小麥erf轉(zhuǎn)錄因子w17互作蛋白的酵母雙雜技術篩選及互作驗證

小麥erf轉(zhuǎn)錄因子w17互作蛋白的酵母雙雜技術篩選及互作驗證

各種植物疾病和其他生物生境，以及干旱和高鹽等非生物生境，嚴重影響了植物的生長和產(chǎn)量。研究植物對逆境信號的感知、傳遞以及適應性響應的分子機制,對于闡明植物適應逆境機制,提高作物抗性有著重要的意義。植物在長期進化過程中形成了一套復雜而精細的信號傳遞網(wǎng)絡,能對外界脅迫信號產(chǎn)生一系列應答響應,誘導抗逆相關基因的表達,保護細胞正常的生命活動。其中,轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)對信號傳遞和基因的表達調(diào)控起非常重要的作用。植物體內(nèi)存在大量的轉(zhuǎn)錄因子,擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有5.9%的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子,根據(jù)DNA結(jié)構域的特點將轉(zhuǎn)錄因子分成若干個家族,如WRKY、AP2/EREBP、MYB和bZIP。AP2/EREBP家族是植物中分布最為廣泛且研究比較深入的一類轉(zhuǎn)錄因子,包括AP2、RAV、DREB、ERF和AL0793495個亞族。ERF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP家族中最大的一個亞族,參與GCC-box和DRE/CRT順式元件的調(diào)控,介導植物生物和非生物兩條脅迫信號傳遞途徑,在脅迫相關基因的表達調(diào)控中起重要作用。例如,煙草的Tsi1和辣椒的CaPF1蛋白能夠結(jié)合GCC-box和DRE/CRT元件,誘導PR基因(PR1、PR2、PR3、osmotin、SAR8.2)和RD/COR基因(COR47、COR6.6、COR78/RD29)的表達,從而提高植株的抗性。ERF基因在提高植物抗病性和非生物脅迫抗性上發(fā)揮著重要作用。據(jù)報道,煙草Tsi1基因的超表達提高了辣椒對細菌和病毒的抗性;轉(zhuǎn)大麥HvRAF基因的擬南芥植株增強了對青枯病的抗病力;大豆GmERF057基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草對細菌、鹽和干旱的抗性;JERF1和JERF3基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽、抗旱和抗寒性;將辣椒的CaPF1基因轉(zhuǎn)到弗吉尼亞松(PinusvirginianaMill.)中,提高了轉(zhuǎn)基因樹木對重金屬、高溫和病原菌等多種抗性,而且明顯增加了植株生長高度;轉(zhuǎn)小麥TaERF1基因的擬南芥提高了對低溫、干旱、高鹽以及灰霉病(Botrytiscinerea)的抵抗力,轉(zhuǎn)TaERF1基因的煙草增加了植株的抗鹽性和對野火病(Pseudomonassyringae)的抗病性。解析逆境脅迫信號調(diào)控網(wǎng)絡已經(jīng)成為當前植物逆境應答反應分子機制研究的熱點。過去幾年,對ERF基因的研究主要集中在可能介導的信號傳遞途徑、對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能上,而對ERF蛋白的作用模式,包括與其他蛋白的互作機制研究甚少。轉(zhuǎn)錄因子的活性受許多因素的影響,如轉(zhuǎn)譯后修飾以及與其他蛋白之間的相互作用。例如,擬南芥細胞核提取物能增強擬南芥GBF1轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力。因此,研究轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白及其功能,對于研究轉(zhuǎn)錄因子的作用機制和抗逆相關基因的調(diào)控具有重要的意義。小麥是我國的重要糧食作物,生物和非生物脅迫嚴重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。我們從小麥中克隆了一個ERF基因W17,受干旱、脫落酸(ABA)和乙烯等誘導,可顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和抗病性;W17蛋白具有核定位功能,可通過自身的NLS進入核內(nèi)行使功能。為了進一步研究W17的作用機制,本文采用酵母雙雜交技術,以W17作為“誘餌”蛋白,從小麥cDNA文庫中篩選互作蛋白,為進一步解析ERF蛋白的作用機制提供依據(jù)。1材料和方法1.1小麥葉片rna提取及pcr擴增將普通小麥(TriticumaestivumL.)品種小白麥播種在苗床上,20~24℃生長10d左右,從土壤中取出用蒸餾水沖洗干凈,放在濾紙上干旱處理2h,取葉片立即放入液氮中,并保存在–80℃條件下準備提取RNA。采用Trizol法(TianGen,北京)提取小麥葉片總RNA,第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(TaKaRa,大連)。采用SMART法(BD)合成dscDNA取2μLcDNA在100μL體系中進行LD-PCR擴增循環(huán)數(shù)為24,延伸時間為6min。擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5μL在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。