高效液相色譜法分析檳榔中的多酚類物質(zhì)

高效液相色譜法分析檳榔中的多酚類物質(zhì)

在植物食物中發(fā)現(xiàn)了幾種酚，它們以多個(gè)酚類化合物而聞名。這是一種潛在的健康作用。氧化損傷是導(dǎo)致許多慢性病,如心血管病,癌癥和衰老的重要原因。多酚的強(qiáng)抗氧化功能可以對(duì)這些慢性病起到預(yù)防作用。檳榔(ArecacatechuL.)中的活性物質(zhì)主要包括生物堿和多酚類,近期研究發(fā)現(xiàn)檳榔的0許多功效如抗細(xì)菌、真菌和病毒的作用;抗老化作用;降低膽固醇作用;抗氧化作用,增強(qiáng)纖溶酶活性,抗凝血酶作用等都與其所含的多酚有關(guān)系。目前對(duì)檳榔中生物堿的研究很多,而對(duì)檳榔中的多酚類研究較少。測(cè)定方法主要是用分光光度法,只能測(cè)定檳榔中多酚的總含量,而無(wú)法測(cè)定是那種多酚,這對(duì)于檳榔的深加工不利。我們利用高效液相色譜法測(cè)定了檳榔中的9種多酚類物質(zhì):單寧酸、焦性沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。這對(duì)于檳榔的精深加工,以及引導(dǎo)檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展,充分利用資源,挖掘其藥用價(jià)值,具有重要意義1試驗(yàn)部分1.1健康品質(zhì)分析Waters高效液相色譜儀,配1525泵、717+自動(dòng)進(jìn)樣器、2487紫外檢測(cè)器、EMPOWER色譜工作站。單寧酸、焦性沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。乙腈為色譜純,甲醇、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、冰醋酸為分析純;水為超純水,流動(dòng)相經(jīng)0.45um微孔濾膜減壓過(guò)濾。樣品為樣品海南產(chǎn)檳榔:5月份采摘的嫩果、11月份采摘的成熟果。1.2流動(dòng)相及紫外檢出液色譜條件:色譜柱:kromasilC18150mm×4.6mm(i.d),粒徑5μm,或相當(dāng)者。流動(dòng)相A:2%冰醋酸水溶液,流動(dòng)相B:乙腈,采用梯度洗脫程序:0min,95%A;18min,81.5%A;18.5~24.0min,95%A;用前過(guò)0.45μm濾膜。流速:0.80mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。進(jìn)樣量:10μL。1.3對(duì)照品溶液配制檳榔多酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取單寧酸、焦性沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)照品10mg,分別置于10mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容配成濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液。檳榔多酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備:準(zhǔn)確量取適量檳榔多酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為5.00、10.00、20.00、40.00、80.00和160.0μg/mL的檳榔多酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。1.4石油醚萃取-正丁醇萃取法提取:稱取10g(精確至0.01g)檳榔樣品,置250mL錐形瓶中,加100mL甲醇,低溫超聲15min,濾出濾液后殘?jiān)偌尤?0mL甲醇超聲10min,合并濾液,45℃水浴真空濃縮近干。萃取:(1)將濃縮物加入50mL水混勻,再加入50mL石油醚萃取兩次,合并石油醚萃取層,30℃水浴真空濃縮近干。(2)將(1)石油醚萃取完后的水層,用50mL乙酸乙酯重復(fù)萃取兩次,合并乙酸乙酯萃取層,45℃水浴真空濃縮近干。(3)將(2)乙酸乙酯萃取完后的水層,用50mL正丁醇重復(fù)萃取兩次,合并正丁醇萃取層,80℃水浴真空濃縮近干。(4)將(3)正丁醇萃取完后的水層,70℃水浴真空濃縮近干。將萃取物(1)、(2)、(3)和(4),分別用乙腈:2%醋酸水溶液(50∶50)定容至10mL,搖勻,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后供高效液相色譜分析。樣品中某種多酚的含量是(1)、(2)、(3)和(4)萃取部分的該多酚含量的總和。2結(jié)果和討論2.1酸和以乙酸鈉為主的乙酸水溶液根據(jù)多酚的性質(zhì)和參考文獻(xiàn),本實(shí)驗(yàn)對(duì)幾種體系的流動(dòng)相進(jìn)行了考察:甲醇-水,乙腈-水,甲醇-乙酸-水,甲醇-磷酸-水,乙腈-磷酸-水,乙腈-乙酸-水,由于乙腈洗脫能力比甲醇強(qiáng),而酸的加入抑制了多酚的酚羥基的電離,防止了峰的拖尾,從而使分離達(dá)到一個(gè)滿意的程度;而且乙酸是弱酸,不會(huì)因?yàn)榧尤塍w積的微小變化,而導(dǎo)致流動(dòng)相PH的較大變化,影響分離。