類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶的研究進展

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶的研究進展

21世紀以來，由于胚胎透明、發(fā)育迅速、后代眾多，斑點魚逐漸成為遺傳發(fā)育研究領(lǐng)域的重要模式生物。然而,由于斑馬魚的胚胎干細胞(ES)技術(shù)不夠成熟,因此還無法像小鼠那樣通過ES途徑進行基因打靶。最近十幾年來,人們始終在不遺余力地嘗試通過各種途徑在斑馬魚中制備/篩選突變體,并且已陸續(xù)建立了多種方法,例如,ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)化學誘變、TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes)、反轉(zhuǎn)錄病毒插入誘變、基因誘捕(Genetrap)和ZFN(Zincfingernuclease)介導的定點突變等。但是這些方法都有各自的局限性,還沒有一種能夠?qū)崿F(xiàn)對斑馬魚的任意基因進行靶向修飾。直到2009年,有兩組科研人員同時揭示了來自植物病原菌——黃單胞桿菌(Xanthomonasspp.)中TALE(Transcriptionactivator-likeeffector)家族的蛋白結(jié)構(gòu)單元與DNA靶序列之間存在一一對應(yīng)的特異性識別并結(jié)合的秘密,基因組定點突變技術(shù)才打開了新的局面。迄今僅短短3年的時間,人們已經(jīng)利用TALE蛋白這種特殊的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域跟FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)成人工TALE核酸酶(TALEnuclease,簡稱TALEN),建立了理論上能夠?qū)θ我馕锓N進行基因打靶的新技術(shù),并且成功地在體外培養(yǎng)的人類細胞、線蟲、斑馬魚、大鼠、果蠅等17個物種中實現(xiàn)了基因組定點突變(詳見本期另文發(fā)表的綜述“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導的基因組定點修飾技術(shù)”)。由于斑馬魚的反向遺傳學技術(shù)相對于果蠅、線蟲等經(jīng)典模式動物而言更亟待完善,因此,TALEN技術(shù)的建立對于斑馬魚研究領(lǐng)域更有著不同尋常的意義。TALEN技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一是TALEN表達載體的構(gòu)建。天然TALE蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核心部分一般由1.5~33.5個基本重復單元(Repeatunit)串聯(lián)而成,其中每個單元包含34個左右的氨基酸殘基。每個重復單元中第12位和13位的氨基酸殘基稱為重復可變雙殘基(Repeatvariabledi-residue,簡稱RVD),它決定了該單元識別DNA堿基的特異性。常用的RVD包括NI(AsnIle)、HD(HisAsp)、NG(AsnGly)和NN(AsnAsn),分別對應(yīng)識別堿基A、C、T和G。目前人們已報道了多種方法用于構(gòu)建TALE串聯(lián)重復序列(TALErepeats),其中“單元組裝法”(UnitAssembly,UA)是本實驗室建立的一種簡便、可靠的構(gòu)建TALE串聯(lián)重復序列的方法。該方法的起始材料只需要分別對應(yīng)于識別4個堿基的4個TALE基本單元模塊,采用3個常見的限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、NheⅠ和HindⅢ,通過簡單的酶切—連接反應(yīng),即可像搭建積木那樣串聯(lián)組裝出任意長度、任意順序的TALE重復序列。