中藥研究中的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

中藥研究中的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

中藥是經(jīng)過(guò)多年在中醫(yī)臨床實(shí)踐的總結(jié)而總結(jié)的治療方法。經(jīng)過(guò)2000多年的臨床應(yīng)用，中醫(yī)的有效性、實(shí)用性和科學(xué)性是毋庸置疑的。中藥可以說(shuō)是中國(guó)傳統(tǒng)文化的寶貴財(cái)富。但是,中藥是典型的復(fù)雜物質(zhì)體系,其復(fù)雜性使對(duì)其作用機(jī)制的研究非常困難。首先,中藥的來(lái)源具有多樣性其來(lái)源以植物藥為主,其次是動(dòng)物藥、礦物藥等。各種來(lái)源的原料藥導(dǎo)致中藥中化學(xué)成分多種多樣化合物的多樣性又繼而導(dǎo)致中藥表現(xiàn)出有多個(gè)效應(yīng)器官、多種作用和多個(gè)作用靶點(diǎn)。另外,中藥的臨床應(yīng)用形式多以復(fù)方為主,復(fù)方中多味藥的配伍應(yīng)用使得中藥的研究更為復(fù)雜和困難。復(fù)方的研究中既需要研究各單方中各化學(xué)成分的生物活性,又需要研究各單方之間的配伍規(guī)律及其協(xié)同作用方式等。因此,中藥復(fù)雜體系的作用機(jī)制研究中迫切需要應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展的新技術(shù)和新手段,探索適合中藥研究的新方法和新模式,才有可能真正揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,使其“復(fù)雜而可知”。中藥包括復(fù)方的現(xiàn)代化研究一直是中醫(yī)藥界多年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)。近年來(lái),我國(guó)政府已經(jīng)制定了一系列與中藥及其復(fù)方現(xiàn)代化研究相關(guān)的綱領(lǐng)性文件和全局性規(guī)劃。在2007年的《中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》中明確提出“充分運(yùn)用中國(guó)所具有的中醫(yī)、西醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合三支力量共同發(fā)展的歷史積累和獨(dú)特經(jīng)驗(yàn),以及現(xiàn)代系統(tǒng)科學(xué)與復(fù)雜科學(xué)等理論和方法,對(duì)中醫(yī)藥學(xué)蘊(yùn)含的生命科學(xué)問(wèn)題開展廣泛深入的研究和探索在豐富和發(fā)展中醫(yī)藥理論和方法學(xué)體系的同時(shí),爭(zhēng)取在與中醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵相關(guān)的若干問(wèn)題上取得突破”。同一時(shí)期,2007年7月NATURE雜志一篇專門談?wù)撝嗅t(yī)藥的文章里也指出,“中醫(yī)藥要想取得突破性進(jìn)展,必須依靠系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)”。系統(tǒng)生物學(xué)(SystemsBiology)的概念于1999年由LeroyHood提出,是指對(duì)一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分(基因、mRNA、蛋白質(zhì)等)的構(gòu)成及其在特定條件下這些組分之間的相互關(guān)系的研究,其認(rèn)識(shí)生物的觀點(diǎn)是從局部觀走向整體觀。系統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為生物系統(tǒng)具有“整體、層次、整合、動(dòng)態(tài)”的特點(diǎn),生物機(jī)體內(nèi)存在通過(guò)層次之間、網(wǎng)絡(luò)之間、系統(tǒng)之間的整合和聯(lián)系建立的無(wú)數(shù)個(gè)大小網(wǎng)絡(luò),而不同網(wǎng)絡(luò)之間的信息整合和傳遞使基因或蛋白質(zhì)產(chǎn)生出最終的生物學(xué)功能。系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)平臺(tái)是各種組學(xué)如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等正是這些組學(xué)技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了大量的生物學(xué)數(shù)據(jù),在對(duì)這些數(shù)據(jù)的分析(利用生物信息學(xué))中可以獲得對(duì)細(xì)胞、組織、器官和生物體不同水平的各種分子結(jié)構(gòu)和功能及其相互作用的了解,并通過(guò)計(jì)算生物學(xué)/生物信息學(xué)來(lái)描述和預(yù)測(cè)生物功能、表型和行為。系統(tǒng)生物學(xué)應(yīng)用于中藥研究的研究思路的提出,為中藥復(fù)雜體系的研究提供了嶄新的思路和方法,成為目前中藥現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)。迄今為止,不少科研工作者都在系統(tǒng)生物學(xué)思路指導(dǎo)下開展了對(duì)中藥復(fù)雜體系的研究。目前,在基因組測(cè)序已經(jīng)完成即對(duì)基因組靜態(tài)的堿基序列已經(jīng)清楚之后,系統(tǒng)生物學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了后基因時(shí)代,蛋白質(zhì)組學(xué)等基因功能學(xué)的研究成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的重點(diǎn)。以下重點(diǎn)介紹蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容、研究技術(shù)及其在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用。1蛋白質(zhì)組的概念蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)研究可以稱為是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代的里程碑,同時(shí)也是功能基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)組(proteome)這一概念最早是由澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams學(xué)者在1994年第一屆意大利錫耶納蛋白質(zhì)會(huì)議上提出,并在1996年發(fā)表了相關(guān)綜述。蛋白質(zhì)組(proteome)是指在一種細(xì)胞、組織或生物體中的完整基因組所對(duì)應(yīng)的全套蛋白質(zhì),而蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)就相應(yīng)是指研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組的組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。1.1蛋白質(zhì)組學(xué)和復(fù)配蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容包括表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、比較蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)四方面的內(nèi)容。