生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-第一次(分光 層析)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)ExperimentaltechnologyofBiochemistryandmolecularbiology《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》理論考試（60分）實(shí)驗(yàn)成績(jī)（40分）理論課：3學(xué)時(shí)

×3次實(shí)驗(yàn)課:6學(xué)時(shí)

×6次操作考試：3學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)考試3.5學(xué)分2.5學(xué)分《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》成績(jī)分布理論考試（60分）：選擇題（15題，15分）判斷題（15題，15分）填空題（15個(gè)空，15分）論述題（1題，15分）實(shí)驗(yàn)成績(jī)（40分）:實(shí)驗(yàn)操作考試（10分）實(shí)驗(yàn)報(bào)告（15分）實(shí)驗(yàn)討論（10分）考勤和衛(wèi)生（5分）Thebasicexperimentaltechnology：一、分光光度技術(shù)二、層析技術(shù)三、電泳技術(shù)四、離心分析技術(shù)五、PCR技術(shù)六、蛋白分離和純化技術(shù)

一、分光光度技術(shù)

(Spectrophotometry)

722型分光光度計(jì)的旋鈕上標(biāo)示的0、100、A、T分別表示什么意思？分光光度法檢測(cè)物質(zhì)濃度時(shí)為什么要用空白液？將兩個(gè)空比色杯放入分光光度計(jì)，以一個(gè)比色杯作為對(duì)照，測(cè)另一個(gè)比色杯的吸光度。Contents：一)光的概述二)分光光度法的概念及原理四)測(cè)定物含量的計(jì)算三)分光光度計(jì)的構(gòu)造及使用方法一)光的概述（lightwave）1.光的性質(zhì)光是電磁波，通常用波長(zhǎng)、頻率來(lái)描述不同的光波。波速=波長(zhǎng)×頻率

不同波長(zhǎng)(或不同頻率)的電磁波在相同介質(zhì)中的傳播速度都相同，電磁波的頻率愈高，波長(zhǎng)越短。一定波長(zhǎng)的光具有一定的能量，波長(zhǎng)越長(zhǎng)（頻率越低），光量子的能量越低；反之，波長(zhǎng)越短（頻率越高），光量子的能量越高。溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系紫外光：＜400nm可見光：400～760nm紅外光：＞760nm

另根據(jù)電磁波的波長(zhǎng)不同又分為三個(gè)波段：可見光：電磁波譜中人眼可以感知的部分，波長(zhǎng)在400到760納米之間，往往是具有顏色的光。實(shí)驗(yàn)證明：白光(日光、白熾電燈光、日光燈光等)就是由以上不同顏色的光按一定的強(qiáng)度比例混合而成的。白光叫做復(fù)合光；只具有一種顏色的光/同一波長(zhǎng)的光叫做單色光。溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系

為什么以上多種有顏色的單色光混合在一起即變?yōu)榘坠?？互補(bǔ)光（complementarycolors）：——把適當(dāng)顏色的兩種光按一定強(qiáng)度比例混合能成為白光，這兩種顏色的光稱為互補(bǔ)光。2.介質(zhì)對(duì)光波的吸收光在介質(zhì)內(nèi)傳播時(shí)，介質(zhì)中的束縛電子在光波電場(chǎng)作用下做受迫振動(dòng)，光波要消耗能量激發(fā)電子的振動(dòng)，導(dǎo)致介質(zhì)中的分子（或離子）由基態(tài)躍遷到高能級(jí)的激發(fā)態(tài)。光的吸收：是指原子在光照下，會(huì)吸收光子的能量由低能態(tài)躍遷到高能態(tài)的現(xiàn)象。只要是介質(zhì)，就會(huì)吸收各種光波？介質(zhì)吸收光的條件：而物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)是由物質(zhì)的原子構(gòu)成和原子間相互作用決定的，不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致物質(zhì)能態(tài)的不同，對(duì)光的選擇性吸收也就不一樣。入射光的能量=介質(zhì)中物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系白光(紅、青；橙、青藍(lán)；黃、藍(lán)；綠、紫；

