酒精對小鼠睪丸內(nèi)源性細(xì)胞增殖及凋亡的影響

酒精對小鼠睪丸內(nèi)源性細(xì)胞增殖及凋亡的影響

在日常生活中，飲酒是一種非常常見的現(xiàn)象。長期飲酒會導(dǎo)致各種疾病。文獻報道酒精對男性生殖器官的損傷是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因之一。劉長云等研究了白酒對大鼠睪丸的損傷作用,結(jié)果表明隨著飲酒量的加大和飲酒時間的延長,睪丸的相對重量降低,生精小管萎縮變細(xì),睪丸間質(zhì)增大,精子活力顯著降低,精子畸形率增高明顯,血清LH、FSH及睪酮均比正常水平低。酒精對睪丸組織中一氧化氮合酶(eNOS)、增殖細(xì)胞核抗原(prliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的表達(dá)和細(xì)胞凋亡影響的研究,報道很少。本研究以22d齡小鼠為實驗對象,用5%、10%和15%酒精水溶液飼飲小鼠,觀察酒精對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)、eNOS和PCNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。材料和方法1.調(diào)查組的確定選用21d齡昆明種雄性小白鼠34只(由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供),平均體重12g,隨機分成正常對照組(10只)、5%酒精實驗組(8只)、10%酒精實驗組(8只)、15%酒精實驗組(8只)。從22d齡幼鼠開始同時飼飲不同濃度的酒精水溶液,酒精由天津北方化學(xué)玻璃購物中心出產(chǎn)(無水乙醇,分析純,含甲醇0.05%),用自來水配制而成,對照組飼飲自來水,每日更換新溶液,連續(xù)飼飲60d后處死。2.蛋白甘油經(jīng)皮片組動物稱重斷頭處死后,剖取左側(cè)睪丸,固定于4%的多聚甲醛,常規(guī)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋,制成6μm厚的連續(xù)切片,切片裱于覆有蛋白甘油的載玻片上,切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度酒精復(fù)水,蘇木精染色5min,經(jīng)1%鹽酸酒精分色,自來水充分沖洗藍(lán)化后,再用0.1%伊紅復(fù)染5min,最后經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明后封片。3.免疫組織化學(xué)取右側(cè)睪丸固定于4%的多聚甲醛溶液1h后,置入30%的蔗糖緩沖液4℃冰箱過夜,用ReichertHistoSTATD冰凍切片機制成6μm厚的連續(xù)切片,每隔2張取1張,裱于覆有明膠的載玻片上。冰凍切片以ABC法進行免疫組織化學(xué)染色,SP試劑盒由北京中山公司提供的美國Zymed公司產(chǎn)品。切片經(jīng)1%甲醇-過氧化氫處理30min,封閉血清于37℃處理30min,加入eNOS(1∶50Santacruz)抗體和PCNA抗體(1∶50Zymed)于4℃冰箱過夜,再加入生物素標(biāo)記的二抗,37℃處理30min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30min,經(jīng)DAB-H2O2顯色3～5min,經(jīng)PBS充分沖洗,eNOS切片經(jīng)蘇木素復(fù)染1～3min,流水充分沖洗后干燥、脫水、透明、中性樹膠封片,光鏡觀察。4.免疫、抗地高辛抗體tb和抗-4-dig-utpdab的制備用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡細(xì)胞,原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司,過程按使用說明書。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟入水;新鮮配制的3%過氧化氫液室溫孵育15min;TBS1∶100新鮮稀釋蛋白酶K37℃消化15min;每片加標(biāo)記緩沖液(labelingbuffer,LB)20μl,室溫30min;再加TDT、DIG-UTP、LB的混合液,4℃冰箱過夜;每片加封閉液50μl,室溫30min;每片加生物素化抗地高辛抗體50μl,37℃反應(yīng)60min;TBS1∶100稀釋SABC加至切片,37℃45min;DAB顯色20min;蒸餾水沖洗,脫水、透明、封片。