弓形蟲環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

弓形蟲環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

這是一種特殊的細胞寄生蟲（1908），發(fā)現(xiàn)了在牙齒和動物幫俞（1908）級織尿組織中發(fā)現(xiàn)的獨特細胞寄生蟲。它顯示了一種缺乏營養(yǎng)的狀態(tài)。換句話說，只能將牛仔布轉(zhuǎn)換成鳥類飼料，但不能反向轉(zhuǎn)化。因此,宿主細胞的腺苷成為弓形蟲合成嘌呤最有效的補救來源,而三磷酸核苷水解酶(nucleosidetriphosphatehydrolase,NTPase)在此過程中起關(guān)鍵作用。它可以利用宿主來源的ATP,將其分解成AMP后,被速殖子膜上的5′-核苷酸酶水解生成腺苷,以合成自身所必需的嘌呤核苷酸。編碼該酶的基因具有高度保守性,且其堿基序列在強弱蟲株中略有不同,但目前尚未見將該基因用于診斷的研究報道。弓形蟲因能引起對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展具有嚴重危害的人獸共患弓形蟲病而備受人們的關(guān)注,其診斷方法也在不斷發(fā)展,主要包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢查等。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)自Notomi等于2000年報道以來,以其特異性高、敏感性強、操作簡便、快速等優(yōu)點得到人們普遍應(yīng)用。本研究選取弓形蟲NTPase基因的保守序列為靶基因,建立LAMP診斷方法,以期為后期快速檢測田間樣品奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1基因組dna和血液原蟲病弓形蟲GJS株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患原蟲病課題組分離、保存,犬新孢子蟲基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉群教授惠贈,鸚鵡熱衣原體基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患細菌病課題組提供,柔嫩艾美耳球蟲基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患絳蟲病課題組提供,羊巴貝斯蟲未定種、牛巴貝斯蟲、呂氏泰勒蟲基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所血液原蟲病課題組提供。大腸桿菌JM109、載體pMD19-T均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。1.2實驗動物2月齡長白豬(弓形蟲IHA抗體效價≤1∶4),體重(15±2)kg,由甘肅省蘭州市榆中縣某豬場提供。1.3基因組織、活性成分、kpn、dntps和氨基酸提取試劑盒BstDNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品;PremixTaq酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、dNTPs、基因組提取試劑盒、DL1000DNAMarker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;甜菜堿為Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.4ssr引物的設(shè)計根據(jù)NCBI中的序列(登錄號為L39079),設(shè)計NTPase基因PCR引物,引物由大連寶生物工程有限公司合成(見表1)。構(gòu)建重組陽性質(zhì)粒pMD19-T-NTPase。1.5引物的設(shè)計與合成對弓形蟲NTPase基因用PrimerExplorerV4在線軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計引物,引物由大連寶生物工程有限公司合成(見表2)。1.6ntpase-pcr反應(yīng)體系的構(gòu)建以本試驗中LAMP的端引物F3和B3為PCR引物,以構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒為模板,建立NTPase-PCR反應(yīng)體系,總體系為25μL。1.7反應(yīng)系統(tǒng)的lampLAMP反應(yīng)體系按楊吉飛等的優(yōu)化條件操作。1.8酶切鑒定及鑒定將擴增的目的片段使用軟件PrimerPremier5.0進行酶切位點分析,用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ對LAMP產(chǎn)物進行酶切鑒定,37℃作用4h。