發(fā)酵工程制藥-種子擴(kuò)大培養(yǎng)

種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的種子擴(kuò)培的過程種子擴(kuò)培的目的種子質(zhì)量的控制菌種選育成品滅菌培養(yǎng)基的優(yōu)化種子培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)物分離純化一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。為什么要進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)？厭氧發(fā)酵罐有氧發(fā)酵罐量細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線不同接種量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響質(zhì)二、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的具體接種量的大小要根據(jù)具體的發(fā)酵過程采用的菌種確定。發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短與接種量的大小有直接關(guān)系，因此在種子擴(kuò)大培養(yǎng)中必須獲得純而壯的種子，而且還要獲得活力旺盛的接種量足夠的培養(yǎng)物。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每只發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。量質(zhì)接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時(shí)間保證產(chǎn)品產(chǎn)量種子擴(kuò)培的目的三、優(yōu)良種子應(yīng)具備的條件菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延滯期短。01生理性狀穩(wěn)定，以便得到穩(wěn)定的菌體生長(zhǎng)過程02菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求03無雜菌污染，以確保整個(gè)發(fā)酵過程正常進(jìn)行；04保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，使最終產(chǎn)物的產(chǎn)量維持穩(wěn)定高產(chǎn)。05三、優(yōu)良種子應(yīng)具備的條件種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的。優(yōu)良種子具備的條件。小結(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程種子擴(kuò)培的過程種子擴(kuò)培的目的種子質(zhì)量的控制菌種選育成品滅菌培養(yǎng)基的優(yōu)化種子培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)物分離純化一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)流程實(shí)驗(yàn)室種子制備階段生產(chǎn)車間種子制備階段斜面培養(yǎng)基中活化扁瓶固體培養(yǎng)基或搖瓶培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，完成實(shí)驗(yàn)室種子制備一級(jí)種子罐，制備生產(chǎn)用種子；視情況確定擴(kuò)大級(jí)數(shù)，完成生產(chǎn)車間種子制備種子移種至發(fā)酵罐若以菌體細(xì)胞為接種物，應(yīng)采取正在旺盛生長(zhǎng)的繁殖期細(xì)胞，菌體細(xì)胞應(yīng)均勻，同步率高。以孢子為接種物，應(yīng)采用易于萌發(fā)的孢子。生理活性強(qiáng)二、對(duì)接種物的一般要求：應(yīng)以高產(chǎn)菌株中分離獲得的純系作為出發(fā)菌株。菌株純度高，性狀穩(wěn)定，不易發(fā)生變異。實(shí)驗(yàn)室種子制備包括孢子的制備搖瓶液體種子制備三、實(shí)驗(yàn)室種子制備如：檸檬酸生產(chǎn)的制種，用麩皮培養(yǎng)基產(chǎn)生大量孢子直接用于種子罐接種。對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子；這樣操作簡(jiǎn)便，不易污染雜菌。對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。如：灰色鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素卡那鏈霉菌生產(chǎn)卡那霉素

谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)谷氨酸1、孢子的制備（1）霉菌孢子的制備細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為1-2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要5-10天細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源豐富、價(jià)廉易得，比瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)孢子量大。（2）霉菌孢子的制備培養(yǎng)的溫度一般為25-28?C。培養(yǎng)時(shí)間一般為4-14天。（3）放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營(yíng)養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。碳氮比以氮少一些為好，避免菌絲大量形成，以利于產(chǎn)生大量孢子。培養(yǎng)的溫度一般為28?C。培養(yǎng)時(shí)間一般為5-14天。2、液體種子制備（1）好氧培養(yǎng)：對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。試管三角瓶搖床

種子罐（2）厭氧培養(yǎng)：對(duì)于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）試管三角瓶

卡式罐

種子罐3、培養(yǎng)基選擇的原則在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。實(shí)驗(yàn)室種子制備的要點(diǎn)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝流程實(shí)驗(yàn)室種子制備培養(yǎng)基的選用原則小結(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程一、生產(chǎn)車間種子制備實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或搖瓶種子移種到種子罐的過程1、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因:

