麥曲在黃酒釀造中的應(yīng)用

麥曲在黃酒釀造中的應(yīng)用

小麥在大麥的生產(chǎn)中起著重要作用，被稱為“酒的骨架”。一方面,麥曲作為“粗酶制劑”能為黃酒釀造提供各種酶類(包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶等),促進(jìn)原料中各種高分子物質(zhì)水解,這些酶一部分由原料小麥自身帶入,一部分由麥曲中各種微生物分泌產(chǎn)生;另一方面,麥曲在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生各種代謝物,它們作為風(fēng)味物質(zhì)前體,賦予了黃酒獨(dú)特的風(fēng)味。以往對(duì)黃酒麥曲的研究,一般是通過(guò)酶活力的測(cè)定來(lái)衡量麥曲的糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解力等,而對(duì)于這些同功酶的構(gòu)成及其來(lái)源等,往往不能進(jìn)行全面而有效的分析。利用色譜等技術(shù)對(duì)麥曲中單一酶類進(jìn)行純化并開(kāi)展酶學(xué)性質(zhì)的研究,一般只能分析單一種類的酶,不能反映麥曲中所含蛋白種類的整體情況。由此看來(lái),傳統(tǒng)的酶學(xué)研究方法在研究麥曲整體的蛋白質(zhì)構(gòu)成及來(lái)源時(shí)具有較大的局限性。近些年來(lái),迅速發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)組學(xué)及宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則很好地彌補(bǔ)了這些缺陷。KenOda等利用雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析,對(duì)米曲霉在固態(tài)培養(yǎng)和液態(tài)培養(yǎng)條件下的分泌蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析,共鑒定出了29種米曲霉分泌蛋白,發(fā)現(xiàn)固態(tài)培養(yǎng)條件下的特異性分泌蛋白11種,液態(tài)培養(yǎng)條件下的特異性分泌蛋白11種,2種培養(yǎng)條件下都出現(xiàn)的蛋白有7種。Martha等應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了黃曲霉在蘆丁誘導(dǎo)和非蘆丁誘導(dǎo)下分泌蛋白質(zhì)的差異,鑒定出了15種蘆丁誘導(dǎo)的黃曲霉特異性分泌蛋白和7種非蘆丁誘導(dǎo)的分泌蛋白。宏蛋白質(zhì)組學(xué)(Metaproteomics)是2005年被提出的新概念,其定義是指對(duì)某一特定環(huán)境中微生物群落的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的分析和鑒定。利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)理論和方法來(lái)研究麥曲浸提液中的所有可溶性蛋白(理論上應(yīng)包括所有微生物分泌來(lái)源蛋白和可溶性小麥來(lái)源蛋白),目前在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。本文中所指的“宏蛋白質(zhì)組”定義為“黃酒麥曲浸提液中的所有可溶性蛋白質(zhì)”。宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略與經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略相似,主要包括樣品制備、蛋白質(zhì)分離和質(zhì)譜鑒定3個(gè)部分。二者的主要區(qū)別在于樣品來(lái)源的不同:蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要針對(duì)一種微生物、細(xì)胞或組織,樣品來(lái)源清楚,基因組背景單一;而宏蛋白質(zhì)組學(xué)所關(guān)注的是天然生境,樣品組成復(fù)雜。眾所周知,在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,樣品制備的優(yōu)劣往往決定了后續(xù)研究的優(yōu)劣甚至成敗。而宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)象的復(fù)雜性,使得其第一步樣品制備變得非常困難。