本方法最大的優(yōu)勢在于原理簡單、可操作性強,不需要任何特殊的試劑或儀器,只要掌握了常規(guī)的分子克隆操作技術(shù),就可以用本方法組裝出用戶指定的TALE串聯(lián)重復序列。下面詳細介紹本實驗室采用單元組裝法構(gòu)建人工TALEN表達載體并在斑馬魚中進行基因組定點突變的具體實驗流程與經(jīng)驗。需要指出的是,用本方法構(gòu)建的TALEN同樣可以用于高效、定點突變其他物種或細胞的基因組。1材料表面1.1實驗材料感受態(tài)細菌:用于構(gòu)建TALEN表達載體。性成熟的斑馬魚:用于突變斑馬魚內(nèi)源基因。建議選用實驗室常用的近交系品種。1.2谷物和試劑1.2.1基于pcs2-1-tafk表達載體的回復突變體的構(gòu)建TALE單體質(zhì)粒系列(TALE基本單元模塊載體)(圖1):均為氨芐青霉素(Amp)抗性。共4種,分別稱為pA(NI)、pC(HD)、pG(NN)和pT(NG)。由本實驗室在pMD18-T(TaKaRa)載體骨架的基礎(chǔ)上構(gòu)建,作為組裝TALE串聯(lián)重復序列的起始載體。TALE單體在連入pMD18-T載體時方向可正可反,并不影響TALE重復序列的構(gòu)建。在我們目前所用的4種載體中,pC、pG和pT都是從M13-47到RV-M的方向連入,而pA則是從RV-M到M13-47的方向插入。這類質(zhì)粒的代表性序列詳見補充材料。pCS2-0.5TALE-FokⅠ表達載體系列(簡稱pCS2-FokⅠ表達載體)(圖2):均為氨芐青霉素(Amp)抗性。需成對使用(pCS2-PEAS系列和pCS2-PERR系列配對)。由本實驗室在pCS2載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建?？勺鳛楣羌茌d體,用于插入組裝好的TALE串聯(lián)重復序列,以便最終構(gòu)建出TALEN表達載體。該系列載體除了含有FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域的編碼序列之外,還帶有CMV啟動子/增強子、SP6啟動子、來自SV40的核定位序列(NLS)、3×FLAG標簽(pCS2-0.5TALE-PEAS系列載體)或HA標簽(pCS2-0.5TALE-PERR系列載體)等功能元件。此外,該載體中還預先組裝了TALE重復結(jié)構(gòu)域中3′端的最后0.5個重復單元(識別TALEN靶點中的最后一位堿基),因此,該系列載體包括分別識別A、C、T、G等4種末位堿基的4對(共8種)載體(表1)。這類質(zhì)粒的代表性序列詳見補充材料。構(gòu)建和檢測TALEN載體所需的引物見表2。1.2.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)基NEB限制性內(nèi)切酶:HindⅢ-HF、KpnⅠ、Nhee-HF、NotⅠ-HF或SacⅡ、SpeⅠ-HF。瓊脂糖、DNAmarker、1×TAE、氨芐青霉素、LB瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、2×TaqMasterMix(含染料)(康為世紀,CW0682)、堿性磷酸酶(CIAP,TaKaRa,D2250)、1mol/LTris(pH8.0)、50mmol/LNaOH、70%乙醇、超純水(ddH2O,18M?)1.3設(shè)備和材料1.3.1taen活性檢測所需的儀器(1)構(gòu)建TALEN所需儀器:超凈工作臺(細菌操作用)、細菌培養(yǎng)搖床、臺式離心機、凝膠電泳儀、凝膠電泳槽、凝膠成像儀、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、漩渦振蕩器(Vortex)、NanoDrop(ND-1000Spectrophotometer)、PCR儀(2)在斑馬魚中檢測TALEN活性所需的額外儀器:顯微注射裝置、體視顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、配魚缸、臺式冷凍離心機1.3.2材料細菌培養(yǎng)皿、移液器、移液器吸頭、Eppendorf離心管、PCR管、顯微注射針。