反應(yīng)后用10g/L的瓊脂糖進行電泳。1.9lamp特異性試驗利用建立的LAMP方法,對犬新孢子蟲、鸚鵡熱衣原體、柔嫩艾美耳球蟲、呂氏泰勒蟲、羊巴貝斯蟲未定種、牛巴貝斯蟲和弓形蟲基因組DNA進行LAMP特異性試驗。反應(yīng)后用10g/L的瓊脂糖進行電泳。1.10抗lamp敏感性測試1.10.lamp反應(yīng)的敏感性檢測將已知濃度的弓形蟲陽性質(zhì)粒模板定量到100ng/μL(即拷貝數(shù)為1×108copies/μL),然后將其依次稀釋為1×10-1～1×10-88個濃度后檢測LAMP反應(yīng)的敏感性。同時用相應(yīng)濃度質(zhì)粒DNA進行的NTPase-PCR反應(yīng)做比較。反應(yīng)后分別用10g/L的瓊脂糖進行電泳。1.10.lamp和其他dna片段的檢測用弓形蟲GJS株強毒活蟲腹腔接種試驗豬3頭,劑量為1×107/頭。在攻蟲前和攻蟲后第2、3、4天于前腔靜脈采血。以血液基因組為模板,分別進行LAMP檢測和基于529bp重復(fù)DNA片段的PCR檢測。PCR檢測的引物和反應(yīng)體系按Homan等的方法操作。2結(jié)果2.1反應(yīng)條件確定通過優(yōu)化LAMP的反應(yīng)條件,確定本試驗中最佳反應(yīng)條件為65℃30min。將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后,可見明顯的瀑布狀特異性條帶,陰性對照不出現(xiàn)條帶(見圖1)。2.2lamp引物的反應(yīng)性分析用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ對LAMP產(chǎn)物進行酶切鑒定,結(jié)果顯示得到2個大小約為260bp和180bp的片段(見圖2),表明設(shè)計的LAMP引物具有良好的反應(yīng)性。2.3lamp反應(yīng)對犬新孢子蟲、鸚鵡熱衣原體、柔嫩艾美耳球蟲、呂氏泰勒蟲、羊巴貝斯蟲未定種和牛巴貝斯蟲進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示,上述DNA樣品均沒有擴增產(chǎn)物(見圖3),表明該LAMP方法具有很高的特異性。2.4lamp和pcr方法檢測質(zhì)粒的靈敏度以不同濃度的陽性質(zhì)粒pMD19-T-NTPase為模板進行LAMP和PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示,LAMP方法可檢測到20fg重組陽性質(zhì)粒,即檢測限為20copies,PCR方法可以檢測到200fg重組陽性質(zhì)粒,即檢測限為200copies(見圖4、5)。可見本試驗建立的LAMP檢測方法比PCR方法敏感性高10倍。對攻蟲前和攻蟲后第2、3、4天的3頭試驗豬采血提取血液基因組,分別用LAMP方法和PCR方法檢測。結(jié)果顯示,LAMP方法可以在攻蟲后第2天看到清晰的瀑布狀條帶,而PCR方法在攻蟲后第4天出現(xiàn)陽性條帶(見圖6)。3弓形蟲基因檢測LAMP方法是一種簡便、快速的新式基因擴增方法,與PCR相比其最大的優(yōu)勢是反應(yīng)所需的時間短。本研究中,LAMP反應(yīng)在15min便可以檢測到陽性重組質(zhì)粒,而在反應(yīng)進行到30min時,可檢測到20copies重組NTPase基因,敏感性比普通PCR高10倍;而且LAMP方法不需要專門的反應(yīng)儀器,只需恒溫水浴鍋就可以滿足試驗所需;此外,LAMP反應(yīng)結(jié)果可以用濁度儀測其副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀的濁度來觀察。本試驗中LAMP反應(yīng)后沉淀的量很少,故采用瓊脂糖凝膠電泳分析法進行觀察。但是將該反應(yīng)后產(chǎn)物離心,即可用肉眼觀察到沉淀。NTPase約占弓形蟲蟲體總蛋白的2%～8%,在弓形蟲生存和繁殖過程中起重要作用。且在原蟲中只有犬新孢子蟲存在該基因,而其他原蟲如瘧原蟲、柔嫩艾美耳球蟲等均無NTPase存在。因此,本研究選取弓形蟲NTPase基因中216bp片段設(shè)計引物進行LAMP試驗。結(jié)果顯示,包括犬新孢子蟲在內(nèi)的其他蟲株均為陰性,而弓形蟲基因檢測為陽性,說明本方法的特異性良好。本研究對早期感染弓形蟲試驗豬血液,用建立的LAMP方法和Homan等建立的PCR方法進行比較。雖然529bp重復(fù)DNA片段在弓形蟲基因組DNA中有200～300個拷貝,而NTPase基因在弓形蟲基因組DNA中是單拷貝基因,但LAMP方法可比PCR方法提前2d檢測到血液樣本中的弓形蟲,且LAMP反應(yīng)時間大大縮短。在全血中提取DNA時,可能會有一些遺留的PCR的抑制因子而影響PCR反應(yīng)的特異性和敏感性,但這種抑制因子對LAMP反應(yīng)無效。這不但進