如何在去除樣品中雜質(zhì)的同時(shí)保持原始的樣品組成,并排除高豐度蛋白的影響,是宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究中樣品制備的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本文以黃酒成品麥曲為研究對(duì)象,應(yīng)用雙向電泳技術(shù),比較了TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-DCleanupKit試劑盒法3種不同制備方法的雙向電泳結(jié)果,初步建立了適用于黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組制備方法,獲得了較為理想的雙向電泳圖譜,為后續(xù)利用質(zhì)譜分析手段對(duì)宏蛋白質(zhì)組中的蛋白組成進(jìn)行全面、準(zhǔn)確鑒定奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小麥的曲線由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司、安徽省古南豐酒業(yè)有限公司、上海金楓酒業(yè)股份有限公司提供。1.1.2免疫抑制劑的制備固相IPG干膠條(pH3～10,NL,7cm)、IPGBuffer(pH3～10)、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA),均為GE公司產(chǎn)品。MineralOil、Bio-RadRCDC蛋白定量試劑盒、ReadyPrepTM2-DCleanupKit試劑盒,為BIO-RAD公司產(chǎn)品。Complete蛋白酶抑制劑混合片,購(gòu)于Roche公司。CHAPS、四甲基乙二胺(TEMED)、脲,為Amersham公司產(chǎn)品。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨,為SunShine公司生產(chǎn)。十二烷基磺酸鈉(SDS),為進(jìn)口分裝純化級(jí)產(chǎn)品,購(gòu)于生工生物?？捡R斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250,為進(jìn)口分裝純化級(jí)產(chǎn)品,牛血清白蛋白、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris堿),為生化級(jí)產(chǎn)品,甘氨酸、甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、丙酮、乙酸鈉,均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用水皆為去離子水。1.1.3儀器、檢測(cè)設(shè)備等電聚焦電泳儀EttanIPGphor3(GE公司),小型垂直電泳槽(BIO-RAD公司),高電流電泳儀(BIO-RAD公司),TY-80S/80B脫色搖床(生興生物技術(shù)有限公司),JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司),Pico&Fresco17微量離心機(jī)(Thermo公司),UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尼龍柯儀器有限公司),FE20K型精密數(shù)顯酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。1.1.4主要溶液(1)乙酸鈉/乙酸鈉溶液和乙酸溶液配制稱取4.1g無(wú)水乙酸鈉溶于適量水中,定容到500mL,取2.86mL冰乙酸加水定容到500mL,分別為0.1mol/L乙酸鈉溶液和乙酸溶液。取適量溶液混合調(diào)至pH4.2。(2)丙酮溶液i三氯乙酸(TCA)50g,DTT1.54g,加丙酮溶解,定容到500mL。4℃保存?zhèn)溆谩?3)丙酮溶液iiDTT1.54g,加丙酮溶解,定容到500mL。4℃保存?zhèn)溆谩?4)溴酚蘭儲(chǔ)存液溴酚藍(lán)100mg,Tris堿60mg,加水定容到25mL。以一定量分裝到EP管中,4℃保存?zhèn)溆谩?5)ffer溶液脲4.8g,CHAPS0.4g,IPGBuffer50μL,加水溶解后定容至10mL。以一定量分裝到EP管中,在-20℃冰箱中保存。使用前每1mL樣品裂解液中加入2.8mgDTT。(6)溴酚藍(lán)儲(chǔ)液的配制脲72.07g,SDS4.0g,1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8),甘油69mL,溴酚藍(lán)儲(chǔ)液400μL,加水溶解后定容至200mL。以5mL為單位分裝,保存到-20℃冰箱中。(7)平衡液體i每5mLSDS平衡緩沖液儲(chǔ)存液,加入DTT50mg,充分溶解。(8)平衡液體ii每5mLSDS平衡緩沖液儲(chǔ)存液,加入IAA125mg,充分溶解。1.2方法1.2.1樣品制備(1)不同濃度酒精的脫酶劑稱取10g麥曲,加入20mL0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和1片Complete蛋白酶抑制劑混合片,充分混勻后置于4℃條件下浸提12h。然后用4層紗布過(guò)濾,濾液在12000r/min,4℃下離心30min。