)物質(zhì)吸收光能的多少與什么有關(guān)系？用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以大致估計(jì)物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。利用物質(zhì)能吸收光能的原理以精確測(cè)定物質(zhì)含量的方法——分光光度法Cu2＋二)分光光度法的概念及原理1.分光光度法的概念

當(dāng)光線通過(guò)透明溶液介質(zhì)時(shí)，其輻射能量有部分被吸收而部分被透過(guò)，所以光線射出溶液介質(zhì)后光能被減少。這種利用光能的吸收和透過(guò)比例來(lái)進(jìn)行某些物質(zhì)的定性定量分析。

1.靈敏度高

分光光度法測(cè)定物質(zhì)的濃度下限(最低濃度)一般可達(dá)1-10-3%的微量組分。2.分光光度法的特點(diǎn)2.準(zhǔn)確度較高

一般分光光度法的相對(duì)誤差為2-5%。3.操作簡(jiǎn)便，測(cè)定速度快4.應(yīng)用廣泛

幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和有機(jī)化合物都可直接或間接地用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It+IrI0=Ia+It1.透光率(T)和吸光度(A)

3.分光光度法的原理透光率(transmittance)

T

=It/I0吸光度(absorbance)A2.Lambert-Beer定律（1）Lambert定律:

（2）Beer定律:

（3）Lambert-Beer定律:K為吸光系數(shù)，對(duì)于一定物質(zhì)的溶液K為常數(shù)。A=KLA=KCA=KCLtC一定,A∝LL一定,A∝c三)分光光度計(jì)的構(gòu)造及使用

能從含有各種波長(zhǎng)的混合光中將每一單色光分離出來(lái)并測(cè)量其強(qiáng)度的儀器稱為分光光度計(jì)。

紫外光分光光度計(jì)

可見光分光光度計(jì)

紅外光分光光度計(jì)

萬(wàn)用（全波段）分光光度計(jì)透射光能722型（觸摸鍵式）722型（旋鈕式）可見光分光光度計(jì)：722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長(zhǎng)波長(zhǎng)旋鈕

原理：將復(fù)合光色散為不同波長(zhǎng)的單色光，然后再讓所需波長(zhǎng)的光通過(guò)一個(gè)很窄的狹縫照射到吸收池上。透射光能光路722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長(zhǎng)3.裝液（2/3）透射光能吸收池：比色皿用于盛放溶液的容器。它是由無(wú)色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分為0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm?？梢姽夥止夤舛扔?jì)——玻璃比色皿紫外光分光光度計(jì)——石英比色皿檢測(cè)器：檢測(cè)器的作用是接受從比色皿發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。光能電能透射光能透射光能顯示裝置：把放大的信號(hào)以吸光度A或透光率T的方式顯示或記錄下來(lái)。

分光光度計(jì)常用的顯示裝置是檢流計(jì)、微安表、數(shù)字顯示記錄儀。透射光能吸收池：比色皿用于盛放溶液的容器。它是由無(wú)色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分為0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm?？梢姽夥止夤舛扔?jì)——玻璃比色皿紫外光分光光度計(jì)——石英比色皿722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長(zhǎng)3.裝液（2/3）4.功能鍵置“T”——調(diào)“T”為0（遮光體對(duì)準(zhǔn)光縫）功能鍵722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長(zhǎng)3.裝液（2/3）4.功能鍵置“T”——調(diào)“T”為0（遮光體對(duì)準(zhǔn)光縫）5.功能鍵置“T”——調(diào)“T”為100（空白管對(duì)準(zhǔn)光縫）6.功能鍵置“A”——依次拉動(dòng)拉桿（聽到“咔”一聲）比色、讀數(shù)并記錄（A值取三位有效數(shù)值）7.洗滌比色皿功能鍵722分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)：1.樣品室蓋應(yīng)輕開輕放；2.比色皿拿磨砂面，液體裝入約2/3高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，每次用完后自來(lái)水沖洗干凈，倒置于濾紙上；3.倒取試劑時(shí)不能在儀器表面上方操作，儀器上請(qǐng)勿放任何物品；四）測(cè)定物含量的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)管法標(biāo)準(zhǔn)曲線法1.標(biāo)準(zhǔn)管法空白管(B)標(biāo)準(zhǔn)管(S)測(cè)定管(U)1/20稀釋血清標(biāo)本（ml）－－1.01/20稀釋標(biāo)準(zhǔn)血清（ml）－1.0－生理鹽水（ml）1.0－－雙縮脲試劑（ml）4.04.04.0參比（空白）溶液blank：參比溶液的作用：扣除一切不來(lái)源于目標(biāo)產(chǎn)物的光吸收。如：消除吸收池、溶劑、試劑、干擾物的影響。StandardsampleUnknownsample

