人發(fā)角蛋白-膠原海綿復(fù)合生物敷料的制備及對(duì)燒傷的促愈作用

人發(fā)角蛋白-膠原海綿復(fù)合生物敷料的制備及對(duì)燒傷的促愈作用

皮膚燒傷和傷口后，治療的最終目標(biāo)是重建或恢復(fù)皮膚屏障。在達(dá)到這個(gè)目標(biāo)前,一個(gè)性能優(yōu)良的創(chuàng)面敷料可以暫時(shí)替代皮膚的部分功能,提供一個(gè)有利于創(chuàng)面愈合的環(huán)境,等待創(chuàng)面上皮化或過渡到重建永久性皮膚屏障。因此,研制一種既可作為暫時(shí)性敷料用于淺度燒傷創(chuàng)面,以促進(jìn)殘存上皮再生,加速創(chuàng)面愈合,也可作為一種組織誘導(dǎo)材料,用于深度燒傷創(chuàng)面,重建真皮層的燒傷創(chuàng)面覆蓋物,引起越來越多的重視。膠原海綿是由膠原蛋白制成的具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu)的生物敷料,具有良好的止血性能、親水及吸水性,且其粘附性好,可較長時(shí)間的用于創(chuàng)面覆蓋。單純膠原膜易干裂,且降解速率過快、機(jī)械強(qiáng)度小。有人將膠原與殼聚糖、透明質(zhì)酸、纖維粘連蛋白等復(fù)合,可在一定程度上改善其性能,促愈合效果更明顯。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),將人發(fā)角蛋白(HHK)與膠原海綿復(fù)合后制成的材料具有良好的組織相容性,膠原海綿在6周內(nèi)可降解完全,而由Z(慢)、B(中)、F(快)三種組分的HHK編織成的網(wǎng)格在12周內(nèi)可降解完全?；⒄冗?polydatin,PD)作為燒傷創(chuàng)面用藥,具有促進(jìn)結(jié)痂、抗感染等作用,能減少創(chuàng)面滲出,防止水分及電解質(zhì)丟失,加快創(chuàng)面愈合,為用于Ⅱo燒傷較為理想的藥物。聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)為合成的高分子聚合物,通過合成工藝控制有可能使其成為良好的藥物緩釋載體,可以包裹藥物并保持膜的濕潤,在較長時(shí)間內(nèi)緩釋藥物。我們?cè)趯?duì)HHK的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用中提出了一個(gè)全新的組織工程學(xué)概念—在體/原位組織工程。本研究在該理論的指導(dǎo)下,擬以HHK-膠原海綿為支架(植入體內(nèi)),復(fù)合一種可作為藥物(以PD為例)緩釋載體的PHEMA(覆蓋體表),探討其在體內(nèi)原位誘導(dǎo)周圍組織細(xì)胞構(gòu)建真皮的可行性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1體質(zhì)量3g實(shí)驗(yàn)采用8~12周齡SPF級(jí)的雄性SD大鼠15只,體質(zhì)量(380±20)g,購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有的大鼠均飼養(yǎng)在教研室專設(shè)的動(dòng)物房內(nèi),基本設(shè)施齊全,環(huán)境清潔,通風(fēng)、通氣良好,門窗屏蔽性良好。1.1.2藥物、生物、生物胃蛋白酶(1∶3000,北京鼎國生物技術(shù)公司),6-硫酸軟骨素(Sigma公司),SDS(十二烷基硫酸鈉)(上海生工生物工程公司),丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯(分析純,廣東光華化學(xué)廠有限公司),過氧化苯甲酰(化學(xué)純,廣東光華化學(xué)廠有限公司),虎杖甙(本校化學(xué)教研室提取并提供),Elastin(彈性蛋白)兔多克隆抗體、CollagenI(I型膠原蛋白)兔多克隆抗體、山羊抗兔IgG(武漢博士德生物公司),戊二醛豬皮生物敷料(威海華特生物品有限公司)。真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA1-2LD,CHRIST),2001-UV紫外光譜檢測儀(日本島津),光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus),掃描電鏡(日立S-450)。1.2方法1.2.1hsk組成的制備用可控性的物理、化學(xué)處理方法制備具有輕(L)、中(M)、重(S)不同處理程度的三種HHK組分材料(由我校生化教研室肖應(yīng)慶教授提供)。