將上清液用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾2次,然后以10000分子截留量的超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮。濃縮后的溶液即為黃酒麥曲的浸提液。Bradford法測(cè)定蛋白含量。(2)麥曲濕地沉淀法:cu-b(A)TCA-丙酮沉淀法:取一定量的麥曲浸提液于離心管內(nèi),加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液I,充分振蕩搖勻后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白,然后4℃,12000r/min離心30min。棄上清液,收集沉淀。加入2mL預(yù)冷的丙酮溶液II,充分振蕩混勻,-20℃放置1h,清洗沉淀,4℃,12000r/min離心15min。如此重復(fù)清洗3次。棄上清液,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中,使丙酮完全揮發(fā)。(B)丙酮沉淀法:取一定量的麥曲浸提液于離心管內(nèi),加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液II,振蕩搖勻后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白,然后于4℃,12000r/min離心30min。棄上清液,收集沉淀。加入2mL相同的溶液清洗2次,4℃12000r/min離心15min。棄上清液,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中至丙酮揮發(fā)完全。(C)2-DCleanupKit試劑盒沉淀法:參照試劑盒的使用說(shuō)明書,取100μL麥曲提取液置于1.5mL離心管中,每管加入300μL沉淀劑I,充分振蕩混勻,冰浴15min。加入300μL沉淀劑II,振蕩混勻,4℃,12000r/min離心5min,吸出上清液。加入40μL清洗劑I,充分振蕩,4℃,12000r/min離心5min,移去上清液。在沉淀上層加入25μL去離子水,振蕩20～30s,然后在管中加入1mL清洗劑II(-20℃下至少預(yù)冷1h)和5μL清洗劑添加劑,在渦旋混合器上振蕩1min至沉淀完全散開(kāi)。將離心管在-20℃下至少放置30min,每10min振蕩20～30s,然后于13000r/min離心5min,移去上清液。沉淀在空氣中風(fēng)干(不超過(guò)5min)。(3)宏蛋白質(zhì)組的制備將干燥好的蛋白質(zhì)沉淀加入適量的樣品裂解液,室溫下充分溶解,然后于12000r/min離心10min,上清液即為黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組樣品。用Bio-RadRCDC蛋白定量試劑盒準(zhǔn)確測(cè)定蛋白濃度。1.2.2由ipg凝膠層析成網(wǎng),根據(jù)水質(zhì)進(jìn)行電泳分析使用pH3～10,7cm的非線性IPG干膠條,在Immobiline泡脹盤中被動(dòng)水化14h,蛋白上樣量為110μg左右。第一向等電聚焦在EttanIPGphor3等電聚焦儀上進(jìn)行,等電聚焦程序設(shè)置為:①Step,50V,30min;②Grad,150V,30min;③Grad,300V,1h;④Grad,1000V,1h;⑤Grad,5000V,1.5h;⑥Step,5000V,6000Vh。等電聚焦結(jié)束后,立即進(jìn)行平衡。采用兩步平衡法,將IPG膠條先后在平衡液I和平衡液II中各平衡15min。第二向SDS電泳分離膠濃度為12.5%,應(yīng)用BIO-RAD小型垂直電泳槽和BIO-RAD高電流電泳儀,以恒流方式進(jìn)行電泳:10mA,10min,然后將電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時(shí),關(guān)閉電源,結(jié)束電泳。采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。染色后的凝膠應(yīng)用JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行掃描,應(yīng)用PDQuest8.0雙向電泳分析軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1種方法制備樣品的蛋白質(zhì)含量用沉淀法提取黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組,都不可避免地產(chǎn)生一定的損失。圖1是以浙江地區(qū)所產(chǎn)麥曲為研究對(duì)象,用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法和2-DCleanupKit試劑盒法3種方法制備樣品,在沉淀前后溶液中的蛋白含量比較。通過(guò)計(jì)算其蛋白質(zhì)損失率發(fā)現(xiàn),丙酮沉淀法的蛋白質(zhì)損失率最低,只有4.6%,而TCA-丙酮沉淀法和2-DCleanupKit試劑盒法制備的樣品其蛋白質(zhì)損失率較高,分別達(dá)到60%和62.3%。