(1)表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)是指采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分離鑒定某一細(xì)胞、組織或完整生物體內(nèi)盡可能多以至于接近全部的蛋白質(zhì),建立完整的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜以及相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)是從大規(guī)模、系統(tǒng)性的角度來(lái)研究蛋白質(zhì)組學(xué),這也更加符合蛋白質(zhì)組學(xué)研究的本質(zhì);但是由于蛋白質(zhì)的表達(dá)隨著時(shí)間和空間不斷變化,要徹底分析生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)將是一個(gè)難以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。(2)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)是指對(duì)通過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)得到的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的精確測(cè)定。(3)比較蛋白質(zhì)組學(xué)是采用蛋白質(zhì)組學(xué)整體分析技術(shù),針對(duì)不同時(shí)間和空間動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較,分析不同處理組之間蛋白質(zhì)組在表達(dá)水平、表達(dá)數(shù)量和修飾狀態(tài)的差異。通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法考察不同時(shí)期不同環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的變化,繼而發(fā)現(xiàn)并研究差異表達(dá)的蛋白質(zhì)及其功能,不僅可以了解疾病的發(fā)病機(jī)制,尋找到與疾病診斷相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)和藥物治療相關(guān)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn),而且也可以揭示物理、化學(xué)和生物因素干擾疾病發(fā)生的分子機(jī)制。在藥物包括中藥的作用機(jī)制研究中,應(yīng)用最多的就是比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。(4)功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括蛋白質(zhì)修飾狀態(tài)(如磷酸化、糖基化、泛素化、乙?；?、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)表達(dá)后在細(xì)胞內(nèi)定位等的研究,從而構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的圖譜以及復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,其研究?jī)?nèi)容日益細(xì)化。例如,蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的也是最常見的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生命周期中,大約有1/3蛋白質(zhì)發(fā)生過(guò)磷酸化修飾。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和分析方法研究蛋白質(zhì)的磷酸化修飾,可以從整體上觀察細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化,由此衍生出磷酸化蛋白組學(xué)(phosphoproteomics)這一新研究領(lǐng)域。1.2蛋白質(zhì)的制備和分離蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)包括:(1)蛋白質(zhì)組樣品的制備;(2)蛋白質(zhì)組樣品的分離;(3)蛋白質(zhì)的生物質(zhì)譜鑒定;(4)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的鑒定。1.2.1細(xì)胞蛋白的分離和純化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備的要求是盡可能完整地將所有蛋白質(zhì)從細(xì)胞或者組織中提取出來(lái),是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首要步驟。常用樣品來(lái)源有體外培養(yǎng)細(xì)胞、活體組織標(biāo)本、血清和體液等。使用體外培養(yǎng)細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)μ囟ǖ募?xì)胞組分或者亞組分進(jìn)行分析,不足之處在于培養(yǎng)細(xì)胞不能完全反映體內(nèi)的真實(shí)情況,且受實(shí)驗(yàn)條件等因素影響,研究結(jié)果存在偏差。從活體組織標(biāo)本中提取細(xì)胞蛋白,應(yīng)避免血管組織、血細(xì)胞、周圍結(jié)締組織和間質(zhì)等的污染。如果需要進(jìn)行組織中單類細(xì)胞的分離,可采用機(jī)械方法、免疫磁珠、熒光標(biāo)記細(xì)胞分選或近來(lái)發(fā)展較快的且被普遍看好的激光捕獲微切割技術(shù)(1asercapturemicrodissection)方法進(jìn)行。從復(fù)合組織中特異性分離出特定的單一細(xì)胞或細(xì)胞群體,這樣可以避免組織異質(zhì)性其他蛋白質(zhì)成分對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)分析的干擾和影響,確保研究結(jié)果的可靠性。用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)樣品通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分,也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí),即采用差速離心和密度梯度離心等方法根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級(jí),如可分離出細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體或高爾基體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)成分。其他預(yù)分方法還有如用親和層析的方法對(duì)有磷酸化修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行富集,只進(jìn)行磷酸化蛋白的研究等。1.2.2在蛋白質(zhì)組中分離樣品蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)主要包括基于蛋白質(zhì)的分離(以雙向電泳為例)和基于肽的分離(以先酶解后再進(jìn)行液相色譜分離為例)兩大類。1.2.3質(zhì)化裝置的質(zhì)譜條件如果說(shuō)在蛋白質(zhì)的分離中各種技術(shù)方法是并存的,那么在蛋白質(zhì)的鑒定中,質(zhì)譜作為主流技術(shù)的地位已無(wú)可爭(zhēng)議,質(zhì)譜已經(jīng)成為最常用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)早在20世紀(jì)初就已經(jīng)出現(xiàn),但當(dāng)時(shí)一直應(yīng)用于有機(jī)小分子領(lǐng)域,直到20世紀(jì)80年代質(zhì)譜技術(shù)才漸漸進(jìn)入生物大分子領(lǐng)域。