內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)超長(zhǎng)皮瓣存活與氧自由基的影響

內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)超長(zhǎng)皮瓣存活與氧自由基的影響

血管內(nèi)生長(zhǎng)因子（vegf）是一種特定于血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白。它可以維持血管的正常狀態(tài)和完整性，改善血管的滲透性，誘導(dǎo)血管的生成。這一點(diǎn)引起了組織修復(fù)和血管再生的高度重視。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)VEGF在不同類(lèi)型皮瓣存活中的具體作用和相關(guān)機(jī)制做過(guò)一些報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)制作大鼠背部超長(zhǎng)隨意皮瓣缺血模型,皮瓣內(nèi)局部注射VEGF,為帶蒂皮瓣較大創(chuàng)面和促進(jìn)創(chuàng)面愈合探索新的治療途徑。1材料和方法1.1體質(zhì)量與動(dòng)物鑒定實(shí)驗(yàn)于2004年11月—2005年11月在華北煤炭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。選擇清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量(300±20)g,由鄭州實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第410117號(hào))。自由飲水,室溫(25±2)℃分籠喂養(yǎng)。1.2動(dòng)物模型制備、分組及模型建立干預(yù)模型:采用1%戊巴比妥液4ml/kg腹腔內(nèi)注射,麻醉成功后俯臥位固定,背部剃毛。常規(guī)消毒后,以鼠背中線為皮瓣縱軸,設(shè)計(jì)以鼠骶骨下緣處為蒂,形成3cm×10cm缺血型皮瓣,皮瓣包括背部肉膜層,解剖在背部深筋膜淺面掀起,結(jié)扎重要血管,4-0絲線間斷原位縫合。所有手術(shù)均由同一術(shù)者完成。距蒂部0～4cm為皮瓣近段,4～7cm為皮瓣中段,7～10cm為皮瓣遠(yuǎn)段。所有器械及材料均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒且整個(gè)過(guò)程都在無(wú)菌條件下進(jìn)行。56只動(dòng)物隨機(jī)分為二組,每組28只。分別為生理鹽水對(duì)照組(NS組)和VEGF實(shí)驗(yàn)組(VEGF組)。重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhVEGF)由二條165個(gè)氨基酸多肽鏈組成。將VEGF溶于0.9%NaCl溶液中形成1μg/mlVEGF工作液。皮瓣形成后即刻,于術(shù)區(qū)遠(yuǎn)蒂端3cm×4cm選擇10個(gè)對(duì)稱位點(diǎn),用微量注射器經(jīng)組織面向皮下注入,VEGF組每一位點(diǎn)給予VEGF工作液100μl,每瓣共注入VEGF1μg,NS組每一位點(diǎn)給予醫(yī)用生理鹽水100μl。皮瓣形成后第十二小時(shí)、二十四小時(shí)分別取6只大鼠,于距皮瓣遠(yuǎn)端2.5cm、5.5cm和8.5cm取材測(cè)定組織MDA含量和SOD活力。于術(shù)后第四天取大鼠12只,按隨機(jī)數(shù)分為生理鹽水組和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組,每組6只。給藥方法同上。各組分別于皮瓣形成后第四天處死,進(jìn)行組織學(xué)檢查:動(dòng)物麻醉后,取材固定,常規(guī)石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察組織學(xué)變化。皮瓣形成后第七天,①皮瓣成活率測(cè)定:動(dòng)物麻醉后,用透明硫酸紙準(zhǔn)確描繪各組皮瓣形態(tài),壞死區(qū)域用墨汁涂黑。壞死標(biāo)準(zhǔn):皮膚質(zhì)地變硬,顏色變黑。將描繪好的透明硫酸紙用掃描儀依次掃描后,利用真彩色醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)圖像中心)對(duì)皮瓣資料進(jìn)行處理和計(jì)算,求出皮瓣存活面積與總面積之比即皮瓣成活率。②皮瓣微血管密度測(cè)定:先行FⅧ-RAg免疫組化染色,步驟同增殖細(xì)胞核抗原免疫組化染色,一抗換作兔抗鼠FⅧ-RAg多克隆抗體(1:50)。對(duì)FⅧ-RAg免疫陽(yáng)性血管進(jìn)行微血管密度計(jì)數(shù),凡是染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞族,均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù),在低倍(×100)光鏡下每張切片隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野微血管數(shù)目,利用計(jì)算機(jī)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量出相同視野下的組織面積,按血管斷面均數(shù)/鏡下視野組織面積,即可知道1cm2組織中血管斷面的密度,單位為個(gè)/cm2。1.3主要觀察指標(biāo)①主要結(jié)局:組織中MDA和SOD指標(biāo)的測(cè)定。②次要結(jié)局:皮瓣成活率、微血管密度的測(cè)定、組織學(xué)檢查。1.4ss軟件10.5版本所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用xˉ±sxˉ±s表示,以EXCEL建庫(kù),采用SPASS軟件11.5版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1兩組含vegf組的登記比較應(yīng)用分光光度計(jì),根據(jù)TBA法測(cè)定MDA含量及黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力,并得出結(jié)果如下。術(shù)后第十二小時(shí)二組間的MDA和SOD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后第二十四小時(shí)二組的結(jié)果見(jiàn)表1、2。