2實驗過程2.1tale重復序列的構(gòu)建由于TALE重復序列的結(jié)構(gòu)是串聯(lián)重復、首尾相接的,因此,理論上可以將重復單位中的任意兩個相鄰的氨基酸殘基作為串聯(lián)重復序列的起點和終點進行結(jié)構(gòu)組裝,最后只需要把第一個重復單位和最后一個(或0.5個)重復單位的兩端補齊,即可構(gòu)成完整的TALE重復序列。根據(jù)這一原理,我們選擇TALE重復單位中第11位的絲氨酸殘基(Ser,S)到下一個重復單位中第10位的丙氨酸殘基(Ala,A)之間的序列作為新的重復單位(稱為“替換單元”,圖3A)進行TALE重復序列的構(gòu)建。這樣,我們就可以利用氨基酸密碼子的簡并性,在“替換單元”的一端(N端)設(shè)計一個SpeⅠ的酶切位點,另一端(C端)設(shè)計其同尾酶NheⅠ的酶切位點。利用同尾酶可產(chǎn)生相同的粘性末端、但是連接在一起后又會喪失原有的酶切位點的特點,通過反復的酶切—連接反應(yīng),就可以將所需要的重復單元依次組裝到一起(圖3B)。最后,將TALE重復序列跟FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域的編碼序列整碼(In-frame)連接,即可構(gòu)建出完整的TALEN編碼序列及表達載體(圖3C)。更多關(guān)于構(gòu)建、應(yīng)用和檢測TALEN的各種方法的信息可參考本期另文發(fā)表的綜述“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導的基因組定點修飾技術(shù)”和由本驗室建立的人工核酸內(nèi)切酶(Engineeredendonuclease,EEN)的綜合數(shù)據(jù)庫與知識庫網(wǎng)站EENdb(/)。2.2選擇和確認scope目標點2.2.1tale蛋白表達載體的構(gòu)建應(yīng)用TALEN技術(shù)的首要步驟是選擇并確認基因組的靶位點。由于TALEN中的FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域通常以二聚體的形式起作用,因此,TALEN結(jié)合位點(或稱TALE結(jié)合位點)也需要成對選擇。這樣,一個完整的TALEN靶位點(或簡稱靶點)就包含一個左側(cè)TALE結(jié)合位點及其0位的t堿基和一個右側(cè)TALE結(jié)合位點及其0位的t堿基,以及它們之間的間隔序列(Spacer)。其中,左、右兩側(cè)的TALEN單側(cè)靶點(即TALEN結(jié)合位點)也可稱為“半位點”(Half-site)。除非有特別說明,本文下面提到的TALEN靶點均指由左、右兩個TALE結(jié)合位點(半位點)及其兩側(cè)0位的t堿基加上中間的Spacer所構(gòu)成的完整的靶序列(圖4)。TALE/TALEN單側(cè)靶點(即半位點)及其0位的t堿基的結(jié)構(gòu)通式為:5′-t(N)nN-3′。應(yīng)用本方法構(gòu)建TALEN表達載體建議遵從如下原則選擇靶點(圖4):(1)半位點的方向:TALE蛋白自N端到C端識別并結(jié)合DNA單鏈的方向是從5′端到3′端(圖4)。為了便于FokⅠ結(jié)構(gòu)域形成二聚體,TALEN靶點中左、右兩側(cè)半位點的單鏈方向必須是相反的,即一個半位點設(shè)計在正義鏈上,另一個半位點則需設(shè)計在反義鏈上。(2)半位點的長度:單側(cè)靶點(半位點)最好控制在11~16bp(即n=11~16;這里并不包括0位的t),這樣即能保證靶向的特異性,也不需要太多的構(gòu)建步驟。合成識別大于16bp靶點的TALE重復序列和相應(yīng)的TALEN需要增加酶切—連接的步驟,花費額外的時間和精力;如確有必要也可以選擇。(3)0位堿基(需要特別指出的是,這個0位的t并不需要組裝對應(yīng)的TALE單元模塊):緊鄰單側(cè)靶點(半位點)5′端上游的第一個堿基(稱為第0位的堿基)必須為t(圖3、圖4)。