一測多評法在梔子金花丸質(zhì)量評價中的應(yīng)用

一測多評法在梔子金花丸質(zhì)量評價中的應(yīng)用

長期以來，中藥的質(zhì)量主要通過單一指標(biāo)來控制，這很難真正反映中醫(yī)的多效性和完整性。中藥多靶點的作用特點要求對其進行多成分質(zhì)量控制,因此多成分同步測定的質(zhì)量控制模式應(yīng)運而生,但商品化對照品的供不應(yīng)求和多指標(biāo)控制高昂的檢測費用限制了該模式在實際生產(chǎn)、科研和監(jiān)管領(lǐng)域的應(yīng)用?！耙粶y多評”中藥質(zhì)量評價模式為解決該矛盾提供了新思路。該模式提出后在單味中藥材[3,4,5,6,7,8,9,10,11]和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究中得到了廣泛應(yīng)用,但均以同一類型化合物的質(zhì)量控制研究居多。本研究以梔子金花丸中的黃連生物堿、黃芩黃酮和大黃游離蒽醌3種不同結(jié)構(gòu)類型的10個化學(xué)成分為研究對象,探討“一測多評”技術(shù)在中成藥多組分質(zhì)量控制中應(yīng)用的技術(shù)可行性和方法適用性。梔子金花丸始載于《宣明論方》,由梔子、黃芩、大黃、黃連、黃柏、金銀花、知母、天花粉8味中藥組成,梔子金花丸具有清熱瀉火、涼血解毒的功效,用于肺胃熱盛、口舌生瘡、牙齦腫痛、目赤眩暈、咽喉腫痛等。目前的文獻報道中對梔子金花丸的質(zhì)量控制研究主要是借助常規(guī)HPLC進行同類型化合物的含量測定,2010年版《中國藥典》中也僅以梔子苷為檢測指標(biāo),難以真正體現(xiàn)和保證梔子金花丸的內(nèi)在質(zhì)量。依據(jù)梔子金花丸的功效、適應(yīng)癥及各單味藥所含成分已知的藥理作用推測,黃連生物堿、黃芩黃酮和大黃游離蒽醌應(yīng)為其主要藥效成分,因此對小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等10個成分進行質(zhì)量控制可有效地保證該藥的質(zhì)量和藥效。1試劑和儀器ShimadzuLC20A高效液相色譜儀,包括LC-20AT溶液傳輸單元,SIL-20A自動進樣器,SPD-M20A二極管陣列檢測器,LCSolution色譜工作站(日本島津公司);WatersAlliance高效液相色譜儀,包括2695溶劑管理系統(tǒng),2996二極管陣列檢測器,Empower2色譜工作站(美國WATERS公司)。SyncronisC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),Welchromue3ebC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),SpursilTMC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),AccurasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)。對照品鹽酸小檗堿(批號110713-200911,質(zhì)量分?jǐn)?shù)以86.8%計)、黃芩苷(批號110715-201016,質(zhì)量分?jǐn)?shù)以94.0%計)、黃芩素(批號111595-200905)、蘆薈大黃素(批號110795-201007)、大黃素(批號110756-200110)、大黃酚(110796-200716)、大黃酸(批號110757-200206)和大黃素甲醚(批號110758-201013)均購自中國食品藥品檢定研究院,供含量測定用;漢黃芩苷(批號H-019-110325),漢黃芩素(批號H-029-111222)購自瑞芬思生物科技有限公司,HPLC級,純度≥98%。甲醇、乙腈為HPLC級,美國Fisher公司;水為哇哈哈純凈水,其余試劑均為分析純。藥品梔子金花丸為來源于各地藥品零售商店的商品,見表1。2方法和結(jié)果2.1多因素聯(lián)合評價的建立和方法研究2.1.1醇a-乙腈-0.2%磷酸溶液法SyncronisC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相甲醇(A)-乙腈(B)-0.2%磷酸溶液(C),梯度洗脫,0~60min,40%~4%A,0%~60%B;60~90min,4%~10%A,60%~85%B;流速1mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長254nm。色譜圖見圖1。2.1.2超聲處理法取梔子金花丸粉末(過40目篩)約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30min,取出放至室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,過0.22μm微孔濾膜,即得。2.1.3對照品溶液的制備取對照品鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL分別含上述對照品0.0547,0.0410,0.0540,0.2190,0.00568,0.0730,0.00530,0.00640,0.0171,0.00520mg的混合對照品溶液,備用。2.1.4方法研究2.1.4.線性范圍的測定分別精密吸取2.1.3項下的混合對照品溶液1,5,10,15,20,25,30,35μL注入高效液相色譜儀,測定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積。以測得的響應(yīng)信號和被測物的進樣質(zhì)量用最小二乘法進行線性回歸,得到各成分的回歸方程以及線性范圍,見表2。