1.2質(zhì)粒pmg7-w17的酶切位點鑒定根據(jù)W17基因的序列及pGBKT7(Clontech,美國)的克隆位點,在基因的兩端分別引入EcoRI和BamHI(Promega,美國)酶切位點。酶切、連接(T4連接酶,Promaga,美國)到質(zhì)粒pGBKT7。測序驗證融合質(zhì)粒pGBKT7-W17克隆正確。將pGBKT7-W17、空pGBKT7以及陰性對照分別與pGADT7共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中,SD/–Trp/–Leu(Sigma,德國)和SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade(Sigma,德國)平板篩選培養(yǎng),驗證pGBKT7-W17是否具有自激活活性。1.3ah109感受態(tài)細胞的制備采用酵母雙雜交系統(tǒng)(Clontech,美國),按說明書(MATCHMAK2ERpLexATwo-HybridUserManual和YeastProtocolsHandbook)方法制備AH109感受態(tài)細胞,將pGBKT7-W17質(zhì)粒、pGADT7和小麥文庫混合轉(zhuǎn)入酵母細胞AH109。1.4改性藍色克隆的構建誘餌載體BD質(zhì)粒pGBKT7帶有Trp篩選標記,AD質(zhì)粒pGADT7帶有Leu篩選標記。將pGBKT7-W17、pGADT7和文庫質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)化AH109,涂布于SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade營養(yǎng)缺陷型平板,30℃培養(yǎng)3~5d,用牙簽挑取直徑大于2mm的陽性克隆,然后在SD/Raf/Gal/X-gal(Sigma,德國)平板上畫線培養(yǎng),篩選藍色克隆。1.5替代pgpcr檢測、序列和分析1.6酵母菌種的生長按前述方法制備酵母AH109感受態(tài)細胞。采用共轉(zhuǎn)化方法將pGBKT7-W17以及連有可能互作基因的pGBKT7-W17pGADT7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細胞中。將轉(zhuǎn)化后的酵母劃線于SD/–Trp/–Leu平板上。若酵母菌株在SD/–Trp/–Leu平板上生長則證明誘餌載體和可能的互作質(zhì)粒載體均已轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中。挑取SD/–Trp/–Leu平板上生長的單克隆菌株于1mLYPDA液體培養(yǎng)基中。在30℃下振蕩培養(yǎng)2d后,吸取1μL酵母菌液點到SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal平板上。將平板置于30℃培養(yǎng)3~4d后長出藍色菌落組合為互作陽性結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1ssna擴增所提取的小麥總RNA經(jīng)紫外分光光度計分析,A260/A280=1.85。1%瓊脂糖凝膠電泳可見28S和18S的清晰RNA條帶,而且28SRNA是18SRNA的2倍左右(圖1),表明獲得的總RNA純度及濃度較高,可以滿足后續(xù)實驗的需要。用3μL總RNA為模板合成cDNA,取2μLcDNA進行LD-PCR擴增dscDNA。合成的dscDNA質(zhì)量較好,主要集中在250~2000bp之間(圖2),可以用于cDNA文庫的構建。2.2營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選將W17基因全長克隆到誘餌載體pGBKT7中得到重組質(zhì)粒pGBKT7-W17。經(jīng)酶切(圖3)并測序鑒定,W17基因已成功插入質(zhì)粒pGBKT7中。為檢測重組質(zhì)粒是否具有自激活活性,將pGBKT7-W17、空pGBKT7以及陰性對照分別與pGADT7共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中,SD/–Trp/–Leu和SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade平板篩選培養(yǎng)2~3d(圖4),除陰性對照外在SD/–Trp/–Leu平板上都能長出菌落,在SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade平板上都沒有長出菌落,說明pGBKT7-W17沒有自激活活性,可以在營養(yǎng)缺陷型SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade平板篩選培養(yǎng)上用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選小麥cDNA文庫。2.3營養(yǎng)缺陷型sd/–trp/–ade平板的篩選結(jié)果將“誘餌”質(zhì)粒pGBK-W17、文庫質(zhì)粒pGADT7混合轉(zhuǎn)化AH109,涂布于營養(yǎng)缺陷型SD/–Trp–Leu/–His/–Ade平板,30℃培養(yǎng)3~5d,選擇直徑大于2mm的菌落,共得到160個候選克隆(圖5-A)。牙簽挑取候選克隆,在SD/Raf/Gal/X-gal平板上畫線培養(yǎng),大約1/5的陽性克隆顯藍色(圖5-B)。