(4)末位堿基:單側(cè)靶點3′端的最后一個堿基(對應(yīng)于TALE中的最后0.5個重復單位)盡量選擇T(因為天然存在的TALE家族蛋白的靶序列中末位為T的占大多數(shù))(圖4)。(5)Spacer的選擇:本方法采用的TALE重復序列與FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域之間相連接的氨基酸殘基數(shù)為63,因此,Spacer的堿基數(shù)最好控制在12~21bp。同時,如果計劃用酶切的方法檢測TALEN的活性與效率,還需要在Spacer中找到一個單一的限制性內(nèi)切酶位點,并且盡量讓這個酶切位點位于Spacer的中間位置。(6)靶點預測工具:可以通過Bogdanove實驗室提供的TALEN靶點預測網(wǎng)站(/)進行靶點預測,也可以先通過NEB公司的網(wǎng)站(/NEBcutter2/index.php)找到酶切位點,再在酶切位點的兩側(cè)人工尋找TALE結(jié)合位點。選擇TALEN靶點時需要考慮的其他問題可參考本文后面的“3常見問題和注意事項”。2.2.2taen打靶實驗由于TALEN的序列特異性較高,靶序列中只要有一個堿基出現(xiàn)錯配(Mismatch)就有可能較大幅度地降低TALEN的活性。因此,選定靶點后,強烈建議實測一下每個實驗室自己養(yǎng)殖的實驗材料(例如斑馬魚、果蠅等動植物個體或體外培養(yǎng)細胞)的實際序列,根據(jù)實測序列調(diào)整靶點的序列,并且最好用同一批(測序確認正確,并且靶序列是純合的)實驗材料進行TALEN打靶實驗,以避免SNP的影響。(1)確認靶點在基因組中的唯一性:在Ensembl網(wǎng)站上分別用單側(cè)靶點序列進行Blast比對,確認該序列在所選用的物種的基因組中是單一位點。否則建議重新選擇靶點。(2)PCR擴增靶點序列:從準備打靶的實驗材料中PCR擴增靶點及附近的序列。引物距離靶點最好大于100bp,PCR產(chǎn)物最好不要超過500bp,并且擴增后為單一條帶。(3)測序確認靶點序列:PCR產(chǎn)物直接送去測序(不要經(jīng)過TA克隆),根據(jù)實測序列調(diào)整或重新選擇靶點。注意應(yīng)選擇測序結(jié)果顯示為單一序列的實驗材料(動植物個體或細胞株)確認靶點,不要選擇含有SNP或其他變異的雜合子。(4)檢測酶切位點的效率:如果計劃采用酶切的方法檢測TALEN活性,則需要對上述PCR產(chǎn)物進行酶切驗證。要求盡量酶切完全,并且電泳后能明顯與原條帶區(qū)分開。(5)遴選實驗材料:根據(jù)后續(xù)打靶實驗的需要,采用上述的PCR與測序策略篩選出足夠量的靶點正確且為純合的實驗材料(動植物個體或細胞株)。2.3talen配置2.3.1tale重復序列的構(gòu)建按示例的格式填寫經(jīng)前述步驟確認過的TALEN靶點信息,并設(shè)計構(gòu)建方案。(2)根據(jù)構(gòu)建方案選擇兩個相鄰的TALE重復載體,分別進行雙酶切與電泳、切膠回收(示例3,圖3B)。用NheⅠ和HindⅢ雙酶切處于TALE重復序列N端(對應(yīng)識別5′端靶序列)的TALE質(zhì)粒,回收得到TALE骨架片段(N端TALE,包含TALE元件和載體骨架;需回收的長度為2.7kb的骨架+m×102bp的TALE元件);用SpeⅠ和HindⅢ雙酶切處于TALE重復序列C端(對應(yīng)識別3′端靶序列)的TALE質(zhì)粒,回收得到TALE元件片段(C端TALE,僅包含TALE元件;需回收的長度為(m×102+16)bp的片段)。此處,m代表載體中所含的TALE重復單元數(shù)。注意:(1)也可以采用其他的酶切組合構(gòu)建同樣的TALE重復載體。例如,可以采用G+TTA的組合構(gòu)建GTTA載體。不過,TALE單載體經(jīng)SpeⅠ和HindⅢ雙酶切后得到的TALE單體片段只有100多bp,如果小片段DNA回收的得率不高,會影響到后續(xù)的連接。因此,最好不要采用C端為單載體的組合(例如,最好不要采用GTT+A的組合)。(2)剩余的膠回收產(chǎn)物可標注清楚后保存于-20℃,以便用于構(gòu)建其他位點。