結(jié)果表明,待測成分在如下范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。2.1.4.各化合物甲醚的峰面積計算取2.1.2項下同一份梔子金花丸供試品溶液,于同一日內(nèi)連續(xù)進樣6次,進樣量10μL,測定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積,計算RSD。結(jié)果各待測成分峰面積的RSD分別為1.6%,0.11%,0.10%,0.059%,0.63%,0.11%,0.24%,0.15%,0.18%,1.4%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。2.1.4.測試品溶液的制備取梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司,批號2083009)粉末約0.2g,精密稱定,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,分別于供試品溶液制備后0,2,4,6,8,10,12,24h進樣,測定供試品溶液中小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積,計算RSD。結(jié)果上述各待測成分峰面積的RSD分別為1.7%,0.11%,0.10%,0.058%,0.53%,0.13%,0.34%,0.19%,0.17%,2.7%,結(jié)果表明24h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。2.1.4.含量測定及rsd取同一批號的梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司,批號2083009)粉末(過40目篩)約0.2g,精密稱定,進樣,按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液,分別測定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積,計算含量及RSD。結(jié)果測得上述各待測成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.72,6.17,2.40,17.0,0.300,4.88,0.712,0.616,1.27,0.365mg·g-1,RSD分別為0.79%,1.1%,1.0%,0.61%,0.78%,0.59%,0.86%,0.61%,0.42%,1.4%,結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。2.1.4.加樣回收率試驗取已知含量的梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司,批號2083009)粉末約0.1g(黃芩素的加樣回收試驗取梔子金花丸粉末約0.01g),精密稱定,分別按樣品含量-對照品大約1∶1加入一定量的對照品溶液,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,測定并計算小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的的加樣回收率以及RSD。結(jié)果上述各待測成分的平均加樣回收率分別為100.7%,103.3%,99.89%,103.1%,103.4%,103.4%,102.1%,99.15%,97.66%,100.2%,RSD分別為1.3%,1.0%,1.3%,1.4%,0.69%,0.81%,1.5%,0.50%,0.69%,1.5%,結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。2.2相對校正因子的確定2.2.1各組分相對校正因子的計算按2.1.4.1項下試驗方法和所得各成分回歸方程,以大黃素為內(nèi)參物,根據(jù)相對校正因子計算公式fk/s=ak/as(a為各成分回歸方程的斜率,s為內(nèi)參物,k為其他待測組分),分別計算小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素的相對校正因子,見表3。2.2.2相對校正因子按2.1.3項下方法,平行制備5份混合對照品溶液,分別進樣不同體積,以被測物的峰面積和進樣質(zhì)量用最小二乘法進行線性回歸,得到各待測成分的回歸方程,根據(jù)2.2.1項下的公式計算相對校正因子。5次平行試驗所得小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與大黃素間相對校正因的平均值分別為1.01,0.427,0.541,0.887,1.39,0.793,1.22,1.48,1.01;RSD分別為1.7%,2.5%,2.9%,4.3%,4.1%,2.8%,3.8%,3.1%,3.1%,表明相對校正因子的重復(fù)性良好。2.2.3相對校正因子的適應(yīng)性研究2.2.3.相對校正因子的測定采用SyncronisC18色譜柱分別測定了2臺ShimadzuLC20A高效液相色譜儀和1臺WatersAlliance高效液相色譜儀下各待測成分間的相對校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.83%~4.8%。2.2.3.填料色譜柱的篩選采用ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng),分別測定了SyncronisC18,Welchromue3ebC18,SpursilTMC18,AccurasilC184種不同填料色譜柱下各待測成分間的相對校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.47%~3.1%。