1.2.2水n-3-甲基-5-羥基苯基”的抽提將新鮮成年牛跟腱清洗,除盡殘留脂肪和筋膜,再切成長(3.0±0.5)cm、厚(1.0±0.5)cm的條塊,實(shí)驗(yàn)所用的原材料及器械均用洗必泰溶液(1:1000)浸泡10min消毒,再用0.9%醫(yī)用生理鹽水洗凈材料表面的洗必泰。室溫通風(fēng)(23~27℃)迅速晾干牛腱表面的水分后置于-60℃低溫冰箱中速凍,取出經(jīng)切片(60μm)、稱重后置于0.05mol/L乙酸溶液中(pH3.2),使膠原-乙酸的最終濃度為1.5%~2.5%(W/V),同時(shí)按1.5L抽提液(0.05mol/L乙酸)中含胃蛋白酶120mg的比例,加入胃蛋白酶并混勻,進(jìn)行I型膠原蛋白的抽提。4℃冰箱中抽提48~72h(在此期間每隔4~5h攪拌),數(shù)小時(shí)后,原質(zhì)韌的腱片開始膨脹,至膨脹成“棉絮狀”。4℃條件下10000r/min離心30min,取上清,其上清液即為粗提的I型膠原蛋白。將上清在中性條件下進(jìn)行鹽沉淀,4℃條件下攪拌過夜。待沉淀完全后10000r/min低溫離心30min,沉淀即為Ⅰ型膠原蛋白。將沉淀用冷滅菌蒸餾水作短時(shí)間洗滌后,溶解于0.05mol/L的乙酸中(使?jié)舛葹?.5%~2.5%,W/V),以相同濃度的乙酸作透析外液在4℃條件下透析48h,得精提的Ⅰ型膠原蛋白。短時(shí)存儲(chǔ)于4℃箱備用(其性質(zhì)用SDS電泳方法與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照證實(shí)),然后與6-硫酸軟骨素進(jìn)行初次交聯(lián)。1.2.3h藥-膠原海綿復(fù)合膜的制備將S、M、L三種組分的絲狀HHK以4:3:3的比例編織成網(wǎng)孔大小為1mm×1mm的網(wǎng)格狀支架,與I型膠原蛋白一同置于模具內(nèi),經(jīng)真空冷凍干燥后成膜,其過程即將純的I型膠原蛋白,倒入自制的10cm×16cm玻璃模具內(nèi),震動(dòng)鋪平后,轉(zhuǎn)入-20℃箱預(yù)凍4h以上,再轉(zhuǎn)入-60℃低溫冰箱內(nèi)1h以上,然后快速移入真空冷凍干燥機(jī),冷凍干燥60~72h后制成多孔膜。待樣品溫度回升至室溫,置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)逐步加熱至105℃,取出后室溫下(23~26℃)恒溫24h,即制成HHK-膠原海綿初交聯(lián)膜。將HHK-膠原海綿復(fù)合膜置于0.25%戊二醛溶液中浸泡再交聯(lián)。反復(fù)漂洗后干燥備用。1.2.4通過掃描電鏡和海綿狀結(jié)構(gòu)的測定，確定了臨江海綿的結(jié)構(gòu)1.2.5紫外光譜測定以丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯為甲基丙烯酸羥乙酯的反應(yīng)物,以過氧化苯甲酰為引發(fā)劑,經(jīng)回流、滴加等步驟完成甲基丙烯酸羥乙酯的聚合反應(yīng)。將PD按一定比例溶于乙醇,與制備好的PHEMA載體充分混勻后成膜。取3cm×3cm大小的PHEMA/PD膜,浸于500ml37℃恒溫的蒸餾水中,每隔一定時(shí)間(10min,20min,30min,1h,2h,4h,6h,8h……)從中取5ml浸提液用紫外光譜儀分析,其在波長為285.4nm處有最大吸收峰(由我校化學(xué)教研室完成)。根據(jù)Beer定律:A=εbc[A=吸光度,ε=mol吸光系數(shù),b=光通過溶液的路程(設(shè)定為1cm],c=物質(zhì)的摩爾濃度),可見A與c成正比。吸光度值越大,溶液中PD的含量越高。釋藥度經(jīng)平行3次測定。1.2.6大鼠背側(cè)壁深損傷動(dòng)物模型的制備用盛有85℃的熱水,底徑為1.5cm的小燒杯,緊貼于脫毛后的大鼠背部皮膚15s,制備單個(gè)創(chuàng)面直徑1.5cm的深Ⅱ°燒傷動(dòng)物模型(經(jīng)病理切片觀察),以背部正中線為軸,每只大鼠左右各制作3個(gè)創(chuàng)面。1.2.7手術(shù)方法及術(shù)后隨訪創(chuàng)面制備后3d,對(duì)正中線一側(cè)的3個(gè)創(chuàng)面行切痂、清洗消毒處理,同時(shí)分別覆以實(shí)驗(yàn)組(HHK-膠原海綿-PD/PHEMA復(fù)合生物敷料)、陽性對(duì)照組(戊二醛豬皮組)和陰性對(duì)照組(單純無菌紗布組)的三種敷料(以后統(tǒng)稱創(chuàng)面處理)。