(3)連接、轉(zhuǎn)化,涂氨芐青霉素平板(Amp抗性),37℃培養(yǎng)12h。(4)挑取單克隆菌落,液體培養(yǎng)基培養(yǎng),用M13-47和RV-M引物對進行菌液PCR鑒定。注意:PCR的延伸時間要根據(jù)載體中TALE重復單元的數(shù)目(m)進行調(diào)整(表3):一個TALE單元有102bp,而引物還會在質(zhì)粒骨架上額外擴增168bp,這樣,PCR產(chǎn)物的總長度就是(102×m+168)bp。(5)電泳檢測,將PCR鑒定正確(預期產(chǎn)物長度參見表3)的剩余菌液擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,即完成了本輪組裝,得到了本輪所需的TALE重復序列中間載體。注意:經(jīng)菌液PCR鑒定正確的質(zhì)?？梢宰鳛橹虚g載體存放在-20℃冰箱,以備構(gòu)建其他位點時使用。(6)重復步驟(2)至(5),延長TALE串聯(lián)重復序列,直至達到所需的順序與數(shù)目(圖5)。所得到的載體稱為pMD-TALE(圖5)?！臼纠?】從單載體開始,通過4輪酶切—連接構(gòu)建tnikb左側(cè)半位點TALE重復序列(圖5)(除最后0.5個重復單元之外)的步驟:注意:由于TALE中的最后0.5個重復單元已經(jīng)預先構(gòu)建到pCS2-FokI系列載體中,因此,每一個TALEN單側(cè)靶位點中3′端的最后一個堿基(對應(yīng)于最后0.5個重復單元)不在上述構(gòu)建范圍之內(nèi)!例如,上例中的tnikb左側(cè)半位點的序列應(yīng)為15個堿基:5′-GTTATTTTATCCCCT-3′,在這一步驟中,只需要組裝對應(yīng)于前14個堿基5′-GTTATTTTATCCCC-3′的TALE重復單元即可。(7)TALE串聯(lián)重復序列pMD-TALE構(gòu)建完畢后,挑單克隆做PCR、電泳檢測,選取大小正確的克隆送測序檢驗(用通用測序引物M13-47和RV-M雙向測序)。注意:由于TALE重復序列較長且重復性很強,需要選擇一個技術(shù)較好、質(zhì)量有保證的測序公司,才能保證將雙向的TALE序列拼接完整。2.3.2tale重復序列片段的回收和鑒定為了提高FokⅠ的酶切活性、TALEN靶向的特異性,本方法采用了只能以異二聚體的形式起作用的兩種Sharkeyform的FokⅠ變體(PEAS和PERR)配對使用。此外,pCS2-FokI載體的選用還同時取決于半位點中3′端的最后一個堿基。(8)根據(jù)兩個TALEN半位點最后一位堿基的性質(zhì)選用合適的pCS2-PEAS和pCS2-PERR載體對,用NheⅠ分別單酶切,電泳、切膠回收(5.5kb)。例如:對于tnikb的左側(cè)半位點,由于其最后一位堿基為T,因此應(yīng)選用pCS2-T-PEAS或pCS2-T-PERR。(9)CIAP去磷酸化,快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收后備用。(10)用SpeⅠ和NheⅠ雙酶切“2.3.1”中第(7)步組裝好的TALE重復序列載體pMD-TALE,電泳后切膠回收備用。回收(n×102)bp大小的條帶(n表示pMD-TALE載體中的TALE重復單元數(shù)),得到TALE重復序列片段。(11)將上述去磷酸化的pCS2載體骨架與雙酶切后回收的TALE重復序列片段連接、轉(zhuǎn)化,涂氨芐青霉素平板,37℃培養(yǎng)12h。(12)菌液PCR鑒定TALE重復序列片段的連入方向:根據(jù)“2.3.1”中第(7)步組裝出來的TALE重復序列中的最后一個完整重復單元(3′端)的性質(zhì)選用上游引物(A-For、T-For、C-For或G(NN)-For)。如果這個重復單元跟FokⅠ載體上預設(shè)的0.5個重復單元的RVD相同,則需要向前(5′端方向)尋找一個與該RVD不同的序列作為引物。例如:對于tnikb的左側(cè)半位點,由于其最后一位堿基為T,而最后一個完整重復單元識別的是C,因此應(yīng)選C-For作為上游引物。