隨著20多年來(lái)的發(fā)展和應(yīng)用,質(zhì)譜技術(shù)逐步取代傳統(tǒng)的氨基酸組成分析和Edman降解測(cè)序,成為蛋白質(zhì)鑒定的主流技術(shù)、核心技術(shù)和支撐技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是將蛋白質(zhì)樣品先經(jīng)過(guò)離子化后,然后根據(jù)不同離子間質(zhì)子與電荷之比(m/z)的差異來(lái)分離并確定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。因此,用于蛋白質(zhì)鑒定的各種質(zhì)譜儀均由樣品離子化裝置、離子檢測(cè)器以及質(zhì)量分析器3個(gè)最基本的部分組成。樣品離子化裝置采用典型的“軟電離”的方式電離蛋白質(zhì)樣品分子。所謂“軟電離”是指在蛋白質(zhì)樣品分子電離這一過(guò)程中,由于沒有直接的外界能量作用于樣品分子,所以對(duì)樣品分子結(jié)構(gòu)破壞較少,從而保留整個(gè)蛋白質(zhì)分子的完整性,不會(huì)形成碎片離子。蛋白質(zhì)樣品分子“軟電離”常用的兩種離子化方法是基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)和電噴霧離子化(ESI)以及由它衍生出的納電噴霧離子化(nano-ESI)。目前最常用的質(zhì)量分析器包括傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR/FT)、線性離子阱質(zhì)譜(LIT/LTQ)、四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜(QIT)和飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)4種。例如,配有基質(zhì)輔助激光解析/電離的飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)非常適用于鑒定2-DE分離的蛋白點(diǎn),其原理是通過(guò)利用基質(zhì)吸收激光的能量從而使固相的蛋白質(zhì)樣品分子離子化,在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道,進(jìn)入質(zhì)量分析器的離子化肽段因?yàn)橘|(zhì)荷比(m/z)的差異而發(fā)生分離,樣品質(zhì)荷比(m/z)與飛行時(shí)間呈正比,根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而達(dá)到檢測(cè)目的。通過(guò)測(cè)量肽段離子的相關(guān)參數(shù),可以獲得蛋白質(zhì)樣品分子肽質(zhì)量指紋(PMF)、肽序列標(biāo)簽(PST)或部分氨基酸序列等相關(guān)信息,然后通過(guò)適當(dāng)?shù)能浖褜は嚓P(guān)的基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù),實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)分子的定性鑒定。該方法操作簡(jiǎn)單、高效、快速,其最大的優(yōu)點(diǎn)在于離子電荷通常為1~2個(gè),而不是多電荷離子,這對(duì)于分子質(zhì)量較大的樣品而言,不會(huì)形成復(fù)雜的多電荷圖,有利對(duì)圖譜清楚的解析,適用于高通量大樣本的蛋白質(zhì)組的篩選與分析。此外,該技術(shù)對(duì)于樣品中雜質(zhì)的容忍程度已相對(duì)較好,排除了因鹽類物質(zhì)以及組織不純等影響蛋白質(zhì)樣品分子解吸效率不穩(wěn)定的因素。但該技術(shù)對(duì)小分子量蛋白質(zhì)(特別是相對(duì)分子質(zhì)量<50000)檢測(cè)效果較差,鑒定到的蛋白質(zhì)分子量覆蓋度明顯小于其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。因此,鑒于不同質(zhì)量分析器在物理原理和分析性能方面有不同的特點(diǎn),通過(guò)重組不同性能的質(zhì)量分析器,可以獲得Q-Q-Q、Q-Q-LIT、Q-TOF、TOF-TOF和LTQ-FTICR等多種“雜交”型的質(zhì)譜。近年來(lái)ThermoFisher公司生產(chǎn)的新型雜交型質(zhì)譜LTQ–Orbitrap是目前生物質(zhì)譜研究領(lǐng)域最優(yōu)秀的儀器之一。1.2.4國(guó)外設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)基因組計(jì)劃的啟動(dòng)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究對(duì)于深入理解蛋白質(zhì)功能與機(jī)理非常重要,同時(shí)也是基于結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理化藥物研發(fā)及設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。在國(guó)際上,美國(guó)首先提出大規(guī)模測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)劃,現(xiàn)在已進(jìn)入第二期的產(chǎn)出階段,其他發(fā)達(dá)國(guó)家(歐盟和日本)也相繼啟動(dòng)了自己的結(jié)構(gòu)基因組計(jì)劃。當(dāng)前國(guó)際發(fā)展趨勢(shì)是以X射線衍射作為解析蛋白質(zhì)原子分辨率結(jié)構(gòu)的主要手段,核磁共振技術(shù)(NMR)和電鏡技術(shù)(EM)及其他新興技術(shù)為輔助手段。1.3生物組織學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用值得一提的是,在基因組學(xué)的發(fā)展過(guò)程中,基因組學(xué)和生物信息學(xué)的結(jié)合為科研工作者獲得了很多非常有價(jià)值的研究成果。與之相似,蛋白質(zhì)組學(xué)與生物信息學(xué)的結(jié)合也是蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的必需要求。生物信息學(xué)是生物學(xué)與信息科學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。生物信息學(xué)是通過(guò)采集、處理、儲(chǔ)存、分析和解釋由各種技術(shù)平臺(tái)(如大規(guī)模DNA測(cè)序、蛋白質(zhì)組研究等)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù),來(lái)闡明和理解這些數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義。生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用基本包括以下方面:(1)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和使用。例如可以建立并使用各種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)雙向電泳圖像數(shù)據(jù)庫(kù)、信號(hào)傳導(dǎo)及蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)、DNA和蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)等等;(2)蛋白質(zhì)未知結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。