胭脂魚(yú)精子低溫保存方法的研究

胭脂魚(yú)精子低溫保存方法的研究

梅氏大詞典屬于cyborni屬，屬于脂魚(yú)科?，F(xiàn)知全世界約有該科魚(yú)類13屬68種,其中絕大多數(shù)種類分布于北美洲。胭脂魚(yú)分布于我國(guó)的長(zhǎng)江和閩江,為我國(guó)也是亞洲特有種。該魚(yú)幼魚(yú)還具有體形奇特,背鰭較高(寓意“一帆風(fēng)順”)、體色鮮艷的特點(diǎn),為目前我國(guó)重要的觀賞魚(yú)類之一,有較重要的經(jīng)濟(jì)意義。近幾十年來(lái),由于人類對(duì)自然環(huán)境的影響,生物也受到很大的影響。葛洲壩水利樞紐工程和三峽水利樞紐工程的建成阻礙了胭脂魚(yú)的洄游活動(dòng),加之過(guò)度捕撈,對(duì)胭脂魚(yú)資源自然增殖產(chǎn)生了不利影響。由于其資源量的大大減少和其所具有的重要意義,現(xiàn)胭脂魚(yú)已經(jīng)被列為國(guó)家二類水生野生保護(hù)動(dòng)物。為了保護(hù)這一物種,現(xiàn)已經(jīng)開(kāi)展了胭脂魚(yú)人工繁殖、生物學(xué)特征、胚胎發(fā)育、資源現(xiàn)狀及資源恢復(fù)探討等方面的研究。國(guó)內(nèi)對(duì)淡水魚(yú)類如虹鱒、大銀魚(yú)以及鯉、鰱、鳙的研究表明,采用精子保存液在低溫條件下可延長(zhǎng)這些魚(yú)類精子的活力和壽命,保持受精能力,達(dá)到短期保存的目的。由于胭脂魚(yú)天然產(chǎn)卵場(chǎng)在長(zhǎng)江上游水流湍急處,因此胭脂魚(yú)對(duì)產(chǎn)卵的生態(tài)條件要求較高,人工繁殖技術(shù)難度較大。目前,胭脂魚(yú)的人工繁殖多采用人工授精,而至今尚未見(jiàn)關(guān)于胭脂魚(yú)精子活力、保存及應(yīng)用研究的報(bào)道。胭脂魚(yú)親本量很少,且胭脂魚(yú)的雌雄發(fā)情的時(shí)間不易控制一致,胭脂魚(yú)在多次注射激素后的效應(yīng)時(shí)間內(nèi)也需要多次人工采卵、人工授精。因此,筆者開(kāi)展胭脂魚(yú)精子低溫保存方法研究,旨在為胭脂魚(yú)的人工繁殖、人工授精提供基礎(chǔ)依據(jù)和指導(dǎo)。1材料和方法1.1基肥的催產(chǎn)、催化試驗(yàn)所用的胭脂魚(yú)為安徽省長(zhǎng)江水生動(dòng)物保護(hù)研究中心繁殖用的胭脂魚(yú)親本。在胭脂魚(yú)的繁殖季節(jié),選擇體質(zhì)健壯的胭脂魚(yú)進(jìn)行人工催產(chǎn),在效應(yīng)時(shí)間達(dá)到后,2007年4月7日,將胭脂魚(yú)雄魚(yú)拉起,用毛巾將生殖孔附近的水分擦去,然后輕壓腹部,擠出精液,用預(yù)先準(zhǔn)備好的干凈的滴管吸取精液分別置于放有適量精子保存液的干凈的小瓶中,再將小瓶放進(jìn)冰箱4℃低溫保存。采精過(guò)程中要防止水進(jìn)入精液,盡量避免精液被污染。1.2精子保存液及精漿配方試驗(yàn)共配制了A、B、C、D4種精子保存液,并用0.7%的NaCl溶液(E)作為對(duì)照。各種精子保存的配方如下:(1)精子保存液A(Hanks精子保存液)配方。甲液:NaCl9.600g,KCl0.480g,CaCl20.168g,MgCl2·6H2O0.235g,蒸餾水60ml;乙液:NaHCO30.420g,Na2HPO40.186g,KH2PO40.072g,C6H12O61.091g,蒸餾水60ml。用時(shí)取甲液和乙液各5ml,然后加去離子水至100ml,即制成精子保存液A。(2)精子保存液B(人工精漿A)配方。