2.2.3.流速對各待測成分間各待測因子相對校正因子的影響采用ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng)和SpursilTMC18色譜柱,分別測定了不同流速(0.95,1.0,1.05mL·min-1)下各待測成分間的相對校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.069%~1.6%。2.2.3.柱溫對各待測成分間及其相對校正因子的影響采用ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng)和SpursilTMC18色譜柱,分別測定了不同柱溫(29,30,31℃)下各待測成分間的相對校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.53%~1.2%。2.3試驗組鉻峰的定位2.3.1填料色譜柱的優(yōu)化取2.1.3項下的混合對照品溶液,在ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng)上,分別采用SyncronisC18,Welchromue3ebC18,SpursilTMC18,AccurasilC184種不同填料色譜柱,測定并計算了待測成分小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間的相對保留值和保留時間差。結(jié)果顯示不同色譜柱下各待測成分間的保留時間差的波動較小,RSD<5%;小檗堿、黃芩苷的相對保留值波動較大,RSD分別為14%,7.4%。結(jié)果表明,相對保留值法不適用于梔子金花丸中待測成分“一測多評”方法的定位,保留時間差法較適宜,見表4,5。2.3.2填料色譜柱的確定據(jù)文獻報道,由色譜熱力學(xué)理論可知:在相同的分析條件下,即使采用不同的液相色譜系統(tǒng)或不同的色譜柱,組分的保留時間存在簡單的線性關(guān)系。實驗中,在ShimadzuLC20A高效液相色譜儀,SpursilTM,Welchromue3eb,Syncronis3個C18填料色譜柱;WatersAlliance高效液相色譜儀,SpursilTM,Welchromue3eb,Accurasil3個C18填料色譜柱上,分別取2.1.3項下的混合對照品溶液及2.1.2項下的供試品溶液進樣,測定10個待測成分色譜峰的保留時間,并考察線性回歸法的定位效果,見表6。定位方法:以含n(n≥2)個待測成分的混合對照品溶液分別在2根色譜柱上實測得到的保留時間為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)進行線性回歸,得到待測成分保留時間的回歸方程。將所有待測成分對照品在1根C18色譜柱(參照色譜柱)上的實測保留時間代入回歸方程,計算得到各待測成分在另一色譜柱上的理論保留時間,即計算值。將計算值與實測值進行比較,并以相對誤差評價定位效果。2.3.3定位方法的比較分別將3種定位方法所得結(jié)果以絕對誤差進行評價,見表7。結(jié)果表明,保留時間差法和線性回歸定位法的定位效果優(yōu)于相對保留值法。2.4有待測化合物的測定方法驗證首先,采用外標(biāo)法(externalstandardmethod,ESM)對梔子金花丸中10種待測成分進行多成分同步含量測定,再用QAMS法建立的待測成分間的相對校正因子對其含量進行計算,并將2種方法所得結(jié)果進行比較,以驗證QAMS法用于梔子金花丸中不同類型化合物含量測定的可靠性,見表8。2種方法的測定結(jié)果無明顯差異,相對誤差<5%,提示建立的相對校正因子具有較好的可信度,QAMS計算結(jié)果可靠。3討論3.1小堿、4個麻黃黃酮類成分全波長掃描本實驗采用二極管陣列檢測器,在190~400nm波長下分別對供試品溶液和混合對照品溶液中的待測成分進行了全波長掃描。結(jié)果小檗堿、4個黃芩黃酮類成分在254nm波長附近有明顯吸收,內(nèi)參物大黃素及其他4個大黃蒽醌類成分在254nm波長處為特征吸收;在此波長下,供試品溶液中各待測成分色譜峰分離度良好,且峰純度檢查符合含量測定要求,因此選擇254nm作為檢測波長。3.2單因素考察的確定根據(jù)待測成分的性質(zhì),本實驗分別對提取溶媒(甲醇、50%甲醇、乙醇)、溶媒用量(20,25,50mL)、提取方法(超聲、回流、冷浸)與提取時間(20,30,40min)進行了單因素考察,確定了以25mL甲醇,超聲提取30min的提取方法。3.3相對校正因子的確定黃芩苷、小檗堿、大黃素的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定,對照品來源有保證,且廉價易得,這3種成分作為內(nèi)參物均能體現(xiàn)QAMS法簡便、易操作、低成本的特點。但在進行相對校正因子的耐用性考察時發(fā)現(xiàn):以小檗堿或黃芩苷為內(nèi)參物時,某些成分的相對校正因子波動較大,以大黃素為內(nèi)參物時,各成分間的相對校正因子較穩(wěn)定。故選擇大黃素為內(nèi)參物。3.4多點校正法本實驗分別采用斜率法和多點校正法對待測成分間的相對校正因子進行了計算,所得結(jié)果基本一致。采用多點校正法計算時,在線性范圍兩端的校正點會使該單點校正的結(jié)果產(chǎn)生較大偏移,從而影響相對校正因子的確定;采用斜率法計算,在相關(guān)系數(shù)大于0.999,且斜率/截距>100的情況下測得的相對校正因子較準(zhǔn)確,重復(fù)性好,因此采用斜率法計算。3.5回復(fù)突變法定位待測成分待測成分色譜峰的準(zhǔn)確定位是“一測多評”法成功應(yīng)