另一側(cè)如法炮制。共對(duì)15只大鼠實(shí)施了手術(shù)操作。PD/PHEMA和無菌紗布隔日換藥,觀察創(chuàng)面肉芽組織生長情況。術(shù)后隨機(jī)選取6只大鼠,作6周和8周取材用,以此為對(duì)象,每天觀察并記錄6只大鼠背部的創(chuàng)面愈合情況,以創(chuàng)面完全上皮化為標(biāo)準(zhǔn),記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間;于第7、14、21天分別用透明膠片描記加稱重法計(jì)算創(chuàng)面愈合率。于切痂覆敷料后1、2、4、6、8周,分別隨機(jī)選取3只大鼠,切取整個(gè)創(chuàng)面及其周圍組織,于光鏡下行HE染色形態(tài)學(xué)觀察、新生血管計(jì)數(shù)和膠原纖維及彈性纖維的免疫組織化學(xué)觀察。1.2.8顯示質(zhì)量的測定以隨機(jī)選取的作6周和8周取材用的大鼠為對(duì)象,分別于傷后第7、14和21天采用透明膠片描記加稱重法(即首先將創(chuàng)面面積描繪在透明膠片上,再以此為模板,將質(zhì)地均勻的透明膠片剪成同樣大小,用分析天平稱質(zhì)量。以透明膠片質(zhì)量間接地表示創(chuàng)面面積大小)測定局部創(chuàng)面面積,按下列公式計(jì)算:創(chuàng)面愈合率=[(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積]×100%。1.2.9視野及血管計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)方法為:于第2周取材的組織切片(每組6張切片)上,每張切片在中央?yún)^(qū)及周邊區(qū)各隨機(jī)選取5個(gè)高倍(200倍)視野(0.25mm2),血管計(jì)數(shù)后求平均數(shù)。1.2.1預(yù)防宮腔形成過程中浚血壓的比較新生血管數(shù)和愈合時(shí)間用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析方法(SPSS11.0)比較3組的新生血管數(shù)和愈合時(shí)間,重復(fù)測量方差分析方法分析不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率。以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著水平。2結(jié)果2.1h藥-膠原海綿膜的制備與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可見不同上樣量的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品均在相同位置出現(xiàn)條帶(圖1)。兩次交聯(lián)后的HHK-膠原海綿膜0.1~0.2cm厚,質(zhì)韌,有彈性,隨形性好。掃描電鏡觀察:粗細(xì)不等的膠原纖維呈不規(guī)則立體多孔狀結(jié)構(gòu),80%的孔徑平均在150~200μm。2.3皮膚組織病理學(xué)觀察SD大鼠背部燒傷后,創(chuàng)口邊緣正常組織充血明顯,創(chuàng)面輕度腫脹,無水泡,創(chuàng)面皮膚蒼白無生機(jī)。傷后2~3d,創(chuàng)面壞死組織形成干硬的暗紅色焦痂。2d后換敷料時(shí),見實(shí)驗(yàn)組敷料均緊貼創(chuàng)面,濕度適宜。陽性對(duì)照組豬皮敷料仍呈灰白色,與創(chuàng)面貼附好,無浮動(dòng)感。陰性對(duì)照組創(chuàng)面有少量滲血及滲液。2.4各組大鼠創(chuàng)傷后大鼠皮膚組織的變化燒傷后48h,大量組織變性壞死,表皮及毛囊上皮細(xì)胞腫脹或缺如,胞漿濃縮,核固縮,細(xì)胞界限不清,膠原纖維變性壞死,排列紊亂(圖2、3)。創(chuàng)面處理后2周,各組創(chuàng)面肉芽組織灶形成,成纖維細(xì)胞增殖活躍,并分泌較細(xì)小的膠原纖維填充創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)組較陽性對(duì)照組更明顯(圖4),陰性對(duì)照組次之。新生組織中可見新生的毛細(xì)血管,實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組較陰性對(duì)照組多(P=0.001,P=0.048)。