例如,可以根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)序列數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu),主要是根據(jù)同源系列的比對(duì)和某些關(guān)鍵的氨基酸殘基的位置,以已知三維結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為依據(jù),預(yù)測(cè)未知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu);(3)蛋白質(zhì)未知功能的預(yù)測(cè)。生物信息學(xué)最常用的分析方法是模式識(shí)別,即利用存在于蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)中的某些特殊的特征模體來(lái)識(shí)別標(biāo)志性的序列或者結(jié)構(gòu),以此建立模式,然后在已經(jīng)建立好的已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中,搜集與此相似的模式,來(lái)確定未知蛋白質(zhì)的歸屬,從而預(yù)測(cè)它的功能。比較的方法包括基于序列相似性比較、基于系統(tǒng)發(fā)育譜比較、基于結(jié)構(gòu)域融合比較、基于mRNA表達(dá)類型的比較等。2關(guān)于中藥中蛋白質(zhì)組的用途由于各種疾病的發(fā)生和藥物治療靶點(diǎn)大多數(shù)是在蛋白質(zhì)(酶、受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)水平,因此蛋白質(zhì)組學(xué)非常適用于研究藥物的作用機(jī)制、尋找有效的藥物靶點(diǎn)及開發(fā)新藥。蛋白質(zhì)組學(xué)(結(jié)合生物信息學(xué))在中藥復(fù)雜體系的研究中至少可以有如下幾方面的用途:(1)通過(guò)比較正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)及藥物(中藥中的單體化合物或有效部位或復(fù)方提取物)治療后蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異,尋找藥物的靶點(diǎn)相關(guān)蛋白;(2)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)中藥中單體化合物的可能直接蛋白質(zhì)靶點(diǎn),并用蛋白質(zhì)和化合物相互作用的相關(guān)驗(yàn)證方法(例如表面等離子體共振技術(shù)、化合物與蛋白質(zhì)共結(jié)晶后進(jìn)行X射線衍射等)進(jìn)行驗(yàn)證;(3)利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)和中藥的可能作用靶點(diǎn)繪制出中藥的可能作用網(wǎng)絡(luò),并用生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證;(4)對(duì)于中藥復(fù)方的研究,可以分析復(fù)方中各單方的可能作用靶點(diǎn),利用信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)等推測(cè)各單方之間的可能相互作用,探索復(fù)方的可能配伍機(jī)理。2.1蛋白質(zhì)組學(xué)法通過(guò)比較對(duì)照細(xì)胞或動(dòng)物組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜和給予中藥后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異,可以找到中藥的可能靶點(diǎn)相關(guān)蛋白質(zhì)。目前,這個(gè)方法已經(jīng)在中藥的研究中較廣泛地應(yīng)用,目前蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用實(shí)例大部分屬于此類。該方法已被用于中藥中單體化合物、有效部位及提取物的作用機(jī)制的研究。2.1.1利用組學(xué)和化學(xué)鑒定多聚體糖酸組學(xué)聯(lián)合用藥的研究2003年MacKeiganJP等通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳分離與質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的技術(shù),發(fā)現(xiàn)紅豆杉中分離的單體化合物紫杉醇(paclitaxel/taxol)和MEK抑制劑合用時(shí)改變了RNA-bindingregulatorysubunit/DJ-1PARK7)蛋白和RhoGDP-dissociationinhibitoralpha蛋白的表達(dá)。2004年WenzelU等發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物槲皮素(quercetin)通過(guò)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞凋亡和分化從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)手段鑒定到其影響的一系列蛋白質(zhì)。2005年LeeKH等利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了紫杉醇在人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中的可能靶點(diǎn)相關(guān)蛋白質(zhì)。2006年HaWY等通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)闡明從遠(yuǎn)志科植物烏棒子(Polygalacaudata)中分離的單體化合物euxanthone誘導(dǎo)小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤2a細(xì)胞分化的分子機(jī)制可能是與被激活的轉(zhuǎn)錄因子E2Ftranscriptionfactor5等有關(guān)。2006年ChenDM等利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法考察了芍藥的主要化學(xué)成分芍藥苷(paeoniflorin)能延遲對(duì)于局部缺血性中風(fēng)病理模型大鼠神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制。2006年WangY等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究從湖北黃精提取的薯蕷素(dioscin)對(duì)人髓系白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的細(xì)胞毒性的分子作用機(jī)制,2007年WangY等進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究HL-60細(xì)胞微粒體部分蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化,闡明薯蕷素(dioscin)通過(guò)觸發(fā)線粒體氧化應(yīng)急反應(yīng),從而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡。2008年筆者所在實(shí)驗(yàn)室YueQX等用蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合MALDIMS/MS質(zhì)譜鑒定的方法研究了從中藥?kù)`芝中分離的單體化合物靈芝酸D(ganodericacidD)對(duì)于人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞毒性的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了可能是靈芝酸D靶點(diǎn)相關(guān)蛋白的21個(gè)差異表達(dá)蛋白。