密云地區(qū)豬傳染性胃腸炎感染情況調(diào)查獲獎科研報(bào)告

密云地區(qū)豬傳染性胃腸炎感染情況調(diào)查獲獎科研報(bào)告

摘要：豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的各年齡豬以嘔吐、帶嚴(yán)重惡臭的水樣腹瀉、體重下降及嚴(yán)重脫水為癥狀的一種急性傳染病。由于豬腹瀉病致病因素眾多，癥狀相似，難以通過臨床診斷判斷病因。近年來，實(shí)時熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用得到了廣泛的應(yīng)用。本文應(yīng)用實(shí)時熒光PCR技術(shù)，檢測樣品120份，陽性率為16.67%，我區(qū)豬傳染性胃腸炎的感染形式還是比較嚴(yán)重的。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎;實(shí)時熒光PCR

豬傳染性胃腸炎（TransmissibleGastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）引起的以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的傳染病，是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。該病由Doyle和Hutchings于1946年在美國首次報(bào)道，幾年之內(nèi)在世界各個國家和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。在我國，1956年該病首先在廣東省被發(fā)現(xiàn)后，山東、天津、遼寧、甘肅、河北等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)本病。根據(jù)OIE在2005年1月至2012年6月的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國在2006年、2007年和2009年豬傳染性胃腸炎感染總數(shù)較少，低于10萬頭，其他年份則超過10萬頭，2011年竟然高達(dá)36.6萬頭，2012年上半年感染數(shù)也多達(dá)15.9萬頭。各地抽樣陽性率高低不一，但多數(shù)地區(qū)的豬傳染性胃腸炎陽性率在1%～45%之間，個別飼養(yǎng)場甚至高達(dá)72.5%[1]。近年來，該病在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，疫區(qū)也逐步擴(kuò)大，并與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

根據(jù)密云地區(qū)豬腹瀉病發(fā)生發(fā)展情況，為調(diào)查密云地區(qū)豬傳染性胃腸炎感染情況利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。

1材料

1.1豬傳染性胃腸炎檢測試劑盒（實(shí)時熒光PCR法）購自北京佰鷗創(chuàng)投生物技術(shù)有限公司;動物疫病病毒RNA/DNA提取試劑盒購自蘇州天隆生物科技有限公司。

1.2樣本來自密云區(qū)4個規(guī)模養(yǎng)豬場送檢的80份直腸拭子和8個散養(yǎng)戶送檢的40份直腸拭子，將拭子一起放入裝有1.0ml生理鹽水的離心管中備用。

2方法

2.1提取病毒RNA

從試劑盒中取出真空包裝的預(yù)封裝深孔板，顛倒混勻數(shù)次使磁珠重懸，去掉真空包裝，輕甩孔板，使試劑及磁珠均集中到孔板底部。在96孔板的第一列中分別加入20?l蛋白酶K和200?l樣本，按移磁珠、裂解、洗滌、洗脫、棄磁珠的自動化提取程序提取。自動化程序結(jié)束后，將第六列的洗脫液轉(zhuǎn)移到干凈的無核酸酶離心管中。

2.2實(shí)時熒光PCR檢測

2.2.1試劑準(zhǔn)備：

（1）從-20℃冰箱中取出試劑盒，并取出試劑。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需反應(yīng)數(shù)，并根據(jù)表1反應(yīng)體系配制當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

（3）在適當(dāng)容積的無菌離心管中加入上述試劑，混勻后2000rpm離心10s。按照20?l/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管中。

（4）蓋緊PCR反應(yīng)管后將其轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。

（5）每管加入樣本模版5?l，陽性對照和陰性對照也各加5?l.混勻，記錄模板加樣順序，轉(zhuǎn)移至PCR區(qū)進(jìn)行上機(jī)。

2.2.2核酸擴(kuò)增：

開機(jī)預(yù)熱并檢查機(jī)器性能，將準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置。按照表2設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2.3判定

試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：Ct值≤30，有明顯的指數(shù)增長。

（2）陰性對照：Ct值>35或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。

標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤30，有明顯的指數(shù)增長。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在30-35之間。應(yīng)重復(fù)檢測，如果重復(fù)結(jié)果Ct值仍在30-35之間，有明顯的指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>35或無Ct值。

3.結(jié)果

經(jīng)對養(yǎng)殖場戶送檢的120份直腸拭子（4個規(guī)模養(yǎng)豬場送檢的80份直腸拭子和8個散養(yǎng)戶送檢的40份直腸拭子）的檢測，共檢測出陽性樣品20份，陽性率16.67%，其中規(guī)模養(yǎng)豬場4戶，80份樣品，陽性樣品11份，陽性率13.75%;散養(yǎng)戶8戶，40份樣品，陽性樣品9份，陽性率22.50%。

4討論

4.1通過對豬傳染性胃腸炎病原檢測結(jié)果分析，經(jīng)對養(yǎng)殖場戶送檢的120份直腸拭子（4個規(guī)模養(yǎng)豬場送檢的80份直腸拭子和8個散養(yǎng)戶送檢的40份直腸拭子）的檢測，共檢測出陽性樣品20份，陽性率16.67%，目前密云地區(qū)整體情況感染情況比較嚴(yán)重。

4.2傳統(tǒng)的PCR技術(shù)因其不能對病毒核酸進(jìn)行精準(zhǔn)定量而只能進(jìn)行定性分析，從而在很大程度上制約了PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立。近年來，熒光定量RT-PCR方法因其具有定量準(zhǔn)確、敏感性更高（可以檢測到幾個拷貝/?l的病毒核酸）特異性更好等優(yōu)點(diǎn)，在TGEV診斷應(yīng)用中取得了較大進(jìn)展[2]。

4.3防控

TGEV以黏膜感染為主，傳統(tǒng)的疫苗只能為機(jī)體提供被動的保護(hù)，而只有通過黏膜免疫產(chǎn)生的直接針對豬傳染性胃腸炎感染的IgA抗體才能為機(jī)體提供足夠的抵抗病毒