1.標(biāo)準(zhǔn)管法空白管(B)標(biāo)準(zhǔn)管(S)測(cè)定管(U)1/20稀釋血清標(biāo)本（ml）－－1.01/20稀釋標(biāo)準(zhǔn)血清（ml）－1.0－生理鹽水（ml）1.0－－雙縮脲試劑（ml）4.04.04.0As=KsCsLsAu=Ku.Cu.LuAsKsCsLsAuKu.Cu.Lu=As.Cs.AuCu.=2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法試管12345濃度（C=μg/ml）1020304050吸光度（A）0.0710.1550.2230.2720.366將AU=0.186代入公式y(tǒng)=139.6x-0.647求得CU=25.3μg/ml二、層析技術(shù)ChromatographyTechniqueContents:一)層析技術(shù)的概念二)層析技術(shù)的原理三)層析技術(shù)的分類四)凝膠層析技術(shù)一）層析技術(shù)的概念利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)差異，使各組分在層析系統(tǒng)中以不同速度移動(dòng)而達(dá)到分離的一種物理分離方法?；旌衔顰BCD二）層析技術(shù)的原理理化性質(zhì)：吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。利用混合物中各組分理化性質(zhì)差異進(jìn)行分離;固定相流動(dòng)相——固定不動(dòng)（液/固）——針對(duì)固定相（相對(duì)運(yùn)動(dòng)）（氣/液）推動(dòng)樣品中各組分通過(guò)固定相向前移動(dòng)層析系統(tǒng)當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固定相時(shí)，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中進(jìn)行再分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到將各組分分離的目的。（1）按兩相所處的狀態(tài)分類：三）層析技術(shù)的分類液相色譜

氣相色譜

固定相流動(dòng)相——固定不動(dòng)（液/固）——針對(duì)固定相（相對(duì)運(yùn)動(dòng)）（氣/液）層析系統(tǒng)液-固層析液-液層析氣-固層析氣-液層析——高效液相色譜(HPLC)柱層析紙層析薄層層析（2）按操作形式不同分類：吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的

分配系數(shù)（或溶解度）不同，使之分離。離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。（3）按層析原理分類：四）凝膠層析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等。因此凝膠層析技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時(shí)還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定、脫鹽、樣品濃縮等。凝膠層析：凝膠顆粒多孔板——凝膠（瓊脂糖/葡聚糖/聚丙烯酰胺）——液體（洗脫液）固定相流動(dòng)相多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)原理：混合物中各組分按其分子顆粒大小不同而被分離的技術(shù)。凝膠層析又稱分子篩層析分離鑒定不同分子量大小的蛋白質(zhì)用什么方法？影響凝膠層析效果的因素：

1．層析柱的選擇

層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對(duì)分辨率的要求來(lái)進(jìn)行選擇。一般來(lái)講，主要是層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長(zhǎng)度不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過(guò)慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在1：25～1：100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對(duì)分辨率要求較低，所以一般比較短。品名干膠顆粒直徑/μm得水值Wf/g.g-1床體積/mL.g-1最適分段分離范圍溶脹所需時(shí)間/h最大流體靜力壓/Pa(cmH2O)球蛋白分子質(zhì)量／Da線性葡聚糖分子質(zhì)量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗細(xì)超細(xì)100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗細(xì)超細(xì)100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超細(xì)40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超細(xì)40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超細(xì)40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超細(xì)40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-20000