2009年WangX等利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)從藤黃中分離的S型藤黃酸(S-gambogicacid)抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)分子靶標(biāo)為stathmin1。2.2.2小鼠臟器相關(guān)蛋白的活性及相關(guān)機(jī)制的作用2008年ChengZX等分析了從中藥重樓(RhizomaParidis)中分離的總皂苷有效部位作用于人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞48h后蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化。2008年筆者所在實(shí)驗(yàn)室MaC等通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法找到了12個(gè)可能與靈芝孢子總多糖(polysaccharides)刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞增殖作用相關(guān)的蛋白質(zhì);筆者所在實(shí)驗(yàn)室YaoY等分別考察了三七總皂苷和丹參總酚酸抗血小板聚集作用的可能靶點(diǎn)相關(guān)蛋白質(zhì),找到了三七總皂苷影響的與血小板聚集、氧化應(yīng)急反應(yīng)以及細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)和丹參總酚酸影響的與鈣動(dòng)態(tài)平衡、抗氧化以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室YueQX等通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合蛋白質(zhì)功能驗(yàn)證等技術(shù)闡明了靈芝總?cè)?Ganodermatriterpenes)與抗腫瘤化學(xué)藥物阿霉素合用對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa的細(xì)胞毒性的分子機(jī)制,其協(xié)同作用機(jī)制可能是通過(guò)增加氧自由基損傷和DNA損傷以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺死腫瘤細(xì)胞。筆者所在實(shí)驗(yàn)室MaC等還考察了多種處理組(對(duì)照、環(huán)磷酰胺處理、靈芝孢子多糖處理和環(huán)磷酰胺加靈芝孢子多糖處理)的小鼠的胸腺組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜,找到了15個(gè)可能與環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用相關(guān)的蛋白質(zhì);在這15個(gè)蛋白質(zhì)中,其中6個(gè)蛋白質(zhì)在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)下的表達(dá)改變可以被合用靈芝孢子多糖所逆轉(zhuǎn),這些蛋白質(zhì)可能與靈芝多糖對(duì)抗環(huán)磷酰胺免疫抑制的能力有關(guān)。2.2.3蛋白質(zhì)組學(xué)及化學(xué)成分組學(xué)研究蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥提取物(包括復(fù)方的提取物)的作用機(jī)制研究中也起到了重要的作用。例如,由熟地黃、當(dāng)歸、白芍和川芎4味中藥藥材組成的四物湯是臨床常用的經(jīng)典補(bǔ)血名方,近年來(lái)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在研究四物湯對(duì)血虛證動(dòng)物和血虛證患者的作用機(jī)制方面取得了較大的進(jìn)展。(1)2004年GuoP等研究了四物湯對(duì)于放射線照射后導(dǎo)致的血虛證小鼠骨髓蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響,發(fā)現(xiàn)四物湯能調(diào)節(jié)骨髓組織糖代謝,促進(jìn)造血生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,可能由此發(fā)揮補(bǔ)血作用,進(jìn)而能逆轉(zhuǎn)放射導(dǎo)致的血虛證。(2)2006年LiuLL等研究四物湯對(duì)于化學(xué)藥物環(huán)磷酰胺損傷導(dǎo)致的血虛證小鼠骨髓蛋白質(zhì)組的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四物湯可能通過(guò)影響與細(xì)胞凋亡、造血干祖細(xì)胞增殖分化有關(guān)的蛋白質(zhì)而促進(jìn)骨髓造血。(3)2008年YangMH等運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)考察了四物湯對(duì)于血虛證患者血清蛋白的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四物湯可能是通過(guò)增強(qiáng)免疫、減輕基因損傷、增加血紅蛋白等途徑治療血虛證。蛋白質(zhì)組學(xué)在其他中藥提取物的作用機(jī)制研究中的應(yīng)用還有如2006年WuH等利用蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫印跡等技術(shù)闡明臺(tái)灣民間真菌藥材樟芝(Antrodiacamphorata)乙醇提取物抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急反應(yīng)、進(jìn)而引起5個(gè)與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生改變有關(guān)。2008年WangCY等通過(guò)基因芯片和蛋白質(zhì)雙向電泳等方法研究臺(tái)灣民間藥材狹葉紫錐菊(echinaceapurpurea)丁醇提取物作用于樹突狀細(xì)胞引起的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的變化,蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果表明12h后被處理細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架和抗氧化應(yīng)急相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)。2009年Nquyen-KhuongT等考察由中藥五味子、大豆、栝樓和西地格絲蘭提取物組成的混合物MINA-05作用于人膀胱癌細(xì)胞72h后蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化,鑒定了多種與細(xì)胞骨架、能量代謝、蛋白質(zhì)降解以及腫瘤抑制相關(guān)的蛋白質(zhì),提示MINA-05抑制膀胱癌細(xì)胞增殖是與腫瘤細(xì)胞周期、代謝、蛋白質(zhì)降解以及生存環(huán)境的改變相關(guān)。2009年LeeTY等考察由茵陳蒿、梔子和大黃等中藥組成的復(fù)方茵陳蒿湯(Yin-Chen-Hao-Tang)作用于肝纖維化的大鼠膽管結(jié)扎模型27d后肝臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯治療大鼠肝纖維化的作用可能與抑制正常肝細(xì)胞的凋亡以及調(diào)控脂類物質(zhì)的生物合成有關(guān)。2.3實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證。