實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組在創(chuàng)面處理后4周均基本愈合,陰性對(duì)照組過半例數(shù)愈合。創(chuàng)面肉芽組織明顯增厚。新生毛細(xì)血管增殖旺盛且管腔增大,陽性對(duì)照組更明顯(圖5~7)。8周后,3組創(chuàng)面均愈合良好。實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組膠原纖維束改造塑形,無瘢痕形成趨勢(圖8)。陰性對(duì)照組愈合的表皮層細(xì)胞對(duì)合不好及真皮層組織排列紊亂(圖9)。2.5免疫組織化學(xué)創(chuàng)面處理后2周,實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面真皮基質(zhì)中I型膠原呈棕黃色細(xì)密條帶狀,且有少量被染成棕黃色細(xì)絲狀的彈性纖維,陽性對(duì)照組不明顯,而陰性對(duì)照組中彈性蛋白無陽性表達(dá)。第4周,實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組均可見真皮基質(zhì)中呈棕黃色粗大的條帶或片狀的I型膠原的強(qiáng)陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組彈性蛋白的陽性表達(dá)較2周時(shí)增加,且較陽性對(duì)照組明顯(圖10)。第6周,實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組的I型膠原表達(dá)無明顯變化,陰性對(duì)照組略有增加。彈性蛋白的免疫組織化學(xué)顯示,陽性對(duì)照組的彈性蛋白表達(dá)較第4周更強(qiáng)(圖11),陰性對(duì)照組中僅見散在表達(dá),呈棕黃色絲狀(圖12)。第8周,膠原纖維束相互融合,免疫組織化學(xué)染色呈棕黃色均質(zhì)狀。彈性蛋白的免疫組織化學(xué)染色,實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組仍可見少量被染成棕黃色的細(xì)絲狀彈性纖維。2.6陰性對(duì)照組與陰性對(duì)照組的比較第2周,新生血管數(shù)的均值(個(gè)):實(shí)驗(yàn)組8.91±4.40個(gè),陽性對(duì)照組6.18±3.41個(gè),陰性對(duì)照組2.45±1.20個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組創(chuàng)面的新生血管數(shù)差異無顯著性(P=0.363),而實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的新生血管數(shù)差異有顯著性(P=0.003),陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組新生血管數(shù)的差異也有顯著性(P=0.022)。2.7實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的平均愈合時(shí)間比較3組平均愈合時(shí)間(d):實(shí)驗(yàn)組為20.625±1.164,陽性對(duì)照組為21.021±1.141,陰性對(duì)照組為28.104±1.014,可見實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組的平均愈合時(shí)間明顯早于陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組平均愈合時(shí)間的差異無顯著性(P=0.387),而實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組平均愈合時(shí)間的差異有顯著性(P=0.000),陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組平均愈合時(shí)間的差異也有顯著性(P=0.000)。2.8傷口愈合率實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組在第7、14、21天的愈合率均較陰性對(duì)照組高,實(shí)驗(yàn)組僅在第14天時(shí)愈合率較陽性對(duì)照組高(表1)。