免疫組化實驗方法

免

疫

組

化

實

驗

方

法免

疫

組

織

化

學(xué)

的

概

念利

用抗

原

與

抗

體

特

異

性

結(jié)

合

的

原

理

，

通

過

化學(xué)

反

應(yīng)

使

標

記

抗

體

的

顯

色

劑

(

熒

光

素

、

酶、

金

屬

離

子

、

同

位

素

顯

色

來

確

定

組

織

細

胞

內(nèi)

抗

原

(

多

肽

和

蛋

白

質(zhì)

，

對

其

進

行

定

位

、

定

性

及

定

量

的

研

究

，

稱

為

免

疫

組

織

化

學(xué)

.2最

突

出

的

優(yōu)

點·

在更廣闊的范圍內(nèi)，把結(jié)構(gòu)與功能及代謝結(jié)

合起來

，

在微觀世界原位地確定組織及細胞

結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，達到方法統(tǒng)一，定性可靠，定

位準確，定量可能.3免

疫

組

化

實

驗

標

本·組織標本

(

石

蠟切片

和

冰

凍切片●

細

胞

標

本

〔

組織印

片、

細

胞

爬

片

和

細

胞

涂片.·

石

蠟

切

片

對

于

組

織

形

態(tài)

保

存

好，

且

能

作

連

續(xù)

切片

，

有利于各種染色對照觀察

；

還能長期存

檔

；4細

胞

和

組

織

的

固

定1.

固定的作用--使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固、終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活

性，最大限度地保存細胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌?2.選擇最佳固定液的標準：

保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；保存抗原性.〔1醛類固定劑：

穿透性較強，收縮性小，是常用的固定劑.如10%中性福爾

馬林液、4%多聚甲醛緩沖液、戊二醛-甲醛液、

乙酸-甲醛液等.(2非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚甲醛混合使用.(3丙酸及醇類固定劑：

沉淀蛋白質(zhì)和糖，保存抗原性較好.但對低分子蛋

白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)的保存效果較差，和其它試劑混合使用加以

解決，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、

甲醛等.3.常用的固定方法--浸入法和灌注法〔適用于動物實驗研究組

織新

鮮

勿

干

燥

體

積

適中固定

液

足

夠(

>

2

0

倍5抗

體常

用

的

抗

體

為

單

克

隆

抗

體

和

多

克

隆

抗

體

.特

性

比

較

：均

一

性2.

穩(wěn)

定

性3.

特

異

性4.

重

復(fù)

性5.

沉淀

反

應(yīng)6熒

光

素

標

記

抗

體能

夠

產(chǎn)

生

熒

光

并

能

作

為

染

料

的

化

合

物

稱

為

熒

光

色

素

.

必備

條

件

：③

熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰

判斷結(jié)果.④

結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無

影響，用于活體內(nèi)標記，結(jié)合物應(yīng)無毒，附加抗原性小.7常

用

的

染

色

方

法·根

據(jù)

標

記

物

的

不

同

分

為

免

疫

熒

光

法

，

免

疫

酶

標法

，

親和組織化學(xué)法·按

標

記

物

定

位

于

抗

原

所

在

部

位

的

手

段

，

則

可

將免

疫

細

胞

組

織

化

學(xué)

染

色

方

法

分

為

直

接

法

(一

步

法、

間

接

法(二步

法、

橋

連

法

等.

每進

行

一

步

結(jié)

合

反

應(yīng)

.

都

會

產(chǎn)

生

一

次陽

性

結(jié)

果的

放

大

效

應(yīng)

.

敏

感

性

由

高

到

低

依

次

為

橋

連

法、

間

接

法、

直

接

法

.8染

色

的

基

本

程

序①

標

記

抗

體

與

標

本

中

抗

原

反

應(yīng)

結(jié)

合

；②

用

緩

沖

液

洗

去

未

結(jié)

合

的

成

分

；③

直

接

觀

察

結(jié)

果

；

或

顯

色

后

再用

顯

微鏡

觀

察.9反

應(yīng)

條

件抗原抗體結(jié)合屬于可逆性反應(yīng)，具有共性的反應(yīng)條件：(1PH:

中性及弱鹼性條件(PH7～8有利于免疫復(fù)合物的形成(2離子強度：

0.01～0.02M的低離于強度有利于免疫復(fù)合物的形成(3去污劑：

有利于復(fù)合物的形成，常用的非離子型去污劑有吐溫-20,EDTA〔0.01%,Triton

X-100〔0.1～1%(4抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度：

稀釋液中含無關(guān)蛋白質(zhì)可以減少抗體的非

特異吸附，常用牛血清白蛋白(5防腐劑：微生物生長會干擾抗原抗體反應(yīng)，稀釋液和抗體液中加入適量

的疊氮鈉或硫柳汞以防腐〔6溫度和時間：較高的反應(yīng)溫度〔37℃可加速抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，低溫有

利于抗原抗體結(jié)合率的提高(7洗滌：除去未結(jié)合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色.選用自來水、生理鹽水或PBS等，加去污劑并在洗滌過程中加以振搖10熒

光

素1,異硫氰酸熒光黃(fluoresceinisothiocyanate,FITC黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉

末，最大吸收光譜為490～495

nm,最大發(fā)射光譜為520～530

nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光.最常用.2.