就蛋白質(zhì)的重溶時(shí)間來(lái)說(shuō),TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法制備的樣品,在樣品裂解液中較難溶解甚至不能完全重溶,往往需要振蕩溶解數(shù)個(gè)小時(shí),并需超聲助溶;而用2-DCleanupKit試劑盒制備的樣品,溶解較容易,30min左右即可完全溶于樣品裂解液中。2.2分離效果的比較以浙江地區(qū)所產(chǎn)麥曲為研究對(duì)象,制備樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)黃酒麥曲浸提液宏蛋白質(zhì)組的雙向電泳和染色結(jié)果,比較了TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-DCleanupKit試劑盒法制備方法的優(yōu)劣。以TCA-丙酮法制備的樣品,在等電聚焦(IEF)時(shí)溴酚藍(lán)指示劑不能正常遷移到酸性端,酸性部分聚焦失敗,雙向電泳分離效果差,在2-DE圖譜上表現(xiàn)為酸性端有垂直的陰影(圖2-A);用丙酮沉淀法制備的樣品,其2-DE圖譜上沒(méi)有明顯的蛋白點(diǎn),蛋白質(zhì)呈云片狀聚集,未充分分離,雙向電泳分離效果最差(圖2-B);圖2-C是用CleanupKit試劑盒制備的樣品的結(jié)果,可以看出,其2-DE圖譜分辨率高,蛋白點(diǎn)圓潤(rùn)、清晰,雙向電泳分離效果較好。應(yīng)用PDQuest8.0雙向電泳分析軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析,TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-DCleanupKit試劑盒法3種方法制備的宏蛋白質(zhì)組樣品,其凝膠圖譜上的蛋白點(diǎn)數(shù)量分別為98、21、112個(gè),其中,圖2-C與圖2-A和圖2-B相比,分別多檢出蛋白點(diǎn)14個(gè)和91個(gè),進(jìn)一步表明利用2-DCleanupKit法分離的宏蛋白質(zhì)組樣品其質(zhì)量要優(yōu)于另外2種方法。2.3曲浸提液雙向電泳分離效果以上海和安徽地區(qū)所產(chǎn)麥曲為研究對(duì)象,利用2-DCleanupKit試劑盒法分別制備麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?利用該法制備宏蛋白質(zhì)組樣品的2-DE圖譜分辨率均較高,蛋白點(diǎn)圓潤(rùn)清晰,雙向電泳分離效果較為理想。說(shuō)明2-DCleanupKit試劑盒法對(duì)于制備不同地區(qū)的黃酒麥曲浸提液宏蛋白質(zhì)組均具有很好的通用性。3微織構(gòu)巖質(zhì)組學(xué)traft-雙向電泳分離體驗(yàn)的比較樣品制備效果如何往往在很大程度上決定了雙向電泳的結(jié)果,特別是對(duì)于組成復(fù)雜的宏蛋白質(zhì)組來(lái)說(shuō),樣品制備尤為重要。在樣品制備時(shí),主要有3個(gè)重要目的:一是完成蛋白質(zhì)的離解或蛋白質(zhì)的相互作用;二是除去樣品中的非蛋白(如脂類、核酸、鹽等);三是有效降低或消除蛋白酶的活性。在此過(guò)程中,要盡量減少蛋白質(zhì)的修飾和降解,樣品制備的操作步驟盡量少,時(shí)間盡量短,從而有效避免蛋白質(zhì)的特異性和非特異性丟失。在雙向電泳過(guò)程中,蛋白質(zhì)沉淀是可選的步驟。通過(guò)沉淀過(guò)程,可以除去影響雙向電泳結(jié)果的干擾物質(zhì),如鹽、去污劑、核酸、脂類、多糖等。另外,通過(guò)沉淀還可以有效濃縮樣品。用沉淀法制備黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組,需經(jīng)過(guò)清洗、重溶等多個(gè)步驟,這不可避免地造成一定的損失。但從以往的研究結(jié)果來(lái)看,這種損失是整體數(shù)量上的損失,不會(huì)造成某些蛋白質(zhì)的特異性丟失,可以通過(guò)適當(dāng)增加沉淀的樣品量來(lái)加以彌補(bǔ)。TCA-丙酮沉淀法是雙向電泳最常用的制備樣品的方法,可以有效除去鹽分和多糖等雜質(zhì)。TCA與蛋白質(zhì)的作用包括以下幾個(gè)方面:(1)在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽;(2)作為蛋白質(zhì)的變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,暴露出較多的疏水性基團(tuán),使之聚集沉淀;(3)隨著蛋白質(zhì)分子量的增大,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與致密性越大,TCA可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去。TCA與蛋