2.4酵母質(zhì)粒pcr和dh5檢測將顯藍的克隆進行PCR檢測,檢測結(jié)果顯示插入片段多數(shù)大小不一,但是大多數(shù)集中在500~2000bp(圖6),說明cDNA文庫的質(zhì)量較好?？寺?0和克隆11有2條PCR擴增帶,可能有2個質(zhì)粒被轉(zhuǎn)到酵母細胞,需要進一步鑒定。將擴增帶大于500bp的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行測序,測序結(jié)果提交到GenBank進行BLAST分析。結(jié)果表明,克隆到的基因主要分為脅迫相關功能基因、翻譯后修飾蛋白、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亞基/小亞基以及功能未知蛋白4類。部分測序結(jié)果及其可能的功能見表1。2.5營養(yǎng)缺陷型sd/–trp/–his/—蛋白的互作驗證將誘餌和候選蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞,在營養(yǎng)缺陷型SD/–Trp/–Leu平板上劃線培養(yǎng),挑取單菌落搖菌,吸取1μL點至SD/–Trp/–Leu平板上。酵母在SD/–Trp/–Leu平板上生長證明互作組合蛋白均轉(zhuǎn)化入酵母細胞中。再吸取1μL菌液點在營養(yǎng)缺陷型SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal平板上培養(yǎng),結(jié)果顯示HSP90和PPR的菌落能正常生長且菌落顯藍色(圖7)。這一結(jié)果初步證實HSP90和PPR蛋白與W17發(fā)生了相互作用。3hsp29基因家族在信號傳遞中的作用酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)雖然仍有一定的局限性,如要求蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi);同時該系統(tǒng)不適用某些需經(jīng)過翻譯后加工才能相互作用的蛋白,但仍然是從cDNA文庫中尋找新的互作蛋白的一種快捷有效的方法。本研究構建了小麥cDNA文庫,用酵母雙雜交技術篩選到4類與ERF轉(zhuǎn)錄因子W17相互作用的候選蛋白,為深入研究W17的抗逆機制奠定了基礎。早期研究表明,ERF基因家族介入了乙烯信號調(diào)控途徑,但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)乙烯、茉莉酸、水楊酸和ABA等幾種重要的信號分子傳遞途徑都參與了對ERF基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[18,19,20,21,22,23,24]。因此,ERF轉(zhuǎn)錄因子家族可能在乙烯、茉莉酸、水楊酸和ABA信號傳遞途徑中處于核心位置,參與對不同信號的傳遞和對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前,對ERF基因家族在不同信號傳遞中的作用以及信號傳遞涉及到的蛋白尚不清楚。許多ERF蛋白功能的發(fā)揮需要轉(zhuǎn)錄后修飾或參與蛋白間的互作,包括轉(zhuǎn)錄因子、腈水解酶和泛素連接酶等。因此,篩選W17互作蛋白、構筑互作圖譜、分析互作機制對揭示W(wǎng)17基因在不同信號傳遞中的作用及其轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控具有的重要意義。本研究獲得的W17互作蛋白的大部分都與植物的抗逆、基因表達調(diào)控有關。HSP90是一類大量存在且高度保守的分子伴侶在細胞的生長進程中起著至關重要的作用。葉綠體特異性的HSP90-5突變導致擬南芥對紅光應答、氯酸鹽抗性的改變和cr88突變體中組成型的葉綠體發(fā)育的延遲;敲除HSP90基因能導致植物形態(tài)學的改變。最近發(fā)現(xiàn),HSP90介導了對植物的抗逆響應。胞質(zhì)HSP90與R蛋白之間互作而具有抗病性;在擬南芥和煙草中,多個證據(jù)表明HSP90、SGT1及RAR1之間存在相互作用,這種互作對R蛋白的活性起重要作用。在逆境條件下分子伴侶HSP90產(chǎn)物急劇增加,幫助靶蛋白正確折疊、或清除損傷的靶蛋白,從而幫助細胞恢復正常狀態(tài)并提高生存能力。因此,我們推測HSP90可能參與了小麥ERF轉(zhuǎn)錄因子介導的信號傳遞網(wǎng)絡。PPR基因家族在線粒體和葉綠體基因表達調(diào)控中具有重要作用。玉米PPR蛋白CRP1定位在葉綠體的基質(zhì)上,參與葉綠體基因petD和petA轉(zhuǎn)錄本的翻譯以及對petD初始轉(zhuǎn)錄本進行加工。擬南芥PPR蛋白HCF152是葉綠體RNA加工和剪接因子,參與psbB-psbT-psbH-petB-petD轉(zhuǎn)錄本的正確加工過程。此外,PPR蛋白在線粒體RNA的加工過程中也具有重要的作用。酵母PPR蛋白PET309定位在線粒體上,對保持含有內(nèi)含子線粒體基因COX1初始轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性和成熟mRNA翻譯起重要作用。PPR基因不僅對細胞器基因進行調(diào)節(jié),而且對細胞器外一些基因的表達也起作用。例如,果蠅PPR蛋白BSF對果蠅早期胚胎發(fā)育模式的形成起作用,它特異地結(jié)合在bicoidmRNA3′端非翻譯區(qū),提高mRNA的穩(wěn)定性。本研