比較了0.3%、2%、5%的乙酸水溶液,當(dāng)乙酸濃度為0.3%時(shí),各峰分離度很差;乙酸濃度為5%時(shí),酸度偏大,對(duì)柱子有傷害;乙酸濃度為2%時(shí),而PH約為3.5,在柱子使用的PH范圍之內(nèi)。結(jié)果表明,以表1所示梯度表,乙腈-乙酸-水為流動(dòng)相,乙酸的體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí),分離檳榔中的多酚,不僅快速、簡(jiǎn)單而且分離度好。2.2流速和沿面曲面時(shí)各峰間各層中茶素分離度的比較根據(jù)參考文獻(xiàn),酚類物質(zhì)大多在280nm檢測(cè),可獲得較大的靈敏度,而且不受流動(dòng)相中其他物質(zhì)的干擾,故選擇280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。比較了幾個(gè)流速:0.5mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min的分離效果,流速為0.5mL/min時(shí),各峰之間可以完全分離,但耗時(shí)太長(zhǎng);流速為1.0mL/min及以上時(shí),沒(méi)食子酸和沒(méi)食子兒茶素分離度較差;流速為0.8mL/min時(shí),18min已完成9種多酚的分離,而且分離度符合定量要求。柱溫為室溫時(shí),由于采集時(shí)間較長(zhǎng),后面洗脫出來(lái)的峰的保留時(shí)間容易漂移;而柱溫太高(45℃以上時(shí)),時(shí)間長(zhǎng)了容易損傷柱子;所以選擇柱溫為30℃,既保持了峰的保留時(shí)間的重復(fù)性,又延長(zhǎng)了柱子的壽命。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限取1.3節(jié)系列濃度的檳榔多酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按上述色譜條件每種濃度進(jìn)樣10μL,以峰面積Y對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X(g/L)進(jìn)行線性回歸分析,得檳榔多酚回歸方程和相關(guān)系數(shù),見(jiàn)表2。根據(jù)IU-PAC定義,本方法的檢出限為產(chǎn)生響應(yīng)于3倍背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)偏差分析信號(hào)的分析物濃度值。由此可得,檳榔多酚的最小檢出限,見(jiàn)表2。2.4標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差準(zhǔn)確稱取檳榔果樣品兩份,其中一份加入已知量的多酚標(biāo)樣,另一份不加。在相同條件下測(cè)定乙酸乙酯萃取部分6次,根據(jù)加標(biāo)樣品測(cè)出量減去未加標(biāo)樣品測(cè)出量再除以標(biāo)準(zhǔn)加入量回收率,并用6次平行測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗(yàn)結(jié)果證明,本方法有很好的準(zhǔn)確度和精密度,可以滿足定量分析要求,見(jiàn)表3。2.5不同果皮中多酚含量的比較將檳榔樣品按1.4節(jié)進(jìn)行樣品處理,并按照1.2節(jié)的色譜條件,測(cè)得樣品結(jié)果為:幼果的石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分、正丁醇萃取后的水溶液均不含這9種多酚,乙酸乙酯萃取部分含有兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯,含量分別為517mg/kg和11mg/kg。而成熟果仁的石油醚萃取部分不含9種多酚;正丁醇萃取部分含有表沒(méi)食子兒茶素15mg/kg和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯5.0mg/kg;乙酸乙酯萃取部分含有單寧酸、沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素,含量分別為622mg/kg、13.6mg/kg、228mg/kg、1610mg/kg、72mg/kg、164mg/kg。而成熟果皮中石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分、正丁醇萃取后的水溶液均不含這9種多酚;成熟果皮中乙酸乙酯萃取部分含單寧酸和兒茶素,含量分別為26.6mg/kg和4.22mg/kg。3熟ph和食子兒茶素本實(shí)驗(yàn)用HPLC法測(cè)定檳榔中多酚類物質(zhì),有效的將9種多酚分離開(kāi),得到的結(jié)果:檳榔幼果較檳榔成熟果中所含的多酚種類和數(shù)量少,檳榔成熟果中果仁的多酚種類和數(shù)量都遠(yuǎn)較皮中多;檳榔中所含的多酚類成分主要存在于其甲醇提取物乙酸乙酯萃取部份,而其石油醚、正丁醇