例如,筆者所在實(shí)驗(yàn)室與上海生物信息學(xué)研究中心合作,用一種叫INVDOCK的反向?qū)榆浖ふ夷軌蚺c靈芝酸D直接結(jié)合的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。結(jié)果表明14-3-3蛋白可能是靈芝酸D能夠直接結(jié)合的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。對(duì)于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的直接作用蛋白質(zhì)靶點(diǎn),還需要用生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證。筆者所在實(shí)驗(yàn)室采用體外表面等離子體共振技術(shù)(SurfacePlasmonResonance/SPR)分析方法用BIAcore3000儀器對(duì)靈芝酸D和14-3-3蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行了驗(yàn)證。表面等離子體子共振是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。利用金屬薄膜表面的折射率的改變,引起共振角的變化,可以來(lái)推斷金屬薄膜表面的變化。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)是先將目的蛋白質(zhì)固定在鍍有金膜的傳感器芯片表面,將可能與之相互作用的化合物分子溶于溶液流過(guò)芯片表面。檢測(cè)器能跟蹤檢測(cè)溶液中的化合物分子與芯片表面蛋白質(zhì)分子的結(jié)合、解離整個(gè)過(guò)程的變化。除了表面等離子體共振技術(shù)外,還有很多其他的驗(yàn)證蛋白質(zhì)和化合物相互作用的方法。例如,可以制備化合物與蛋白質(zhì)的共結(jié)晶再進(jìn)行X射線衍射確定結(jié)合的具體位點(diǎn);隨后再定點(diǎn)突變蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的序列,考察是否還具有與化合物結(jié)合的能力等等。2.4未分類生物實(shí)體相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)不動(dòng)產(chǎn)層次隨著蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)(包括酵母雙雜交、GST標(biāo)記pull-down、免疫共沉淀、親和色譜、表面等離子共振等)的發(fā)展,目前已經(jīng)獲得了大量的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。目前較大的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)有(1)BIND(TheBiomolecularInteracfionNetworkDatabase)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bind.ca/)。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了所有生物分子例如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、配基、復(fù)合體、基因還有一些未分類的生物實(shí)體的相互作用數(shù)據(jù)。BIND的數(shù)據(jù)來(lái)源包括期刊提交、公眾提交、文獻(xiàn)提取、其他蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入等;(2)DIP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://dip.doe-mbi.U/),專門存放實(shí)驗(yàn)確定的蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù),既包括經(jīng)典實(shí)驗(yàn)手段確定的蛋白質(zhì)相互作用,也包括高通量實(shí)驗(yàn)手段確定的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù);(3)STRING數(shù)據(jù)庫(kù),與BIND、DIP數(shù)據(jù)庫(kù)不同的是,STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string.emb1.de)不僅存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)確定的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),它還存放預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),并對(duì)各種預(yù)測(cè)方法得到的結(jié)果的準(zhǔn)確性給出了相應(yīng)的權(quán)重。在獲得化合物的直接蛋白質(zhì)靶點(diǎn)(通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證)信息和可能蛋白質(zhì)靶點(diǎn)(通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)比較對(duì)照和給予化合物后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化)信息的基礎(chǔ)上,可以利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù),繪制出化合物的靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。例如,本實(shí)驗(yàn)室就用該方法繪制了靈芝酸D的靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于網(wǎng)絡(luò)中的一些預(yù)測(cè)的中間蛋白質(zhì),可以再進(jìn)行深入研究,用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(如RNA干擾、基因過(guò)表達(dá)等)進(jìn)行驗(yàn)證。繪制靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)的方法可能對(duì)于中藥的研究有特別適合之處,因?yàn)橹兴幫峭瑫r(shí)對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生作用,而對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)的作用都不是很強(qiáng)。因此,只有從網(wǎng)絡(luò)的角度才可以獲得對(duì)中藥作用機(jī)制的比較全面的了解。2.5促進(jìn)形成中藥復(fù)方作用機(jī)制中藥復(fù)方是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中醫(yī)臨床用藥的主要形式,也是中藥有別于植物藥或草藥而具有的特色所在。藥有個(gè)性之特長(zhǎng),方有合群之妙用?！熬甲羰埂钡慕M方原則,“相須、相使、相惡”的作用規(guī)律,是傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)整體觀和辯證論治的集中體現(xiàn)。只有充分研究揭示中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理,促進(jìn)中藥的現(xiàn)代化和用于指導(dǎo)新的中藥的開發(fā),才是對(duì)我國(guó)寶貴的中醫(yī)藥最好的繼承和發(fā)揚(yáng)。中藥復(fù)方中各單方之間的相互作用機(jī)制的揭示是中藥研究的關(guān)鍵。