥物的作用機制、尋找有效的藥物靶點及開發(fā)新藥。蛋白質(zhì)組學(xué)(結(jié)合生物信息學(xué))在中藥復(fù)雜體系的研究中至少可以有如下幾方面的用途:(1)通過比較正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)及藥物(中藥中的單體化合物或有效部位或復(fù)方提取物)治療后蛋白質(zhì)組表達的差異,尋找藥物的靶點相關(guān)蛋白;(2)用生物信息學(xué)方法預(yù)測中藥中單體化合物的可能直接蛋白質(zhì)靶點,并用蛋白質(zhì)和化合物相互作用的相關(guān)驗證方法(例如表面等離子體共振技術(shù)、化合物與蛋白質(zhì)共結(jié)晶后進行X射線衍射等)進行驗證;(3)利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫和中藥的可能作用靶點繪制出中藥的可能作用網(wǎng)絡(luò),并用生物學(xué)方法進行驗證;(4)對于中藥復(fù)方的研究,可以分析復(fù)方中各單方的可能作用靶點,利用信號通路數(shù)據(jù)庫等推測各單方之間的可能相互作用,探索復(fù)方的可能配伍機理。2.1蛋白質(zhì)組學(xué)法通過比較對照細胞或動物組織的蛋白質(zhì)表達譜和給予中藥后蛋白質(zhì)表達譜的差異,可以找到中藥的可能靶點相關(guān)蛋白質(zhì)。目前,這個方法已經(jīng)在中藥的研究中較廣泛地應(yīng)用,目前蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用實例大部分屬于此類。該方法已被用于中藥中單體化合物、有效部位及提取物的作用機制的研究。2.1.1利用組學(xué)和化學(xué)鑒定多聚體糖酸組學(xué)聯(lián)合用藥的研究2003年MacKeiganJP等通過蛋白質(zhì)雙向電泳分離與質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的技術(shù),發(fā)現(xiàn)紅豆杉中分離的單體化合物紫杉醇(paclitaxel/taxol)和MEK抑制劑合用時改變了RNA-bindingregulatorysubunit/DJ-1PARK7)蛋白和RhoGDP-dissociationinhibitoralpha蛋白的表達。2004年WenzelU等發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物槲皮素(quercetin)通過促進結(jié)腸癌細胞株HT-29細胞凋亡和分化從而抑制腫瘤細胞的增殖,并通過蛋白質(zhì)組學(xué)手段鑒定到其影響的一系列蛋白質(zhì)。2005年LeeKH等利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了紫杉醇在人宮頸癌細胞株HeLa細胞中的可能靶點相關(guān)蛋白質(zhì)。2006年HaWY等通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)闡明從遠志科植物烏棒子(Polygalacaudata)中分離的單體化合物euxanthone誘導(dǎo)小鼠成神經(jīng)細胞瘤2a細胞分化的分子機制可能是與被激活的轉(zhuǎn)錄因子E2Ftranscriptionfactor5等有關(guān)。2006年ChenDM等利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法考察了芍藥的主要化學(xué)成分芍藥苷(paeoniflorin)能延遲對于局部缺血性中風(fēng)病理模型大鼠神經(jīng)保護的分子機制。2006年WangY等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究從湖北黃精提取的薯蕷素(dioscin)對人髓系白血病細胞株HL-60細胞的細胞毒性的分子作用機制,2007年WangY等進一步通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究HL-60細胞微粒體部分蛋白質(zhì)組表達的變化,闡明薯蕷素(dioscin)通過觸發(fā)線粒體氧化應(yīng)急反應(yīng),從而誘導(dǎo)HL-60細胞的凋亡。2008年筆者所在實驗室YueQX等用蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合MALDIMS/MS質(zhì)譜鑒定的方法研究了從中藥靈芝中分離的單體化合物靈芝酸D(ganodericacidD)對于人宮頸癌細胞株HeLa細胞毒性的作用機制,發(fā)現(xiàn)了可能是靈芝酸D靶點相關(guān)蛋白的21個差異表達蛋白。2009年WangX等利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)從藤黃中分離的S型藤黃酸(S-gambogicacid)抑制人肝癌細胞株HepG2細胞增殖的蛋白質(zhì)分子靶標為stathmin1。