陰性對照,用0.01mol/LPBS代替TDT、DIG-d-UTP、LB混合液標(biāo)記液,其他步驟同上。5.精小管及精密度切片用病理圖像分析系統(tǒng)(北京航天航空大學(xué)設(shè)計)采集圖像,每組隨機選取3張切片,每張切片檢查10個視野。利用電腦圖像分析系統(tǒng)的體視學(xué)功能測量生精小管的直徑;利用電腦圖像分析系統(tǒng)的組織化學(xué)分析功能統(tǒng)計eNOS陽性細(xì)胞的面積密度、單位面積內(nèi)PCNA陽性細(xì)胞的數(shù)目及凋亡細(xì)胞數(shù)目。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用excel作圖表,statistica軟件進行單因素方差分析及組間t檢驗,根據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)繪制統(tǒng)計圖。結(jié)果1.各組生精管管路的變化正常組小鼠生精小管管腔明顯,生精細(xì)胞在管內(nèi)排列緊密有序,可見精子生成(圖1);5%酒精組與正常組無明顯差異;10%酒精組生精小管管徑變小,排列變得疏松,生精小管周圍間隙加寬(圖2);15%酒精組生精小管萎縮變細(xì),管徑明顯變小,生精小管周圍間隙進一步加大,有些生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列變得疏松,生精細(xì)胞間出現(xiàn)空隙(圖3)。2.酒精濃度對睪丸精原細(xì)胞及pcna表達(dá)的影響eNOS免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性細(xì)胞內(nèi)可見陽性顆粒,呈淺黃色至棕黃色,大小均一,位于胞膜內(nèi)的胞漿中。正常組小鼠睪丸內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及精子細(xì)胞呈明顯的eNOS陽性反應(yīng),胞質(zhì)為黃色(圖4);隨著酒精濃度的增大,eNOS陽性細(xì)胞顯色加深,15%酒精組睪丸內(nèi)陽性細(xì)胞顯色為深棕色,數(shù)目明顯增多(圖5),但各組的精原細(xì)胞及精母細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。PCNA免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,其陽性反應(yīng)顆粒為淺棕色至深棕色,顆粒大小一致,位于胞核內(nèi)。正常組部分精原細(xì)胞呈陽性表達(dá)(圖6);5%酒精組PCNA表達(dá)與正常組無明顯差異,陽性細(xì)胞數(shù)目略有增加;10%酒精組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目比5%酒精組略有增加;15%酒精組睪丸內(nèi)精原細(xì)胞呈強陽性表達(dá)(圖7),陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。3.組凋亡細(xì)胞表達(dá)情況正常組小鼠睪丸的生精小管內(nèi)精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞陽性表達(dá)比較多見(圖8);5%酒精組凋亡細(xì)胞表達(dá)比正常組顯著增多(圖9);10%酒精組凋亡的生精細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增加(圖10);15%酒精組睪丸內(nèi)陽性表達(dá)的生精細(xì)胞顯著增多,凋亡細(xì)胞為強陽性深染,生精小管內(nèi)可見陽性的精原細(xì)胞與初級精母細(xì)胞(圖11)。4.酒精濃度對enos陽性細(xì)胞面積密度和pcna免疫反應(yīng)的影響圖像分析及統(tǒng)計結(jié)果表明:隨著酒精濃度的增大,小鼠睪丸內(nèi)生精小管的直徑呈減小趨勢(附表),10%酒精組生精小管直徑與5%酒精組差異極顯著(P<0.01),15%酒精組生精小管直徑與10%酒精組差異極顯著(P<0.01)。