筆者所在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了一些將蛋白質(zhì)組學(xué)用于復(fù)方作用機(jī)制研究的嘗試。例如,我們?cè)诜謩e研究丹參總酚酸和三七總皂苷的可能作用靶點(diǎn)的同時(shí)也對(duì)丹參和三七的復(fù)方配伍機(jī)制進(jìn)行了探索性研究。蛋白質(zhì)組學(xué)用于復(fù)方研究的可能研究思路有:2.5.1單因素協(xié)同作用的發(fā)展在獲得關(guān)于復(fù)方中各單方的可能蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的信息后,我們可以用生物信息學(xué)的方法尋找可能發(fā)生協(xié)同作用的機(jī)制。產(chǎn)生協(xié)同作用的可能性包括:(1)不同單方作用于同一蛋白質(zhì)靶點(diǎn),在與該蛋白質(zhì)的結(jié)合中具有協(xié)同作用。關(guān)于這一點(diǎn),可以通過(guò)分析不同單方化合物對(duì)于同一蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)等進(jìn)行研究;(2)不同單方作用于不同蛋白質(zhì)靶點(diǎn),但是這些蛋白質(zhì)屬于同一信號(hào)通路的不同組成部分,因此單方之間存在著信號(hào)通路層面的協(xié)同作用。關(guān)于這一點(diǎn),可以通過(guò)將不同單方的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)在信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)中找到它們參與的信號(hào)通路后進(jìn)行分析。目前,筆者所在實(shí)驗(yàn)室正在用這些方法進(jìn)行丹參三七的分析工作,對(duì)于丹參,我們選取了其中代表性的化合物丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹參素四種化合物進(jìn)行分析;對(duì)于三七,我們選取了其中代表性的化合物三七皂苷及其兩種體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,目前已經(jīng)獲得了一些初步的結(jié)果(待發(fā)表)。2.5.2心肌缺血再灌注損傷在蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí),如果同時(shí)進(jìn)行各單方和復(fù)方的研究,就可以獲得各單方及復(fù)方各自影響的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。通過(guò)比較分析這些表達(dá)譜,可以獲得一些對(duì)復(fù)方作用機(jī)制的了解。例如,筆者所在實(shí)驗(yàn)室用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型考察了丹參、三七、和丹參三七復(fù)方的藥理作用及各處理組動(dòng)物心臟的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。在此模型中丹參三七復(fù)方的藥效作用優(yōu)于單獨(dú)運(yùn)用的丹參或三七。蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果顯示,如果對(duì)與缺血再灌注損傷最為相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)在各處理組進(jìn)行聚類分析,丹參、三七單用能夠不同程度地調(diào)節(jié)缺血再灌注導(dǎo)致的異常蛋白質(zhì)表達(dá);與單方相比,丹參三七復(fù)方能夠使異常的蛋白質(zhì)表達(dá)譜回到最接近假手術(shù)對(duì)照組的水平。這些結(jié)果提示蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化和藥效是吻合的,蛋白質(zhì)表達(dá)譜可以反映復(fù)方優(yōu)于單方的特點(diǎn)(待發(fā)表)。3蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用中藥復(fù)雜體系的研究需要以中醫(yī)藥傳統(tǒng)的理論體系為指導(dǎo),借助現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的研究方法,通過(guò)多技術(shù)輔助、多視角切入、多學(xué)科滲透交叉,才能夠全面、系統(tǒng)、正確地闡明中藥尤其是復(fù)方的作用靶點(diǎn)、作用環(huán)節(jié)和作用過(guò)程。將系統(tǒng)生物學(xué)的理論與方法學(xué)引入中藥的研究領(lǐng)域已經(jīng)初步顯示了其可行性與合理性,“系統(tǒng)生物學(xué)能夠給中藥研究帶來(lái)突破”這一觀念已經(jīng)成為中藥研究者的共識(shí)。蛋白質(zhì)組學(xué)是目前系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用無(wú)疑給中藥的研究帶來(lái)很大的發(fā)展空間。本文綜述了一些將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于中藥研究的成功實(shí)例和目前的一些研究思路?？梢灶A(yù)計(jì),隨著蛋白質(zhì)組學(xué)自身的發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系的研究中一定還會(huì)有更多的用途。另外,要強(qiáng)調(diào)的是,蛋白質(zhì)組學(xué)只是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分之一,很多研究者用系統(tǒng)生物學(xué)的其他技術(shù)平臺(tái)如基因組學(xué)、代謝組學(xué)等也都取得了很好的研究成果。因此,筆者認(rèn)為在中藥復(fù)雜體系的研究中最好綜合應(yīng)用多種系統(tǒng)生物學(xué)關(guān)鍵技術(shù)和手段,把多種手段獲得的結(jié)果進(jìn)行融合,只有這樣才能夠真正發(fā)揮系統(tǒng)生物學(xué)的優(yōu)勢(shì),建立與中醫(yī)整體理論相符的整體研究思路從分子水平上闡明中藥復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理,為中藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化服務(wù)。(1)雙向凝膠電泳O’Farrell等于1975年首先創(chuàng)立,其原理是根據(jù)不同蛋白質(zhì)之間的等電點(diǎn)和分子量差異而分離蛋白質(zhì)的。其中第一向蛋白質(zhì)水平電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,在高壓電場(chǎng)下進(jìn)行等電聚焦電泳(isoelectricfocusing,IEF);第二向蛋白質(zhì)垂直電泳則是常規(guī)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS),是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小的差異導(dǎo)致電泳遷移率的不同而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。雙向電泳的凝膠經(jīng)過(guò)考染或者銀染后,一般一張雙向凝膠上可出現(xiàn)數(shù)百至上千個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。由于雙向電泳對(duì)于蛋白質(zhì)的分離結(jié)果直觀,也便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像軟件分析處理,并能與質(zhì)譜分析鑒定方法相匹配等優(yōu)點(diǎn),因此雙向凝膠電泳至今仍是目前最常用、最經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。