2.2.2小鼠臟器相關(guān)蛋白的活性及相關(guān)機制的作用2008年ChengZX等分析了從中藥重樓(RhizomaParidis)中分離的總皂苷有效部位作用于人肝癌細胞株HepG2細胞48h后蛋白質(zhì)組的表達變化。2008年筆者所在實驗室MaC等通過蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法找到了12個可能與靈芝孢子總多糖(polysaccharides)刺激小鼠脾臟單核細胞增殖作用相關(guān)的蛋白質(zhì);筆者所在實驗室YaoY等分別考察了三七總皂苷和丹參總酚酸抗血小板聚集作用的可能靶點相關(guān)蛋白質(zhì),找到了三七總皂苷影響的與血小板聚集、氧化應(yīng)急反應(yīng)以及細胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)和丹參總酚酸影響的與鈣動態(tài)平衡、抗氧化以及細胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。筆者所在實驗室YueQX等通過蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合蛋白質(zhì)功能驗證等技術(shù)闡明了靈芝總?cè)?Ganodermatriterpenes)與抗腫瘤化學(xué)藥物阿霉素合用對人宮頸癌細胞株HeLa的細胞毒性的分子機制,其協(xié)同作用機制可能是通過增加氧自由基損傷和DNA損傷以及誘導(dǎo)細胞凋亡殺死腫瘤細胞。筆者所在實驗室MaC等還考察了多種處理組(對照、環(huán)磷酰胺處理、靈芝孢子多糖處理和環(huán)磷酰胺加靈芝孢子多糖處理)的小鼠的胸腺組織蛋白質(zhì)表達譜,找到了15個可能與環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用相關(guān)的蛋白質(zhì);在這15個蛋白質(zhì)中,其中6個蛋白質(zhì)在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)下的表達改變可以被合用靈芝孢子多糖所逆轉(zhuǎn),這些蛋白質(zhì)可能與靈芝多糖對抗環(huán)磷酰胺免疫抑制的能力有關(guān)。2.2.3蛋白質(zhì)組學(xué)及化學(xué)成分組學(xué)研究蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥提取物(包括復(fù)方的提取物)的作用機制研究中也起到了重要的作用。例如,由熟地黃、當歸、白芍和川芎4味中藥藥材組成的四物湯是臨床常用的經(jīng)典補血名方,近年來應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在研究四物湯對血虛證動物和血虛證患者的作用機制方面取得了較大的進展。(1)2004年GuoP等研究了四物湯對于放射線照射后導(dǎo)致的血虛證小鼠骨髓蛋白質(zhì)表達譜的影響,發(fā)現(xiàn)四物湯能調(diào)節(jié)骨髓組織糖代謝,促進造血生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和造血細胞的生長和分化,可能由此發(fā)揮補血作用,進而能逆轉(zhuǎn)放射導(dǎo)致的血虛證。(2)2006年LiuLL等研究四物湯對于化學(xué)藥物環(huán)磷酰胺損傷導(dǎo)致的血虛證小鼠骨髓蛋白質(zhì)組的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四物湯可能通過影響與細胞凋亡、造血干祖細胞增殖分化有關(guān)的蛋白質(zhì)而促進骨髓造血。(3)2008年YangMH等運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)考察了四物湯對于血虛證患者血清蛋白的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四物湯可能是通過增強免疫、減輕基因損傷、增加血紅蛋白等途徑治療血虛證。蛋白質(zhì)組學(xué)在其他中藥提取物的作用機制研究中的應(yīng)用還有如2006年WuH等利用蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫印跡等技術(shù)闡明臺灣民間真菌藥材樟芝(Antrodiacamphorata)乙醇提取物抑制非小細胞肺癌細胞株A549細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的分子機制可能與誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急反應(yīng)、進而引起5個與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達量發(fā)生改變有關(guān)。