在術(shù)后第二十四小時(shí)測(cè)得皮瓣遠(yuǎn)端組織MDA含量二組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:VEGF組(2.79±0.22)nmol/mgprot,較生理鹽水組(5.42±1.35)nmol/mgprot,顯著減少(P<0.05)。在術(shù)后第二十四小時(shí)測(cè)得皮瓣中、遠(yuǎn)端組織SOD活力二組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:中端SOD活力VEGF組(116.61±19.83)nmol/mgprot,較生理鹽水組(58.27±12.81)nmol/mgprot,顯著減少(P<0.05),而遠(yuǎn)端SOD活力VEGF組(177.07±3.41)nmol/mgprot,較生理鹽水組(109.71±40.13)nmol/mgprot,顯著減少(P<0.05)。2.2專業(yè)活檢成活率根據(jù)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)輸出結(jié)果,皮瓣形成后第七天,各組皮瓣成活率見(jiàn)表3。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組皮瓣成活率較生理鹽水組明顯增加(P<0.05),二組皮瓣成活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3細(xì)胞培養(yǎng)和織物的增殖光鏡觀察:光鏡下見(jiàn)二組皮瓣表皮、毛囊及皮脂腺等結(jié)構(gòu)基本正常,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組鏡下可見(jiàn)肉芽組織開(kāi)始增生,新生毛細(xì)血管豐富,炎性細(xì)胞浸潤(rùn);生理鹽水組較內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組毛細(xì)血管數(shù)量少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度重。2.4微血管密度單次給藥后3段各組微血管密度的比較皮瓣形成后第七天,用計(jì)算機(jī)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)各組皮瓣近、中、遠(yuǎn)3段微血管密度結(jié)果見(jiàn)表4,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組皮瓣中遠(yuǎn)段微血管密度較生理鹽水組相應(yīng)部位均有顯著增加(P<0.01)。表明內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子能明顯促進(jìn)皮瓣中遠(yuǎn)段血管新生。3vegf在術(shù)后中的作用本實(shí)驗(yàn)生理鹽水組和BCDE組二組皮瓣的創(chuàng)基均為背部肌肉,皮瓣均為任意皮瓣,除給與藥物控制不同外,二組其余均同,所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差別可以認(rèn)為是藥物控制的不同所致。在本實(shí)驗(yàn)我們觀察到,應(yīng)用VEGF后,術(shù)后第二十四小時(shí)皮瓣遠(yuǎn)端組織MDA明顯降低,較生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這可能由于①缺血狀態(tài)下VEGF蛋白的半衰期得到延長(zhǎng);②皮瓣缺血刺激內(nèi)源性VEGF蛋白mRNA的產(chǎn)生,二者使VEGF蛋白的生物學(xué)效應(yīng)從正常的30～45min,延長(zhǎng)到6～8h,甚至更長(zhǎng)時(shí)間。術(shù)后第十二小時(shí)毛細(xì)血管芽未見(jiàn)形成,VEGF未能發(fā)揮作用。待到術(shù)后第二十四小時(shí)微循環(huán)開(kāi)始建立,及時(shí)發(fā)揮增加血流量,清除自由基MDA的功效。另外應(yīng)用VEGF后,皮瓣中、遠(yuǎn)端組織中SOD水平于術(shù)后第二十四小時(shí)明顯升高,VEGF組中、遠(yuǎn)端組織中SOD含量與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可能由于SOD的增加,降低了組織中自由基水平,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低,MDA也隨之下降。二者的變化都在皮瓣形成后第二十四小時(shí)最為顯著,說(shuō)明VEGF能迅速改變組織內(nèi)SOD的水平,加強(qiáng)抗氧化能力,從而有利于皮瓣遠(yuǎn)端缺血細(xì)胞,特別是存活與壞死交界區(qū)域的“臨界”細(xì)胞減少損傷,向存活的方向轉(zhuǎn)化。Ruhul.Abid等認(rèn)為VEGF能介導(dǎo)過(guò)氧化物歧化酶MnSOD蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄,繼而引起SOD蛋白合成的增加和SOD活力的提高,清除O-2,增加了內(nèi)皮細(xì)胞成活,以及其抗凋亡功效;同時(shí)局部組織H2O2的產(chǎn)生為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供條件;但是對(duì)于VEGF引起局部組織SOD水平的升高是否也是通過(guò)加強(qiáng)SOD基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。術(shù)后第七天第Ⅷ因子染色方法皮瓣下血管密度檢測(cè)結(jié)果顯示:VEGF組較生理鹽水組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明當(dāng)給予適量的VEGF后,能促進(jìn)大量新生血管形成。術(shù)后VEGF組皮瓣存活面積較生理鹽水對(duì)照組有顯著性的增加(P<0.05),說(shuō)明在皮瓣在抗氧自由基的過(guò)程中,VEGF起著重要作用,它能夠促使生理性和病理性的血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞增殖,參與皮瓣血管形成、血液循環(huán)調(diào)節(jié),增加血流,