3討論3.1體調(diào)措施種子胞在體/原位組織工程是將可吸收生物支架材料植入體內(nèi),并通過材料本身對(duì)周圍組織自身的種子細(xì)胞激活(或稱成體干細(xì)胞)作用,利用體內(nèi)微環(huán)境和體內(nèi)精確的調(diào)節(jié)機(jī)制在體誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)種子細(xì)胞,“在體/原位”構(gòu)建相應(yīng)的組織或器官,形成在解剖學(xué)、組織學(xué)和功能意義上的組織或器官替代物,從而克服了傳統(tǒng)組織工程化組織或器官構(gòu)建存在的問題。本實(shí)驗(yàn)即是以該理論為基礎(chǔ),探討HHK-膠原海綿-PHEMA復(fù)合生物敷料“在體”誘導(dǎo)周圍組織細(xì)胞構(gòu)建真皮的可行性。3.2復(fù)合敷料對(duì)其缺失的新生血管的作用光鏡下觀察,我們大致可將此燒傷愈合過程分三階段:靜止期(0~1周),肉芽增生期(2~5周)和改建塑性期(6~8周)。靜止期仍可見表皮細(xì)胞的胞漿濃縮,核固縮,膠原纖維變性壞死等。肉芽增生期創(chuàng)面可見明顯的肉芽組織形成,成纖維細(xì)胞增殖活躍,并分泌、合成較細(xì)小的膠原纖維,新生組織中新生的毛細(xì)血管增多。改建塑形期創(chuàng)面均愈合,表皮細(xì)胞層漸增厚,膠原纖維束相互融合而粗大,排列規(guī)則緊密,皮膚附屬器生成。有研究認(rèn)為,創(chuàng)口周圍表皮細(xì)胞增殖移行修復(fù)創(chuàng)面,一方面表皮細(xì)胞可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并減少其膠原的分泌,另一方面成纖維細(xì)胞通過旁分泌能促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖,二者相互協(xié)調(diào)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中也觀察到,覆敷料后第2周,各組創(chuàng)面肉芽組織灶形成,成纖維細(xì)胞增殖活躍,分泌較細(xì)小的膠原纖維填充創(chuàng)面,且實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組的新生組織中可見較多的新生血管。第4周,實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組創(chuàng)面完全上皮化,肉芽組織增厚明顯且新生血管管腔增大;陰性對(duì)照組過半數(shù)的創(chuàng)面完全上皮化。提示新生組織中的新生血管為增殖的表皮細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)更有利于創(chuàng)面修復(fù)。處理后第6周,創(chuàng)面均愈合較好。實(shí)驗(yàn)組膠原纖維束相互融合,變得粗大且排列規(guī)則,而陽性對(duì)照組在靠近表皮層的膠原纖維束之間可見較多空隙,陰性對(duì)照組膠原纖維排列較紊亂;實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組的真皮組織中均可見新生腺體,而陰性對(duì)照組第8周時(shí)愈合的表皮及真皮層細(xì)胞仍排列紊亂。從形態(tài)學(xué)結(jié)果分析:作為復(fù)合敷料的內(nèi)層,HHK-膠原海綿主要是對(duì)燒傷愈合的第二個(gè)階段—肉芽增生期起調(diào)控和促進(jìn)作用,而對(duì)靜止期和改建塑性期的創(chuàng)面影響相對(duì)較小。免疫組織化學(xué)染色觀察:從第2周開始,實(shí)驗(yàn)組彈性蛋白的免疫組織化學(xué)染色陽性結(jié)果說明,HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復(fù)合敷料有望改善燒傷后由于瘢痕增生、新生組織彈性功能差所致的外觀差、功能障礙。敷料對(duì)I型膠原分泌及彈性纖維形成的促進(jìn)作用,有利于加快創(chuàng)面愈合,縮短愈合時(shí)間,提高創(chuàng)面愈合率。通過第2周創(chuàng)面新生血管數(shù)的比較可見,實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組的新生血管數(shù)均較陰性對(duì)照組多,說明兩種敷料對(duì)創(chuàng)面愈合過程中的血管化均有促進(jìn)作用。血管化作用對(duì)創(chuàng)面組織修復(fù)有重要意義,為新生組織、細(xì)胞提供養(yǎng)料,帶走代謝廢