不過(guò),雙向電泳也有些不足之處,例如對(duì)靠近IPG膠條極端酸性或堿性蛋白質(zhì)、部分不溶于樣品緩沖液的膜蛋白、低豐度蛋白質(zhì)、疏水性蛋白質(zhì)和相對(duì)分子質(zhì)量特大(>200000)或特小(<8000)蛋白的分離仍有一定的困難;電泳結(jié)果需要染色處理,此項(xiàng)操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力;同時(shí),雙向電泳凝膠的蛋白質(zhì)載樣量有限再加上不同的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合差異較大會(huì)影響一些低表達(dá)蛋白質(zhì)的分離;此外,該技術(shù)尚不能與質(zhì)譜直接聯(lián)用從而難以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。值得一提的是,近10年來(lái),通用(GE)公司在傳統(tǒng)雙向電泳基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新型的高靈敏度熒光染料標(biāo)記的雙向電泳技術(shù)即凝膠內(nèi)差別電泳(differentialingelelectrophoresis,DIGE)技術(shù)逐漸獲得廣泛的接受和應(yīng)用。該技術(shù)最大的特點(diǎn)是在分析中引入了內(nèi)參,通過(guò)將不同蛋白質(zhì)樣品(包括目標(biāo)蛋白質(zhì)樣品和對(duì)照蛋白質(zhì)樣品)標(biāo)記上不同的熒光,將不同蛋白質(zhì)樣品在同一塊電泳膠內(nèi)分離,消除了膠與膠之間的差異,避免了在使用不同凝膠操作過(guò)程中的人為性和偶然性,從而使獲得的結(jié)果更為可信;并且減少了需要進(jìn)行電泳的次數(shù),縮短了實(shí)驗(yàn)需要花費(fèi)的時(shí)間。(2)檢測(cè)蛋白質(zhì)的分離和高效利用目前最常用的也是最有發(fā)展前景的,就是酶解后用多維液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離。單一的液相分離技術(shù)由于自身分離能力的限制,常常不能滿足蛋白質(zhì)復(fù)合物分離的需要。多維液相色譜法是指兩種或兩種以上具有不同原理特性的液相分離方法的優(yōu)化和組合,該技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分析時(shí)歧視效應(yīng)大大減小,并能與質(zhì)譜直接聯(lián)用,從而可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離與鑒定的在線聯(lián)用與操作,有利于蛋白質(zhì)組研究的高通量化和自動(dòng)化。多維液相色譜分離技術(shù)主要包括離子交換色譜與反相液相色譜聯(lián)用分離技術(shù)、雜交相色譜分離技術(shù)、其它混雜的二維色譜技術(shù)和三維色譜技術(shù)等。1)目前最常用于蛋白質(zhì)組學(xué)分離的多維液相色譜技術(shù)是離子交換色譜與反相液相色譜的聯(lián)合使用(Ion-exchangechromatography–RPLC,IEX–RPLC)。離子交換色譜技術(shù)是通過(guò)溶質(zhì)在離子交換色譜固定相上具有不同的保留能力從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品分離的色譜技術(shù)。就蛋白質(zhì)和多肽樣品而言,其表面帶有的電荷與離子交換色譜固定相表面的電荷發(fā)生不同的靜電相互作用,利用這種相互作用的差異從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)或多肽混合物的分離;而反相液相色譜技術(shù)則是根據(jù)溶質(zhì)疏水性的差異分離蛋白質(zhì)或多肽混合物。通過(guò)這兩種色譜模式的有效聯(lián)合使用,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)組份的二維分離。IEX–RPLC的優(yōu)勢(shì)是通過(guò)IEF可以得到很高的樣品容量而RPLC與質(zhì)譜之間有極好的兼容性。當(dāng)然,IEX–RPLC也有缺點(diǎn),那就是分離過(guò)程需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間,完成整個(gè)分離的過(guò)程可能需要幾天的時(shí)間。2)雜交相色譜分離技術(shù)(Hybrid-phasechromatographyseparations)是應(yīng)用一前一后的陰離子或陽(yáng)離子交換柱快速的將等電點(diǎn)范圍寬泛的蛋白質(zhì)或多肽樣品分離為帶正電荷、負(fù)電荷和不帶電荷三部分,從而有利于樣品的檢測(cè)。3)其他混雜的二維色譜技術(shù)(Miscellaneoustwo-dimensionalchromatographytechniques)是用其它的液相色譜分離系統(tǒng)如分子大小排阻色譜(sizeexclusionchromatography,SEC)或靜態(tài)金屬親合色譜(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)與RPLC耦聯(lián),前者已經(jīng)被成功的應(yīng)用于酵母、疫球蛋白融合蛋白和細(xì)胞色素b6f復(fù)合體蛋白質(zhì)組的分析,后者也被報(bào)道成功地改善了對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的識(shí)別和鑒定。4)三維色譜技術(shù)(Three-dimensionalchromatographytechniques)是指對(duì)那些用二維色譜不能充分分離的復(fù)雜樣品,先用另外一種色譜技術(shù)進(jìn)行預(yù)先分離,例如有報(bào)道用SEC預(yù)分離后再用陽(yáng)離子交換色譜(strongcationexchange)串聯(lián)RPLC進(jìn)行人肝組織蛋白質(zhì)組的分離。(1)分子離子化特性是指利用固體基質(zhì)分子均勻地包埋蛋白質(zhì)樣品分子,在激光的照射下,基質(zhì)分子吸收激光能量而蒸發(fā),從而攜帶蛋白質(zhì)樣品分子進(jìn)入氣相,基質(zhì)分子進(jìn)一步將能量傳遞給樣品分子,從而實(shí)現(xiàn)樣品分子的離子化。MALDI比ESI具有更寬的蛋白質(zhì)或者多肽的質(zhì)量分析范圍和更高的鹽離子的耐受性。(2)電離子離子法esi是指將待測(cè)蛋白質(zhì)樣品溶解在溶劑中,以液相方式通過(guò)毛細(xì)管到達(dá)噴口蛋白質(zhì)樣品分子在噴口高電壓的作用下形成帶電荷的微滴,隨著微滴中揮發(fā)性溶劑的蒸發(fā),微滴表面的電場(chǎng)隨半徑減小而增加,當(dāng)?shù)竭_(dá)某一臨界點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)樣品分子以離子方式從液滴表面蒸發(fā)進(jìn)入氣相,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣品分子的離子化。ESI最主要的優(yōu)點(diǎn)是它可以比較容易的耦聯(lián)在線的分離方法;此外,ESI能夠產(chǎn)生帶有多電荷的離子,通過(guò)比較低的質(zhì)荷比界限實(shí)現(xiàn)對(duì)于多電荷的離子進(jìn)行鑒定。(1)蛋白質(zhì)晶體學(xué)檢測(cè)和晶體結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的應(yīng)用自1895年德國(guó)物理學(xué)家倫琴首次發(fā)現(xiàn)X射線以來(lái),X射線的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。作為其重要分支之一的X射線晶體學(xué)