下游引物63dn位于pCS2-FokⅠ的骨架上。不同位置的上游引物,PCR延伸的時間不同,PCR產(chǎn)物的長度也不同。例如,上游引物對應(yīng)最后一個完整的TALE單元時預期應(yīng)擴增出~350bp的條帶;而每向5′端方向位移一個TALE重復單元,PCR產(chǎn)物就會增加102bp。如果TALE重復序列連入的方向正確,就能擴增出條帶,否則無法擴增出條帶?？蓳?jù)此鑒定連入方向正確的菌落。同時用SP6通用引物測序確認。(13)酶切檢測TALE重復序列片段的連入情況:利用pCS2-TALEN載體上的KpnⅠ和NheⅠ兩個酶切位點對pCS2-TALEN載體進行雙酶切鑒定,可以檢測在上一步的酶切—連接反應(yīng)中是否發(fā)生了TALE重復序列的串連或斷連,同時也可以用來鑒定TALE重復序列連入pCS2-FokⅠ載體的方向(圖6)。pCS2-TALEN質(zhì)粒骨架大小約為5kb,TALE重復序列的大小為(n×102+443)bp。2.4taen活性檢測與斑點魚突變體篩選2.4.1表面活性劑的選擇和pcr的擴增這一步首先通過體外轉(zhuǎn)錄合成編碼TALEN的mRNA,再將成對的mRNA顯微注射到斑馬魚單細胞受精卵中,2~4d后提取基因組DNA,采用限制性內(nèi)切酶酶切法檢測TALEN位點是否發(fā)生突變,同時可以估算TALEN的突變效率。這一步也可以選用直接克隆測序等其他方法代替酶切檢測。(14)線性化TALEN表達載體:通過NotⅠ或SacⅡ酶切線性化鑒定正確的pCS2-TALEN載體對(需要先確認一下NotⅠ或SacⅡ為單一酶切位點)。線性化完全后可直接用快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收。(15)體外轉(zhuǎn)錄TALENmRNA(SP6,Ambion)、回收,溶于20~30μLDEPCH2O中,Nanodrop定量。(16)將左、右兩側(cè)半位點的一對TALENmRNA混和,顯微注射到單細胞期斑馬魚受精卵中,得到F0胚胎(注射量建議:50~150pg/半位點)。同時留一些未注射的同批胚胎作為對照。(17)取2~4dpf注射后表型正常的胚胎,1~5個胚胎為一組,提取基因組DNA,PCR擴增靶點周圍的序列(最好用“2.2.2”中鑒定過的引物)。(18)酶切檢測TALEN在靶點造成的突變。如果有完整的、未切開的PCR條帶(前提是未注射的對照胚胎的PCR產(chǎn)物能夠全部被切開),則說明靶點可能發(fā)生了突變。將未切開的條帶切膠回收,連入T載體,測序鑒定靶點的突變情況(圖8)。未切開的PCR條帶占所有條帶的熒光亮度的百分比可大致反映TALEN的突變效率。2.4.2taen突變株的篩選和活性鑒定這一步首先是檢測F0(Founder)外交得到的F1胚胎,以便篩選出生殖細胞中帶有(可遺傳的)靶位點突變的F0成魚。將這樣的F0成魚外交得到的后代(F1)養(yǎng)大,再通過剪尾逐條檢測F1的靶位點序列,即可篩選出攜帶可遺傳TALEN突變的斑馬魚個體。(19)將TALEN活性>1%(最好能>10%,這樣更便于篩選)、存活率較高(不低于70%)的同批F0胚胎飼養(yǎng)至性成熟(一般電泳結(jié)果中肉眼可見未切開的條帶即可認為TALEN活性>1%)。(20)與野生型(WT)成魚外交,收集F1胚胎。每條F0建議檢測20個以上的F1胚胎。3解決問題和注意事項3.1基因編碼算法(1)靶位點選擇因基因而異,一般而言,靶點靠前比較好,盡量在基因編碼序列(CDS)的前2/3,但是要在ATG之后,這樣突變等位基因(Allele)可編碼的多肽產(chǎn)物較短,更接近無效突變(Nullmutation)。同時還要考慮避免在第一個起始密碼子的下游還存在額外的具有相同閱讀框(in-frame)的起始密碼子。(2)靶點也可選擇在內(nèi)含子和外顯子的交界處,以破壞靶基因的剪接。(3)還要注意靶基因是否有多個不同的剪接變體或轉(zhuǎn)錄變體,注意需要突變的是某一個剪接變體或轉(zhuǎn)錄變體,還是所有的剪接變體或轉(zhuǎn)錄變體。3.2taen的特異性關(guān)于TALEN的脫靶(Off-target)效應(yīng),目前的研究并不多。