2008年WangCY等通過基因芯片和蛋白質(zhì)雙向電泳等方法研究臺灣民間藥材狹葉紫錐菊(echinaceapurpurea)丁醇提取物作用于樹突狀細胞引起的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的變化,蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果表明12h后被處理細胞內(nèi)與細胞骨架和抗氧化應(yīng)急相關(guān)的蛋白質(zhì)表達量上調(diào)。2009年Nquyen-KhuongT等考察由中藥五味子、大豆、栝樓和西地格絲蘭提取物組成的混合物MINA-05作用于人膀胱癌細胞72h后蛋白質(zhì)組的表達變化,鑒定了多種與細胞骨架、能量代謝、蛋白質(zhì)降解以及腫瘤抑制相關(guān)的蛋白質(zhì),提示MINA-05抑制膀胱癌細胞增殖是與腫瘤細胞周期、代謝、蛋白質(zhì)降解以及生存環(huán)境的改變相關(guān)。2009年LeeTY等考察由茵陳蒿、梔子和大黃等中藥組成的復(fù)方茵陳蒿湯(Yin-Chen-Hao-Tang)作用于肝纖維化的大鼠膽管結(jié)扎模型27d后肝臟蛋白質(zhì)組的表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯治療大鼠肝纖維化的作用可能與抑制正常肝細胞的凋亡以及調(diào)控脂類物質(zhì)的生物合成有關(guān)。2.3實驗方法的驗證。例如,筆者所在實驗室與上海生物信息學(xué)研究中心合作,用一種叫INVDOCK的反向?qū)榆浖ふ夷軌蚺c靈芝酸D直接結(jié)合的蛋白質(zhì)靶點。結(jié)果表明14-3-3蛋白可能是靈芝酸D能夠直接結(jié)合的蛋白質(zhì)靶點。對于生物信息學(xué)預(yù)測的直接作用蛋白質(zhì)靶點,還需要用生物學(xué)方法進行驗證。筆者所在實驗室采用體外表面等離子體共振技術(shù)(SurfacePlasmonResonance/SPR)分析方法用BIAcore3000儀器對靈芝酸D和14-3-3蛋白的結(jié)合能力進行了驗證。表面等離子體子共振是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。利用金屬薄膜表面的折射率的改變,引起共振角的變化,可以來推斷金屬薄膜表面的變化。具體實驗時是先將目的蛋白質(zhì)固定在鍍有金膜的傳感器芯片表面,將可能與之相互作用的化合物分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的化合物分子與芯片表面蛋白質(zhì)分子的結(jié)合、解離整個過程的變化。除了表面等離子體共振技術(shù)外,還有很多其他的驗證蛋白質(zhì)和化合物相互作用的方法。例如,可以制備化合物與蛋白質(zhì)的共結(jié)晶再進行X射線衍射確定結(jié)合的具體位點;隨后再定點突變蛋白質(zhì)結(jié)合位點的序列,考察是否還具有與化合物結(jié)合的能力等等。2.4未分類生物實體相互作用的數(shù)據(jù)庫不動產(chǎn)層次隨著蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)(包括酵母雙雜交、GST標記pull-down、免疫共沉淀、親和色譜、表面等離子共振等)的發(fā)展,目前已經(jīng)獲得了大量的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。目前較大的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫有(1)BIND(TheBiomolecularInteracfionNetworkDatabase)數(shù)據(jù)庫(http://bind.ca/)。該數(shù)據(jù)庫包含了所有生物分子例如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、配基、復(fù)合體、基因還有一些未分類的生物實體的相互作用數(shù)據(jù)。BIND的數(shù)據(jù)來源包括期刊提交、公眾提交、文獻提取、其他蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入等;(2)DIP數(shù)據(jù)庫(http://dip.doe-mbi.U/),專門存放實驗確定的蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù),既包括經(jīng)典實驗手段確定的蛋白質(zhì)相互作用,也包括高通量實驗手段確定的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù);(3)STRING數(shù)據(jù)庫,與BIND、DIP數(shù)據(jù)庫不同的是,STRING數(shù)據(jù)庫(http://string.emb1.de)不僅存儲實驗確定的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),它還存放預(yù)測得到的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),并對各種預(yù)測方法得到的結(jié)果的準確性給出了相應(yīng)的權(quán)重。