NaCl127.0mmol/L,KCl37.3mmol/L,CaCl22.6mmol/L,MgCl2·6H2O1.5mmol/L,NaHCO35.0mmol/L。(3)精子保存液C配方。NaCl80mmol/L,KCl50mmol/L,CaCl25mmol/L,MgCl2·6H2O2mmol/L,NaHCO350mmol/L,C6H12O610mmol/L。該保存液中加入了鏈霉素,濃度為80萬(wàn)IU/L。(4)精子保存液D(Ringer氏液)配方。NaCl7.526g,KCl0.417g,CaCl20.322g,MgCl2·6H2O0.203g,NaHCO30.193g,KH2PO40.122g,C6H12O62.910g,配成1000ml。1.3精子活力的測(cè)定精子活率(精子激活比例):已激活的呈快速直線活動(dòng)的精子占檢測(cè)精子總數(shù)的百分比。精子壽命(精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間):從精子激活開(kāi)始至運(yùn)動(dòng)停止所經(jīng)歷的時(shí)間。該研究用精子活率為指標(biāo)對(duì)精子活力進(jìn)行評(píng)價(jià),從而判斷保存液對(duì)精子的保存效果。精子活力觀察方法參照文獻(xiàn)并加以改進(jìn)。觀察時(shí),先用膠頭滴管吸1滴水于載玻片上,在10×10的倍數(shù)下對(duì)準(zhǔn)視野,然后將保存有精子的保存液搖勻,用解剖針在其中蘸一下,取出后立即在載玻片上的液滴中攪勻并迅速觀察其運(yùn)動(dòng)情況,每個(gè)樣品每一循環(huán)觀察3次,觀察后綜合評(píng)判并進(jìn)行記錄。記錄的方法為:“+++”表示100%精子快速運(yùn)動(dòng);“++”表示80%左右的精子在快速運(yùn)動(dòng);“+”表示50%左右的精子在快速運(yùn)動(dòng);“+-”表示10%～30%精子快速運(yùn)動(dòng);“-”表示全都死亡或少量在原地振動(dòng)。1.4基肥精卵的制備2007年4月7日和2008年4月11日,使用精子保存液B進(jìn)行人工授精應(yīng)用,在人工注射激素的效應(yīng)時(shí)間內(nèi),將胭脂魚(yú)雄魚(yú)拉起,用毛巾將生殖孔附近的水分擦去,然后輕壓腹部擠出精液于培養(yǎng)皿中,加入5～7倍的精子保存液備用。然后拉起雌魚(yú)擠出卵子實(shí)施干法人工授精,精卵混合后用羽毛攪拌后加入水刺激,再放入孵化設(shè)施孵化。胭脂魚(yú)雌魚(yú)需要3～5次采卵,時(shí)間需要7～10h,如長(zhǎng)時(shí)間使用需要在4℃保存。待胚胎發(fā)育到原腸中期計(jì)算受精率。2結(jié)果與分析2.1精子的活率測(cè)定表1顯示,用A液保存胭脂魚(yú)精子,保存時(shí)間為20～31h,精子的活率保持在80%左右;48h檢測(cè),精子活率下降為50%左右,這種情況維持到84h;在96h時(shí)下降為10%～30%;到108h時(shí)精子幾乎全部死亡。用B液保存胭脂魚(yú)精子,保存時(shí)間為20～120h,精子的活率保持在80%左右;在132h時(shí),精子活率下降為50%左右,這種情況維持到156h;在168h時(shí)下降為10%～30%;到216h時(shí)檢測(cè)精子幾乎全部死亡。用C液保存胭脂魚(yú)精子,首次檢測(cè)(20h)時(shí)活率即為50%左右,在22h時(shí)下降為10%～30%;在24h檢測(cè)時(shí),精子幾乎全部死亡。