丹參中酚酸類(lèi)成分的測(cè)定及其方法學(xué)考察

丹參中酚酸類(lèi)成分的測(cè)定及其方法學(xué)考察

丹參最早出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，并列為優(yōu)秀。這是嘴唇科植物的丹參saltioragilnigaidale。干燥的根和根莖可以消除淤血、疼痛、活血、凈化和擺脫悲傷。其有效成分分為脂溶性、水溶性兩部分,前者主要含有二萜類(lèi)化合物,后者則為酚酸類(lèi)化合物。研究發(fā)現(xiàn),丹參中的水溶性酚酸類(lèi)成分主要有丹參素(danshensu)、原兒茶醛(protocatechuicaldehyde)、丹酚酸A(salvianolicacidA)、丹酚酸B(salvianolicacidB)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、紫草酸(lithospermicacid)、丹酚酸D(salvianolicacidD)和丹酚酸E(salvianolicacidE)等。現(xiàn)代藥理研究亦證明,丹參酚酸類(lèi)成分具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脈流量及心肌供氧量等作用,是丹參祛瘀、活血的主要活性成分。2010年版《中國(guó)藥典》僅以丹酚酸B為其水溶性成分的檢測(cè)指標(biāo),盡管丹酚酸B含量較高,但仍難以真正體現(xiàn)和保障丹參的內(nèi)在質(zhì)量,傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀要求對(duì)中藥材進(jìn)行多藥效成分指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)。由于丹酚酸B的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,長(zhǎng)期以來(lái)一直面臨對(duì)照品難得、貨源嚴(yán)重緊缺和檢測(cè)成本昂貴的問(wèn)題。那么,如何在對(duì)照品供應(yīng)不足或缺省的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥丹參水溶性成分的整體控制,是目前中藥丹參質(zhì)量控制中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)難題。“一測(cè)多評(píng)”(quantitativeanalysisofulti-componentsbysingle-marker,QAMS)技術(shù)為解決這類(lèi)問(wèn)題提供了一個(gè)可供選擇的方法,這一模式已被2010年版《中國(guó)藥典》一部收載。本文重點(diǎn)探討了“一測(cè)多評(píng)”法在丹參酚酸類(lèi)成分多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)中的技術(shù)適用性和可行性。1材料表面1.1管陣列分離器WatersAlliance高效液相色譜儀,包括2695溶劑管理系統(tǒng),2996二極管陣列檢測(cè)器,Empower2色譜工作站(美國(guó)WATERS公司);ShimadzuLC-20A高效液相色譜儀,包括LC-20AT溶液傳輸單元,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器,LCSolution色譜工作站(日本島津公司)。1.2藥品化學(xué)品檢定所需藥物有丹參素鈉(批號(hào)855-200102),原兒茶醛(批號(hào)110810-200506),迷迭香酸(批號(hào)111871-201001),丹酚酸B(批號(hào)111562-200807)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用;紫草酸購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度均>98%。1.3唇形科植物麻黃tiorrhiz的干燥丹參市售飲片購(gòu)自各地藥材商店/市場(chǎng),經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所王智民研究員鑒定為唇形科植物丹參S.miltiorrhiza的干燥根及根莖。1.4試劑甲醇色譜純,水高純水,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.11個(gè)研究評(píng)估的方法論2.1.1流動(dòng)相a-3%苯甲酸水溶液b/a流動(dòng)相,cXtimateTMC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相:乙腈(A)-3%甲酸水溶液(B),梯度洗脫,0~80min,0%~33%A,流速1mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。理論板數(shù)按丹參素峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。見(jiàn)圖1。2.1.2續(xù)濾液的制備取丹參粉末(過(guò)40目篩)約0.5g,精密稱(chēng)定,置濾紙包中,精密稱(chēng)定,置100mL圓底燒瓶中,精密加入純凈水50mL,稱(chēng)定質(zhì)量,置電熱套(250W,150℃)中加熱回流2h,取下,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用純凈水補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,備用。2.1.3對(duì)照品溶液配制精密稱(chēng)取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B對(duì)照品各約4.00mg,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,配成濃度約為0.4g·L-1的混合對(duì)照品溶液1#,備用。分別精密吸取上述混和對(duì)照品溶液1.5,1.0,0.5,0.25,0.125,0.06,0.03,0.003mL置2mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液2#~9#(質(zhì)量濃度分別約為①0.400g·L-1,②0.300g·L-1,③0.200g·L-1,④0.100g·L-1,⑤0.0500g·L-1,⑥0.0250g·L-1,⑦0.0120g·L-1,⑧0.00600g·L-1,⑨0.000600g·L-1)。2.1.4線性回歸高效液相色譜法分別精密吸取2.1.3項(xiàng)下9個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液10μL注入高效液相色譜儀。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)(峰面積)和被測(cè)物的量,用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得到各成分的回歸方程以及線性范圍。