從僅有的幾篇報道來看,TALEN的特異性很高,脫靶效應(yīng)遠遠低于ZFN。可通過前述的TALEN靶點預測網(wǎng)站(/TALENT/)預測特定基因組中潛在的脫靶位點,然后通過深度測序檢測TALEN的脫靶效應(yīng)。3.3基于tale的小序單元(1)TALE重復序列組裝過程中是以pMD18-T載體作為骨架。該載體骨架僅用于承載TALE重復序列,并不用來表達TALEN蛋白,因此,TALE重復序列的插入方向并不影響其進行酶切—連接的組裝。如果用該載體骨架上的通用引物對TALE重復序列(包括起始載體和中間載體)進行測序驗證,則只要測序結(jié)果正確即可,無論所得到的序列跟預期序列等同還是反向互補,均可用于后續(xù)的組裝步驟。(2)為了盡量降低序列的重復性,本實驗室采用的TALE重復單元中除了RVD之外,某些其它位點(例如第四位的氨基酸殘基)的序列也有可能存在一些差異(例如第四位的氨基酸殘基有可能為A、D或E),但是并不影響使用(圖10)。(3)本方法(“單元組裝法”)在載體構(gòu)建上有一個獨特的優(yōu)點:載體構(gòu)建過程中每一輪產(chǎn)生的中間載體(甚至酶切、回收的產(chǎn)物)都可以保留下來,用于其他TALEN的構(gòu)建。這樣一方面可以避免重復構(gòu)建中間載體,另一方面可以節(jié)省時間和精力,提高構(gòu)建效率。TALEN載體構(gòu)建得越多,中間載體就會積累得越多,這樣新TALEN的構(gòu)建效率也會越來越高。例如,如果預先構(gòu)建好全部16個雙單元載體,就可以直接從雙單元開始構(gòu)建TALEN,而不需要從單載體開始,這樣就可以節(jié)省一輪的時間;如果除了4個單載體之外,還預先構(gòu)建好全部的雙單元(16個)、三單元(64個)和四單元(256個)載體,那么只需要兩輪就可以構(gòu)建出16個完整的TALE重復單元,比從單載體開始可節(jié)省一半的時間。3.4nhe/tale重復序列載體的穩(wěn)定性NheⅠ、SpeⅠ和HindⅢ等內(nèi)切酶也可以選用其他公司的產(chǎn)品。根據(jù)我們的經(jīng)驗,用NheⅠ和HindⅢ雙酶切TALE重復序列載體時有時會出現(xiàn)多余的條帶(預期應(yīng)該只有一個條帶),這有可能是NheⅠ或HindⅢ的星活性造成的。如果出現(xiàn)這種情況,建議改用NEB的HF(highfidelity)酶,同時減少質(zhì)粒的用量(例如<1μg),酶切時間也不要太長(例如控制在2h之內(nèi))。3.5taenmrna的注射量對于新構(gòu)建的TALEN對,可嘗試注射不同的劑量的mRNA,從中選取一個最佳劑量用于制備斑馬魚突變體。一般而言,mRNA的注射量越大,TALEN作用的效率就越高,不過,斑馬魚胚胎的畸形率也會隨之上升、存活率下降;每半位點TALENmRNA的注射劑量超過100pg后胚胎畸形率的上升會更為明顯。根據(jù)我們的經(jīng)驗,劑量范圍可控制在50~150pg/半位點,一般100pg左右為最佳劑量,可兼顧胚胎的存活率和TALEN的效率。在這個劑量下,斑馬魚胚胎的存活率一般可達到90%以上。4斑馬魚幼魚的人工誘導與親水性基因的產(chǎn)生本實驗室在原來已發(fā)表的文章基礎(chǔ)上,增加了針對最后一位堿基(對應(yīng)最后的0.5個TALE重復單元)為A、C和G的FokⅠ載體,并構(gòu)建出了所有的三單元TALE載體(64個)和四單元TALE載體(256個),這樣既擴大了靶點的選擇范圍,又可以節(jié)省載體的構(gòu)建時間。目前,本實驗室利用單元組裝法已成功構(gòu)建了100多對針對斑馬魚不同基因組位點的TALEN,經(jīng)內(nèi)切酶檢測,突變成功率大于70%(未發(fā)表數(shù)據(jù)),這與Cade等最近報道的結(jié)果類似。本實驗室一半以上的TALEN位點的突變效率大于30%,有的甚至接近100%,這充分顯示了在斑馬魚中應(yīng)用TALEN技術(shù)的高效和簡便。其中,本實驗室大部分未檢測到活性的TALEN靶點的信息可參考EENdb網(wǎng)站(/)。斑馬魚性成熟一般需要3個月的時間。如果希望