一是成本二是馴化例：檸檬酸發(fā)酵

以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%2、種子罐級(jí)數(shù)的確定一般由菌絲體培養(yǎng)開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)。種子罐級(jí)數(shù)是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。種子罐級(jí)數(shù)取決于：菌種生長(zhǎng)特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量（種子液體積/培養(yǎng)液體積）以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比。對(duì)于生長(zhǎng)快的細(xì)菌，種子用量比例小，故種子罐相應(yīng)也少。如：谷氨酸生產(chǎn)中，采用茄瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于32℃培養(yǎng)7～10h，菌體濃度達(dá)108～109個(gè)/ml，即可接入發(fā)酵罐作為種子。這稱為一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱二級(jí)發(fā)酵。生長(zhǎng)較慢的菌種，如青霉素生產(chǎn)菌種，其孢子懸浮液接入一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)于27℃培養(yǎng)40h，此時(shí)孢子發(fā)芽，長(zhǎng)出短菌絲，再移至含有新鮮培養(yǎng)基的第二級(jí)種子罐，于27℃培養(yǎng)10～24h，菌絲迅速繁殖，獲粗壯菌體，即可移至發(fā)酵罐作為種子。這稱為二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱三級(jí)發(fā)酵。生長(zhǎng)更慢的菌種，鏈霉素生產(chǎn)菌種灰色鏈霉菌，一般采用三級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（四級(jí)發(fā)酵）在小型罐（5～500L）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，這可稱為一級(jí)發(fā)酵。比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子酵母生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。細(xì)菌總結(jié)茄子瓶發(fā)酵罐種子罐霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵孢子懸浮液→一級(jí)種子罐（27℃,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級(jí)種子罐（27℃，10~24小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐種子級(jí)數(shù)確定需注意問題種子罐的級(jí)數(shù)少，有利于簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌幾率。級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。01種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì)。

02種子罐級(jí)數(shù)除了受產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模影響，也與選用工藝條件有關(guān)。如，改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。03孢子懸浮液采用微孔接種法搖瓶菌絲體采用火焰保護(hù)接種或者壓差法種子罐之間采用壓差法接種二、種子罐接種在種子罐接種口周圍設(shè)有溝槽，溝槽內(nèi)注入少量酒精，點(diǎn)燃酒精使接種口被圍在一圈火焰之中；在火焰圈中即可將菌懸液倒入種子罐中?；鹧娣饪诜ń臃N針（含菌懸液或孢子懸液）插入，壓力由0.5－0.6kg/cm2降至0.2kg/cm2

，當(dāng)針插入橡皮塞后，茄子瓶與發(fā)酵罐壓力平衡，降低罐壓，使懸液注入。特點(diǎn)：操作方便，不易染菌，但不宜于菌絲體種子的接種。壓差法接種生產(chǎn)車間種子培養(yǎng)基制培養(yǎng)基的選用原則種子罐級(jí)數(shù)的確定常見的種子罐接種方法小結(jié)種子質(zhì)量的控制措施及案例種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的最終檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是其在發(fā)酵過程中的生產(chǎn)能力。首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子1、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一、種子質(zhì)量的控制和檢測(cè)方法1、菌種穩(wěn)定性的檢查單菌分離，搖瓶測(cè)定生產(chǎn)能力以不低于其原有的生產(chǎn)活力為原則2、雜菌檢查