結(jié)果表明:丹參酚酸混合對(duì)照品溶液在如下范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)表1。2.2同時(shí)測(cè)定丹參酚酸phlc的方法研究2.2.1方法的精密度和準(zhǔn)確度取同一份丹參供試品溶液于同1d和3d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣,測(cè)定丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個(gè)酚酸類(lèi)成分的峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果日內(nèi)精密度,各成分峰面積的RSD分別為0.42%,0.43%,0.50%,1.0%,0.57%;日間精密度各成分峰面積的RSD分別為0.67%,0.64%,0.59%,0.78%和0.86%,表明儀器的精密度良好。2.2.2藥材含量測(cè)定取同一批丹參藥材粉末(過(guò)40目篩)約0.5g,精密稱(chēng)定,按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,測(cè)定峰面積,計(jì)算藥材含量及RSD。結(jié)果測(cè)得丹參中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個(gè)酚酸類(lèi)成分的含量分別為0.351%,0.0215%,0.191%,0.231%,3.53%,RSD分別為3.5%,2.2%,1.6%,3.3%和2.0%,表明該方法的重復(fù)性良好。2.2.3rsd測(cè)定取同一份丹參供試品溶液,分別于樣品制備后的第0,1.5,3,4.5,6,7.0,9,12,18,24,36h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果丹參中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個(gè)酚酸類(lèi)成分峰面積的RSD分別為0.44%,1.3%,0.44%,0.86%,0.70%,表明36h內(nèi),供試品溶液的穩(wěn)定性良好。2.2.4加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的丹參粉末約0.25g(丹酚酸B加樣回收率取丹參粉末0.025g)(過(guò)40目篩),精密稱(chēng)定,平行6份,分別按藥材含量-對(duì)照品(1∶1)的比例加入一定量的對(duì)照品溶液,按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD。結(jié)果丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B5個(gè)酚酸類(lèi)成分的加樣回收率分別為100.2%,99.9%,99.9%,100.3%,101.6%,RSD分別為0.41%,0.66%,1.5%,1.0%,1.1%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表2。2.3相對(duì)校正因子的確定2.3.1不同待考物的相對(duì)校正因子及前因子計(jì)算以丹參素鈉為內(nèi)參物,根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式,分別計(jì)算各待評(píng)價(jià)成分原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B與內(nèi)參物丹參素鈉的相對(duì)校正因子,見(jiàn)表3。2.3.2抗省法的適用性和系統(tǒng)適應(yīng)性的評(píng)估針對(duì)可能影響相對(duì)校正因子重現(xiàn)性的一些因素,設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn),重點(diǎn)考察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)相對(duì)校正因子重現(xiàn)性的影響。2.3.2.種高效液相色譜對(duì)人參酚酸相對(duì)校正因子的影響試驗(yàn)在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,采用XtimateTMC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,分別考察了2種不同的高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)丹參酚酸相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果各成分相對(duì)校正因子重復(fù)性良好(RSD<5%)。見(jiàn)表4。2.3.2.色譜柱對(duì)人參酚酸相對(duì)校正因子的影響試驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,采用WatersAlliance和ShimadzuLC-20A2種不同的高效液相色譜系統(tǒng),分別考察了4種不同型號(hào)規(guī)格的色譜柱對(duì)丹參酚酸相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果各成分相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)。見(jiàn)表5,6。2.3.2.相色譜條件對(duì)人參酚酸相對(duì)校正因子的影響試驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,采用WatersAlliance高效液相色譜系統(tǒng)和XtimateTMC18色譜柱,分別考察了不同流速(1.0,1.1mL·min-1)對(duì)丹參酚酸相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果各成分相對(duì)校正因子重復(fù)性良好(RSD<5%)。見(jiàn)表7。2.3.2.色譜柱溫度的確定試驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,采用WatersAlliance高效液相色譜系統(tǒng)和XtimateTMC18色譜柱,分別考察了不同柱溫(35℃和30℃)對(duì)丹參酚酸相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果各成分相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好,見(jiàn)表8。2.4相對(duì)保留值和保留時(shí)間差法“一測(cè)多評(píng)”法色譜峰的準(zhǔn)確定位一般可以采用保留時(shí)間差或相對(duì)保留值等參數(shù)結(jié)合色譜圖整體特征,以及每個(gè)峰的紫外吸收特征來(lái)定位其余待測(cè)成分(a,b,…,i,…)色譜峰。