在獲得化合物的直接蛋白質(zhì)靶點(通過生物信息學(xué)預(yù)測并驗證)信息和可能蛋白質(zhì)靶點(通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)比較對照和給予化合物后蛋白質(zhì)表達譜的變化)信息的基礎(chǔ)上,可以利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫,繪制出化合物的靶點作用網(wǎng)絡(luò)。例如,本實驗室就用該方法繪制了靈芝酸D的靶點作用網(wǎng)絡(luò)。對于網(wǎng)絡(luò)中的一些預(yù)測的中間蛋白質(zhì),可以再進行深入研究,用生物學(xué)實驗(如RNA干擾、基因過表達等)進行驗證。繪制靶點作用網(wǎng)絡(luò)的方法可能對于中藥的研究有特別適合之處,因為中藥往往是同時對多個靶點發(fā)生作用,而對每個靶點的作用都不是很強。因此,只有從網(wǎng)絡(luò)的角度才可以獲得對中藥作用機制的比較全面的了解。2.5促進形成中藥復(fù)方作用機制中藥復(fù)方是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中醫(yī)臨床用藥的主要形式,也是中藥有別于植物藥或草藥而具有的特色所在。藥有個性之特長,方有合群之妙用?！熬甲羰埂钡慕M方原則,“相須、相使、相惡”的作用規(guī)律,是傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)整體觀和辯證論治的集中體現(xiàn)。只有充分研究揭示中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理,促進中藥的現(xiàn)代化和用于指導(dǎo)新的中藥的開發(fā),才是對我國寶貴的中醫(yī)藥最好的繼承和發(fā)揚。中藥復(fù)方中各單方之間的相互作用機制的揭示是中藥研究的關(guān)鍵。筆者所在實驗室進行了一些將蛋白質(zhì)組學(xué)用于復(fù)方作用機制研究的嘗試。例如,我們在分別研究丹參總酚酸和三七總皂苷的可能作用靶點的同時也對丹參和三七的復(fù)方配伍機制進行了探索性研究。蛋白質(zhì)組學(xué)用于復(fù)方研究的可能研究思路有:2.5.1單因素協(xié)同作用的發(fā)展在獲得關(guān)于復(fù)方中各單方的可能蛋白質(zhì)靶點的信息后,我們可以用生物信息學(xué)的方法尋找可能發(fā)生協(xié)同作用的機制。產(chǎn)生協(xié)同作用的可能性包括:(1)不同單方作用于同一蛋白質(zhì)靶點,在與該蛋白質(zhì)的結(jié)合中具有協(xié)同作用。關(guān)于這一點,可以通過分析不同單方化合物對于同一蛋白質(zhì)的結(jié)合位點等進行研究;(2)不同單方作用于不同蛋白質(zhì)靶點,但是這些蛋白質(zhì)屬于同一信號通路的不同組成部分,因此單方之間存在著信號通路層面的協(xié)同作用。關(guān)于這一點,可以通過將不同單方的蛋白質(zhì)靶點在信號通路數(shù)據(jù)庫中找到它們參與的信號通路后進行分析。目前,筆者所在實驗室正在用這些方法進行丹參三七的分析工作,對于丹參,我們選取了其中代表性的化合物丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹參素四種化合物進行分析;對于三七,我們選取了其中代表性的化合物三七皂苷及其兩種體內(nèi)代謝產(chǎn)物進行分析,目前已經(jīng)獲得了一些初步的結(jié)果(待發(fā)表)。2.5.2心肌缺血再灌注損傷在蛋白質(zhì)組學(xué)研究時,如果同時進行各單方和復(fù)方的研究,就可以獲得各單方及復(fù)方各自影響的蛋白質(zhì)表達譜。通過比較分析這些表達譜,可以獲得一些對復(fù)方作用機制的了解。例如,筆者所在實驗室用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型考察了丹參、三七、和丹參三七復(fù)方的藥理作用及各處理組動物心臟的蛋白質(zhì)表達譜。在此模型中丹參三七復(fù)方的藥效作用優(yōu)于單獨運用的丹參或三七。蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果顯示,如果對與缺血再灌注損傷最為相關(guān)的多個蛋白質(zhì)在各處理組進行聚類分析,丹參、三七單用能夠不同程度地調(diào)節(jié)缺血再灌注導(dǎo)致的異常蛋白質(zhì)表達;與單方相比,丹參三七復(fù)方能夠使異常的蛋白質(zhì)表達譜回到最接近假手術(shù)對照組的水平。這些結(jié)果提示蛋白質(zhì)表達譜的變化和藥效是吻合的,蛋白質(zhì)表達譜可以反映復(fù)方優(yōu)于單方的特點(待發(fā)表)。3蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用中藥復(fù)雜體系的研究需要以中醫(yī)藥傳統(tǒng)的理論體系為指導(dǎo),借助現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的研究方法,通過多技術(shù)輔助、多視角切入、多學(xué)科滲透交叉,才能夠全面、系統(tǒng)、正確地闡明中藥尤其是復(fù)方的作用靶點、作用環(huán)節(jié)和作用過程。將系統(tǒng)生物學(xué)的理論與方法學(xué)引入中藥的研究領(lǐng)域已經(jīng)初步顯示了其可行性與合理性,“系統(tǒng)生物學(xué)能夠給中藥研究帶來突破”這一觀念已經(jīng)成為中藥研究者的共識。蛋白質(zhì)組學(xué)是目前系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點,蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用無疑給中藥的研究帶來很大的發(fā)展空間。本文綜述了一些將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于中藥研究的成功實例和目前的一些研究思路?？梢灶A(yù)計,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)自身的發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系的研究中一定還會有更多的用途。另外,要強調(diào)的是,蛋白質(zhì)組學(xué)只是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分之一,很多研究者用系統(tǒng)生物學(xué)的其他技術(shù)平臺如基因組學(xué)、代謝組學(xué)等也都取得了很好的研究成果。因此,筆者認為在中藥復(fù)雜體系的研究中最好綜合應(yīng)用多種系統(tǒng)生物學(xué)關(guān)鍵技術(shù)和手段,把多種手段獲得的結(jié)果進行融合,只有這樣才能夠真正發(fā)揮系統(tǒng)生物學(xué)的優(yōu)勢,建立與中醫(yī)整體理論相符的整體研究思路從分子水平上闡明中藥復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理,為中藥的現(xiàn)代化和國際化服務(wù)。(1)雙向凝膠電泳O’Farrell等于1975年首先創(chuàng)立,其原理是根據(jù)不同蛋白質(zhì)之間的等電點和分子量差異而分離蛋白質(zhì)的。其中第一向蛋白質(zhì)水平電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同,在高壓電場下進行等電聚焦電泳(isoelectricfocusing,IEF);第二向蛋白質(zhì)垂直電泳則是常規(guī)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS),是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小的差異導(dǎo)致電泳遷移率的不同而達到分離蛋白質(zhì)的目的。雙向電泳的凝膠經(jīng)過考染或者銀染后,一般一張雙向凝膠上可出現(xiàn)數(shù)百至上千個蛋白質(zhì)點。由于雙向電泳對于蛋白質(zhì)的分離結(jié)果直觀,也便于計算機進行圖像軟件分析處理,并能與質(zhì)譜分析鑒定方法相匹配等優(yōu)點,因此雙向凝膠電泳至今仍是目前最常用、最經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。不過,雙向電泳也有些不足之處,例如對靠近IPG膠條極端酸性或堿性蛋白質(zhì)、部分不溶于樣品緩沖液的膜蛋白、低豐度蛋白質(zhì)、疏水性蛋白質(zhì)和相對分子質(zhì)量特大(>200000)或特小(<8000)蛋白的分離仍有一定的困難;電泳結(jié)果需要染色處理,此項操作費時、費力;同時,雙向電泳凝膠的蛋白質(zhì)載樣量有限再加上不同的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合差異較大會影響一些低表達蛋白質(zhì)的分離;此外,該技術(shù)尚不能與質(zhì)譜直接聯(lián)用從而難以實現(xiàn)完全自動化。值得一提的是,近10年來,通用(GE)公司在傳統(tǒng)雙向電泳基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新型的高靈敏度熒光染料標記的雙向電泳技術(shù)即凝膠內(nèi)差別電泳(differentialingelelectrophoresis,DIGE)技術(shù)逐漸獲得廣泛的接受和應(yīng)用。該技術(shù)最大的特點是在分析中引入了內(nèi)參,通過將不同蛋白質(zhì)樣品(包括目標蛋白質(zhì)樣品和對照蛋白質(zhì)樣品)標記上不同的熒光,將不同蛋白質(zhì)樣品在同一塊電泳膠內(nèi)分離,消除了膠與膠之間的差異,避免了在使用不同凝膠操作過程中的人為性和偶然性,從而使獲得的結(jié)果更為可信;并且減少了需要進行電泳的次數(shù),縮短了實驗需要花費的時間。