鏡檢肉湯或瓊脂斜面培養(yǎng)進(jìn)行檢查生化分析

如測(cè)定營(yíng)養(yǎng)消耗的速度、pH變化、溶氧利用情況等3、菌體濃度及形態(tài)菌體形態(tài)、菌體濃度單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻、排列整齊；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。4、pH和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的變化1）pH2）培養(yǎng)液磷、糖、氨基氮的含量5、產(chǎn)物生成量根據(jù)不同培養(yǎng)要求，通過檢測(cè)種子液中產(chǎn)物生成量，判斷種子質(zhì)量種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。6、酶活力檢測(cè)7、種子液的外觀與氣味種子液的外觀如顏色、粘度、氣味可反映種子質(zhì)量的優(yōu)劣。二、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的實(shí)例砂土管斜面孢子大米孢子一級(jí)種子青霉素生產(chǎn)的種子制備工藝流程二級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點(diǎn)：用量少而精，有利于孢子生長(zhǎng)培養(yǎng)條件：25℃、7天,濕度50%左右1、斜面孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松增加比表面積和氧的傳質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L(zhǎng)。培養(yǎng)條件：25℃、7天2、大米孢子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿接種量：200億孢子/噸培養(yǎng)條件：27℃，40小時(shí)3、一級(jí)種子培養(yǎng)基：同上接種量：10%培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時(shí)4、二級(jí)種子目的：菌體生長(zhǎng)青霉素發(fā)酵種子的質(zhì)量要求：菌絲長(zhǎng)稠呈絲狀、菌絲團(tuán)較少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長(zhǎng)共分為6個(gè)期，Ⅰ-Ⅳ為年青期，Ⅳ-Ⅵ期合成青霉素的能力最強(qiáng)種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的判斷指標(biāo)。種子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。青霉素工業(yè)生產(chǎn)種子培養(yǎng)的工藝。小結(jié)種子質(zhì)量的影響因素一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間1.培養(yǎng)基（1）原材料質(zhì)量生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。如：四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對(duì)孢子質(zhì)量均有一定影響。制備霉菌用的大米，其產(chǎn)地、顆粒大小、均勻程度不同，孢子質(zhì)量也不同。蛋白胨加工原料不同（如魚胨或骨胨）對(duì)孢子影響也不同。

原材料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中的無機(jī)離子含量不同如：微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量（2）水質(zhì)的影響地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動(dòng)，影響種子質(zhì)量。（3）菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決方法01030204培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間；嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。2.培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對(duì)多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著影響。溫度過低，菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢；溫度過高會(huì)使菌絲過早自溶如：土霉素生產(chǎn)種子，在高于37℃培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)降低等問題2.培養(yǎng)條件（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大影響。濕度低，孢子生長(zhǎng)快；濕度大，孢子生長(zhǎng)慢

不同濕度對(duì)龜裂鏈霉菌（產(chǎn)土霉素）斜面生長(zhǎng)的影響相對(duì)濕度斜面外觀活孢子數(shù)（×108/支）16.5～19上部稀薄，下部稠，略黃

1.225～36上部薄，中部均勻，發(fā)白

2.340～45一片白，孢子豐富，稍皺

5.72.培養(yǎng)條件（3）通氣量通常需保證足夠的通氣量。

足夠的通氣量，以保證菌種代謝正常，提高種子的質(zhì)量；攪拌可提高通氣效果，促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖，過度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液產(chǎn)生大量泡沫，增加染菌機(jī)會(huì)，增加能耗；絲狀微生物不宜劇烈攪拌

如：在通氣充足下，制備青霉素生產(chǎn)孢子，可使發(fā)酵單位提高一倍。土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子通氣量小有利于發(fā)酵生產(chǎn)（1）培養(yǎng)時(shí)間一般來說，年輕的孢子優(yōu)于衰老的孢子，過于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。3.培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間（2）冷藏時(shí)間3.培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間冷藏對(duì)孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。冷藏時(shí)間對(duì)孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如：土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右，于4℃保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7-8天菌體細(xì)胞開始自溶；而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。例如：在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降低18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。二、影響種子質(zhì)量的因素及控制孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量1.培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高營(yíng)養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2.培養(yǎng)條件（1）溫度適宜的溫度有利于種子生長(zhǎng)。（2）通氣量有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。（3）pH