相對(duì)保留值指各待測(cè)成分與內(nèi)參物s間保留時(shí)間的比值,計(jì)算公式:ras=tRa/tRs;保留時(shí)間差指各待測(cè)成分與內(nèi)參物S間保留時(shí)間的差值,計(jì)算公式:ΔtRas=tRa-tRs。本研究分別考察相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果表明相對(duì)保留值的波動(dòng)較為明顯,RSD>5%,不太適合作為待測(cè)成分色譜峰定位的依據(jù),保留時(shí)間差的波動(dòng)相對(duì)較小,因此采用保留時(shí)間差法進(jìn)行丹參中酚酸類(lèi)待測(cè)成分色譜峰的定位較為可行。見(jiàn)表9,10。2.5酚酸類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定首先采用外標(biāo)法對(duì)丹參中5種酚酸類(lèi)成分進(jìn)行多成分同步含量測(cè)定,再用建立的QAMS法對(duì)其含量進(jìn)行計(jì)算,并將2種方法計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行比較,以驗(yàn)證QAMS法用于酚酸類(lèi)多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,2種方法測(cè)得的丹參酚酸類(lèi)成分含量沒(méi)有顯著性差異,相對(duì)偏差<5%,提示建立的方法具有較好的可信度。見(jiàn)表11。2.6計(jì)算含量測(cè)定另取丹參樣品10批,按照QAMS法進(jìn)行含量測(cè)定,利用所建立的QAMS法進(jìn)行10批丹參樣品的實(shí)際測(cè)算,得到其含量計(jì)算值;然后再以多成分同步測(cè)定方法(外標(biāo)法)進(jìn)行反證,進(jìn)一步驗(yàn)證QAMS法的合理性。2種方法測(cè)得的酚酸類(lèi)成分含量無(wú)顯著性差異,相對(duì)偏差<5%,表明建立的QAMS法在丹參酚酸類(lèi)成分檢測(cè)中的適宜性良好,可用于標(biāo)準(zhǔn)的起草與制定,見(jiàn)表12。3相對(duì)校正因子的確定檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用二極管陣列檢測(cè)器,在190~800nm波長(zhǎng)下對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描,并對(duì)相應(yīng)吸收波長(zhǎng)下的供試品色譜圖進(jìn)行了分析,結(jié)果在270~290nm波長(zhǎng)下丹參五種酚酸吸收峰均為最大吸收,且色譜峰分離度良好,全部達(dá)到基線分離,各待測(cè)成分色譜峰純度角均小于純度閾值,表明各色譜峰內(nèi)無(wú)雜質(zhì)干擾。故采用280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。相對(duì)校正因子重現(xiàn)性本試驗(yàn)選用化合物性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定,對(duì)照品相對(duì)易得且價(jià)廉的丹參素鈉為內(nèi)參物,建立該成分與其他4種酚酸類(lèi)成分間的相對(duì)校正因子。通過(guò)對(duì)30余批丹參藥材與飲片的測(cè)定,驗(yàn)證了該色譜方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、系統(tǒng)適應(yīng)性和QAMS法的準(zhǔn)確性,并對(duì)QAMS法的適用性和可行性進(jìn)行了探討研究。結(jié)果表明,QAMS法推算的含量與實(shí)測(cè)法所得含量沒(méi)有顯著性差異,提示試驗(yàn)建立的相對(duì)校正因子具有較好的可信度。丹參含量測(cè)定結(jié)果顯示,藥材中丹參素與原兒茶醛,迷迭香酸,紫草酸及丹酚酸B的相對(duì)濃度比分別約為20/1,3/1,2/1及1/10,因此在對(duì)丹參酚酸相對(duì)濃度比約為1/1的條件參數(shù)進(jìn)行相對(duì)校正因子考察的同時(shí),還根據(jù)藥材中酚酸類(lèi)成分的不同相對(duì)濃度比的條件參數(shù)對(duì)其相對(duì)校正因子進(jìn)行了考察,結(jié)果原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B與丹參素鈉的相對(duì)校正因子分別為6.896,2.927,1.657,1.748,2種條件參數(shù)下的相對(duì)校正因子進(jìn)行比較,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%,表明不同相對(duì)濃度比條件下丹參酚酸的相對(duì)校正因子之間無(wú)顯著性差異。QAMS法待測(cè)色譜峰的定位在本研究中通過(guò)考察相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性,選擇保留時(shí)間差作為色譜峰定位依據(jù)。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表10的統(tǒng)計(jì)中可以發(fā)現(xiàn),不同型號(hào)的色譜柱對(duì)原兒茶醛的選擇性較強(qiáng),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差略大于5%,而對(duì)其余成分的選擇性相對(duì)較弱,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2%左右波動(dòng)。因此為了保證QAMS法待測(cè)色譜峰的準(zhǔn)確定位,可參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》規(guī)定,對(duì)試驗(yàn)所需色譜柱型號(hào)和規(guī)格進(jìn)行規(guī)定,即可獲得滿意結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中建立的丹參酚酸同步測(cè)定的方法同樣適用于丹酚酸A,但是由于丹酚酸A自身化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,因此未對(duì)其進(jìn)行回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丹參的供試品溶液在樣品制備后9.5h內(nèi)、對(duì)照品溶液24h內(nèi)丹酚酸A含量相對(duì)穩(wěn)定,因此在考察上述丹參酚酸類(lèi)成分間相對(duì)校正因子的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性的同時(shí),也對(duì)丹酚酸A與丹參素鈉間的相對(duì)校正因子進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示其相對(duì)校正因子(f丹酚酸A/丹參素鈉=4.254,RSD