(2)檢測蛋白質(zhì)的分離和高效利用目前最常用的也是最有發(fā)展前景的,就是酶解后用多維液相色譜技術(shù)進行分離。單一的液相分離技術(shù)由于自身分離能力的限制,常常不能滿足蛋白質(zhì)復(fù)合物分離的需要。多維液相色譜法是指兩種或兩種以上具有不同原理特性的液相分離方法的優(yōu)化和組合,該技術(shù)最突出的優(yōu)點是對全蛋白質(zhì)組分進行分析時歧視效應(yīng)大大減小,并能與質(zhì)譜直接聯(lián)用,從而可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離與鑒定的在線聯(lián)用與操作,有利于蛋白質(zhì)組研究的高通量化和自動化。多維液相色譜分離技術(shù)主要包括離子交換色譜與反相液相色譜聯(lián)用分離技術(shù)、雜交相色譜分離技術(shù)、其它混雜的二維色譜技術(shù)和三維色譜技術(shù)等。1)目前最常用于蛋白質(zhì)組學(xué)分離的多維液相色譜技術(shù)是離子交換色譜與反相液相色譜的聯(lián)合使用(Ion-exchangechromatography–RPLC,IEX–RPLC)。離子交換色譜技術(shù)是通過溶質(zhì)在離子交換色譜固定相上具有不同的保留能力從而實現(xiàn)對樣品分離的色譜技術(shù)。就蛋白質(zhì)和多肽樣品而言,其表面帶有的電荷與離子交換色譜固定相表面的電荷發(fā)生不同的靜電相互作用,利用這種相互作用的差異從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)或多肽混合物的分離;而反相液相色譜技術(shù)則是根據(jù)溶質(zhì)疏水性的差異分離蛋白質(zhì)或多肽混合物。通過這兩種色譜模式的有效聯(lián)合使用,可以實現(xiàn)對復(fù)雜蛋白質(zhì)組份的二維分離。IEX–RPLC的優(yōu)勢是通過IEF可以得到很高的樣品容量而RPLC與質(zhì)譜之間有極好的兼容性。當然,IEX–RPLC也有缺點,那就是分離過程需要花費較長的時間,完成整個分離的過程可能需要幾天的時間。2)雜交相色譜分離技術(shù)(Hybrid-phasechromatographyseparations)是應(yīng)用一前一后的陰離子或陽離子交換柱快速的將等電點范圍寬泛的蛋白質(zhì)或多肽樣品分離為帶正電荷、負電荷和不帶電荷三部分,從而有利于樣品的檢測。3)其他混雜的二維色譜技術(shù)(Miscellaneoustwo-dimensionalchromatographytechniques)是用其它的液相色譜分離系統(tǒng)如分子大小排阻色譜(sizeexclusionchromatography,SEC)或靜態(tài)金屬親合色譜(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)與RPLC耦聯(lián),前者已經(jīng)被成功的應(yīng)用于酵母、疫球蛋白融合蛋白和細胞色素b6f復(fù)合體蛋白質(zhì)組的分析,后者也被報道成功地改善了對蛋白質(zhì)磷酸化位點的識別和鑒定。4)三維色譜技術(shù)(Three-dimensionalchromatographytechniques)是指對那些用二維色譜不能充分分離的復(fù)雜樣品,先用另外一種色譜技術(shù)進行預(yù)先分離,例如有報道用SEC預(yù)分離后再用陽離子交換色譜(strongcationexchange)串聯(lián)RPLC進行人肝組織蛋白質(zhì)組的分離。(1)分子離子化特性是指利用固體基質(zhì)分子均勻地包埋蛋白質(zhì)樣品分子,在激光的照射下,基質(zhì)分子吸收激光能量而蒸發(fā),從而攜帶蛋白質(zhì)樣品分子進入氣相,基質(zhì)分子進一步將能量傳遞給樣品分子,從而實現(xiàn)樣品分子的離子化。MALDI比ESI具有更寬的蛋白質(zhì)或者多肽的質(zhì)量分析范圍和更高的鹽離子的耐受性。(2)電離子離子法esi是指將待測蛋白質(zhì)樣品溶解在溶劑中,以液相方式通過毛細管到達噴口蛋白質(zhì)樣品分子在噴口高電壓的作用下形成帶電荷的微滴,隨著微滴中揮發(fā)性溶劑的蒸發(fā),微滴表面的電場隨半徑減小而增加,當?shù)竭_某一臨界點時蛋白質(zhì)樣品分子以離子方式從液滴表面蒸發(fā)進入氣相,進而實現(xiàn)樣品分子的離子化。ESI最主要的優(yōu)點是它可以比較容易的耦聯(lián)在線的分離方法;此外,ESI能夠產(chǎn)生帶有多電荷的離子,通過比較低的質(zhì)荷比界限實現(xiàn)對于多電荷的離子進行鑒定。(1)蛋白質(zhì)晶體學(xué)檢測和晶體結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的應(yīng)用自1895年德國物理學(xué)家倫琴首次發(fā)現(xiàn)X射線以來,X射線的應(yīng)用越來越廣泛。作為其重要分支之一的X射線晶體學(xué)