四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyante,TRITC紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm,最大發(fā)射光譜620nm,呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明.3.四乙基羅丹明(tetraethylrhodamineB

200,RB200褐紅色粉未，最大吸收光譜570nm,最大發(fā)射光譜596～600nm,呈橙紅色熒光.價廉.11染

色

注

意

事

項(1在濕盒內(nèi)進行，以免標本上的試劑干燥.(2

酸

堿

度以接

近

體

液

環(huán)

境

為

宜

(PH7.4左

右(3組織細胞要求新鮮，最好使用冷凍切片，固定存檔標本

要

求

組

織

結(jié)

構(gòu)

完

好

.(4切片經(jīng)染色后，應(yīng)及時觀察并照相.切片在4℃冰箱內(nèi)過夜，其熒光強度將減弱約30%.(5調(diào)整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果，以背景非特異性染色最小為標準，對每一批抗體必須試驗摸索，找出

最

佳

稀

釋

度.(6所購抗體應(yīng)及早使用，盡量減少抗體溶液的凍融次數(shù)

.12酶

標

抗

體

法·

通

過

共

價

鍵

將

酶

結(jié)

合

在

抗

體

上

制

成

酶

標

抗

體

，再借酶對底物的特異性催化作用

，

生成有色的

不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進行細胞或組織表面或內(nèi)

部

某

種

抗

原

成

分

定

位

觀

察

.·

常

用的

酶

-

-

辣

根

過

氧

化

物

酶

〔HRP,

堿性磷

酸

酶

(AL

P及葡萄

糖

氧

化

酶

(GOD

等

.·優(yōu)點：與免疫熒光技術(shù)相比，終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，經(jīng)鋨酸處理后，

電子密度增強，可用于電鏡觀察.13抗

生

物

素

-

生

物

素

-

過

氧

化

物

酶

技

術(shù)<avidin-biotin

peroxidasecomplexABC>·

原理：利用抗生物素分別連接生物素標記的第2抗體和

生物素標記的酶.其第1抗體不為標記物所標記，生物素標

記的第2抗體與ABC復(fù)合物相連接.ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物

與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的.常用：

·

ABC-HRP辣根過氧化物酶：最通用的系統(tǒng)，使用范圍廣·

ABC-AP堿性磷酸酶：

靈敏度比較高，染色密度較低·

ABC-GO葡萄糖氧化酶；

靈敏度較低，適用于組織內(nèi)源性

HRP或者AP含量比較高的組織，常與HRP或者AP系統(tǒng)配合

進行雙染14

dyal

edAntibody2Add

EnzymeSubstrate45ryatnnSBA

drdi

mary

Antibody1Ad

idin/BiotinylatedEnzyme3vd)plexCmBo(ACABC

法

的

特

點

：敏

感

性

強特異性強，背景染色淡方

法簡便，節(jié)約時間

可

用

于

雙

重

或

多

重

免

疫

染

色

.16免

疫

金

染

色

原

理

：免

疫

金

染

色

技

術(shù)

使

用

膠

體

金

耦

聯(lián)

抗體，然后在光學(xué)顯微鏡下檢測抗原

.

解

決

了

免

疫

組

化

里

內(nèi)

源

性

酶

干

擾的

問

題

.整

個

檢

測

過

程

中

無

需

酶

的

參

與

，因

此不

必

預(yù)

先

處理

樣

本

以

消

除

內(nèi)

源

性

酶

17免

疫

組

化

試

劑

的

正

確

選

擇

和

使

用18一

抗1.

首

選

單

克

隆

抗

體

：單

克

隆

抗

體

具

有

高

特

異

性

、

高

親

和

力

、

交

叉

反應(yīng)少等特點

，

避免與細胞或組織蛋白的非特異性結(jié)合

，

減少染

色

背

景

.2.

多

克

隆

抗

體

：

最

好

是

經(jīng)

樣

本

來

源

種

屬正

常

血

清吸附過，盡可能的

減

少

非

特

異

性

著

色

背

景

.

加

一抗

前

，

用

封

閉

液〔

可以是BSA

或二。十

求

減

塊

工

書

→

B

上

心二

抗種

屬

來

源

要

匹

配

；根

據(jù)

所

用

一

抗

選

定二

抗

.

一般來說

，

如果一抗是小鼠原性

，二抗應(yīng)選擇兔

/

山

羊

或

其

它

種

屬

抗

小

鼠

的

抗

體

.注

意

抗

體

同

種

型

和

亞

型

：

確

定

一

抗

同

種

型

和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對一抗亞型的二抗.如一抗是小鼠lgG1,可

以選用山羊抗小鼠的Ig或lgG1的二抗.正

確

使

用

：

也

需

要

重

新

選

擇

稀

釋

比

例

.

一

般

從

°設(shè)

立

陽

性

對

照

和

陰

性

對

照--證明實驗系統(tǒng)的正確性1.

陽

性

對

照

；主

要

涉

及

所

用緩

沖

液、

稀

釋液、

二

抗

和

檢

測

系

統(tǒng)

等

因

素

.

尤

其

在

結(jié)

果

出

現(xiàn)

無

信

號

時

，

為

查

找

原

因

提

供

重

要

線

索

.2.

陰

性

對

照

：

一

種

是

自

身

對