用D液保存,保存時(shí)間為20～84h,精子的活率保持在80%左右;在96h時(shí),精子活率下降為50%左右;在108h時(shí),精子活率下降為10%～30%,這種情況一直維持到216h;到228h檢測(cè)時(shí),精子幾乎全部死亡。用E液保存,在20h時(shí)精子的活率為50%左右;在22h時(shí)下降為10%～30%,這種情況維持到29h;在31h觀測(cè)時(shí),精子幾乎全部死亡。2.2采用桂脂魚(yú)精迅速移動(dòng)淡水過(guò)程胭脂魚(yú)精子在水溫為18℃淡水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(24.0±3.5)s,壽命為(128.0±9.5)s。2.3不同精密度、第1批與第2批卵2007～2008年,精子保存液B在胭脂魚(yú)的人工授精中進(jìn)行應(yīng)用,由于卵子分批采出,成熟度有所差別,第1批采出的卵和最后一批卵的受精情況不同,受精率在53%～85%波動(dòng)。3不同的人工精漿b對(duì)不同保存液的精子的影響對(duì)胭脂魚(yú)精子保存結(jié)果分析表明,精子保存液B和D的保存效果較好,雖然D液中精子保存時(shí)間比B液中的長(zhǎng),但綜合評(píng)價(jià)還是B液的保存效果最好。從其二者成分可知,B液含有NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2·6H2O、NaHCO3,D液除了含有B液中的物質(zhì)外還含有KH2PO4、C6H12O6。其中NaHCO3、KH2PO4為緩沖物質(zhì)用于調(diào)節(jié)精子保存液pH值,以使精子保存液的pH達(dá)到有利于精子保存的目的。據(jù)嚴(yán)安生等鯉魚(yú)和團(tuán)頭魴精子影響的研究表明,添加鈣、鎂離子能對(duì)精子的活動(dòng)起到一定的抑制作用,所以在精子保存液中常加入CaCl2和MgCl2這兩種物質(zhì)。該試驗(yàn)的對(duì)照組用0.7%NaCl溶液對(duì)胭脂魚(yú)精子進(jìn)行保存的效果不佳。據(jù)趙亞龍等的研究,大口胭脂魚(yú)精子在NaCl濃度達(dá)1.0%時(shí),精子出現(xiàn)不活動(dòng)狀態(tài),但滴加1滴去離子水后,精子可被激活,出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。但是,當(dāng)NaCl濃度達(dá)4.0%時(shí),滴加去離子水不能激活大口胭脂魚(yú)精子,認(rèn)為這可能是由于高滲環(huán)境,精子自身能量全部用于調(diào)節(jié)滲透壓,從而導(dǎo)致死亡。而用1.0%NaCl溶液對(duì)胭脂魚(yú)精子進(jìn)行短期保存是否可達(dá)到較好的結(jié)果尚待進(jìn)一步研究。該研究中的保存液C是在人工精漿B的基礎(chǔ)上添加了葡萄糖和鏈霉素。葡萄糖的添加量為0.1mol/L,鏈霉素的添加量為80萬(wàn)IU/L。連晉等用人工精漿B添加抗生素在大銀魚(yú)精子保存的研究中曾有較好的效果。另外,嚴(yán)安生等對(duì)鈣、鎂離子對(duì)對(duì)鯉、團(tuán)頭魴的研究表明,單糖對(duì)精子的活力有影響,能為保存液中的精子提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。可是,筆者試驗(yàn)中在人工精漿B的基礎(chǔ)上所配制的C液卻沒(méi)有達(dá)到較好的結(jié)果,甚至產(chǎn)生了反作用,其原因尚待進(jìn)一步研究。綜上所述,采用精子保存液低溫保存胭脂魚(yú)精子的方法是切實(shí)可行的