隨著酒精濃度的增大,eNOS陽性細(xì)胞面積密度呈增大趨勢(附表),15%酒精組與其他組差異極顯著(P<0.01)。隨著酒精濃度的增大,單位面積內(nèi)PCNA免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目呈增大趨勢(附表),15%酒精組與其他組差異極顯著(P<0.01)。隨著酒精濃度的增大,單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目呈增大趨勢(附表),15%酒精組與其他組差異極顯著(P<0.01)。小鼠睪丸中低度酒精的組織結(jié)構(gòu)本實驗將小鼠分為正常對照組、5%酒精組、10%酒精組和15%酒精組4組,較系統(tǒng)地研究了低度酒精對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)、eNOS、PCNA表達(dá)和生精細(xì)胞凋亡的影響,現(xiàn)討論分析如下:1.酒精損傷作用通過實驗觀察和統(tǒng)計分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著酒精濃度的增大,生精小管周圍間隙加寬,睪丸生精小管直徑呈減小趨勢,高濃度酒精可使生精小管內(nèi)生精細(xì)胞間出現(xiàn)空隙,表明酒精對生殖細(xì)胞有明顯的損傷作用,這與文獻報道結(jié)果是一致的。許多研究證實隨著飲酒量增加及飲酒時間延長會造成生精小管萎縮,精子的活力降低,精子密度減少且精子的畸形率升高,同時血清性激素(LH,FSH,T)水平降低,提示酒精有抑制性激素分泌的作用,這可能是導(dǎo)致個體生殖能力下降甚至不育的重要原因。2.影響男性生殖能力的因素許多研究證實NO能調(diào)節(jié)睪丸的血液供應(yīng)、激素的合理分泌、精子的正常發(fā)生及獲能,并影響精子的質(zhì)量,從而影響雄性的生殖能力。在實驗觀察中我們發(fā)現(xiàn),酒精影響小鼠睪丸陽性eNOS的表達(dá),并隨著酒精濃度的增大,睪丸內(nèi)eNOS表達(dá)增多,促使睪丸產(chǎn)生的NO增多,進而可能會抑制激素的分泌及精子的發(fā)育,但有關(guān)酒精與NO之間的關(guān)系,目前尚未見報道,酒精對精子發(fā)生和雄性激素分泌的作用機理尚需進行深入地探討。3.酒精影響睪丸生精細(xì)胞增殖和凋亡的作用雄性生殖細(xì)胞在發(fā)育過程中不斷分化、增殖的同時伴有生精細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生,許多生殖疾病過程都與生精細(xì)胞的凋亡變化有關(guān)。正常生理狀態(tài)下的生精細(xì)胞凋亡是機體清除增生過程中染色體復(fù)制發(fā)生致命錯誤或惡變的細(xì)胞,使生精細(xì)胞數(shù)量保持相對穩(wěn)定。Ewald等研究發(fā)現(xiàn),酒精的直接作用導(dǎo)致胸腺萎縮,并且0.2%到0.8%酒精組胸腺細(xì)胞凋亡明顯增加。酒精對生精細(xì)胞凋亡的影響文獻報道很少,我們研究發(fā)現(xiàn),酒精有影響睪丸生精細(xì)胞增殖與凋亡的作用,并隨著酒精濃度的增大,增殖與凋亡細(xì)胞顯著增多。周宏等認(rèn)為,精子發(fā)生過程中對生殖細(xì)胞增殖-凋亡平衡的調(diào)節(jié)具有相關(guān)的調(diào)控因素。Blanco的有關(guān)研究還證明,生精細(xì)胞成熟過程中的凋亡變化與機體內(nèi)分泌變化有關(guān)。值得注意的是細(xì)胞增殖的數(shù)目在15%酒精組出現(xiàn)顯著增多,而凋亡細(xì)胞的數(shù)目在5%酒精組開始顯著增多,顯然低度酒精促進小鼠生精細(xì)胞的增殖與凋亡。10%酒精組與15%酒精組凋亡細(xì)胞數(shù)目持續(xù)顯著增多,表明酒精的濃度增大可能導(dǎo)致產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物和自由基增多,促使細(xì)胞凋亡加快,對雄性的生殖能力造成有害影響。有研究認(rèn)為,酒精的過氧化反應(yīng)使強氧化劑和抗氧化劑之間的平衡作用失調(diào)?？寡趸饔冒?xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外的多種營養(yǎng)物質(zhì)的保護作用