木質(zhì)纖維素降解機(jī)制的研究進(jìn)展

木質(zhì)纖維素降解機(jī)制的研究進(jìn)展

資源和環(huán)境問(wèn)題是人類(lèi)21年面臨的主要挑戰(zhàn)。生物資源是可再生生物資源。地球上的年用化工產(chǎn)品達(dá)到1.5,101,2,0,1011噸。這是人類(lèi)社會(huì)生存的基本物質(zhì)來(lái)源，其中90%以上是木材纖維材料，目前這些資源尚未完全開(kāi)發(fā)利用。隨著世界人口的快速增長(zhǎng)和礦產(chǎn)資源的逐漸稀缺，我們必須有效地開(kāi)發(fā)和轉(zhuǎn)化木材纖維資源的微生物技術(shù)，并利用工農(nóng)業(yè)廢物和其他燃料和原料生產(chǎn)人類(lèi)所需的燃料、飼料和化工。換句話說(shuō)，提取原材料的“綠色化”具有極其重要和光明的發(fā)展前景。與淀粉酶相比,纖維素酶的分子轉(zhuǎn)換率要低數(shù)十倍.長(zhǎng)期以來(lái),關(guān)于纖維素降解機(jī)制的研究都集中在內(nèi)、外切纖維素酶(cellobiohydrolaseⅠ,CBHⅠ;endoglucanaseⅠ,EGⅠ)怎樣催化纖維素分子鏈的β-1,4-糖苷鍵的水解作用方面.20世紀(jì)80年代末期在得到了內(nèi)、外切纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域(catalyticdomain)的結(jié)晶,進(jìn)行了序列分析和解析了其三維結(jié)構(gòu)等研究的基礎(chǔ)上,已基本上弄清纖維素酶催化的水解反應(yīng)與溶菌酶相似,即都遵循“酸/堿催化”的雙置換作用機(jī)制.雖然在分子水平上的研究工作已相當(dāng)深入,但仍然未能闡明天然結(jié)晶纖維素難以被降解的原因.我們認(rèn)為,這主要由于忽略了纖維素分子的超分子結(jié)構(gòu),即聚集態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)降解的影響所造成.針對(duì)這些難點(diǎn),開(kāi)展了多方面的探索性研究,現(xiàn)把取得的進(jìn)展做一簡(jiǎn)介.1纖維素功能的變化酶催化反應(yīng)中,酶分子和底物的構(gòu)象都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,即“誘導(dǎo)—契合”過(guò)程,但纖維的表面不存在游離的分子鏈,它們都為葡萄糖殘基上3個(gè)羥基形成的氫鍵定向排列為各種取向的聚集態(tài)結(jié)構(gòu).外切纖維酶的活性中心是陷入其催化域內(nèi)的隧道狀結(jié)構(gòu),只能容納單一的基元纖維鏈(葡聚糖鏈)進(jìn)入,和在鏈末端進(jìn)行水解.因此,Sinnott提出在纖維素分子鏈中的β-1,4-糖苷鍵發(fā)生水解之前,必需有單一分子鏈的游離.然而,這都只是推測(cè).1997年我們報(bào)道了擬康氏木霉纖維酶經(jīng)木瓜蛋白酶有限酶切,得到其外切和內(nèi)切纖維素酶分子的催化結(jié)構(gòu)域,結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulosebindingdomain,CBD).CBD具有非水解性的破壞纖維結(jié)構(gòu),形成短纖維的功能.此后,通過(guò)基因工程方法在微紫青霉和瑞氏木霉中克隆出的結(jié)合結(jié)構(gòu)域也表現(xiàn)出同樣的功能.掃描隧道顯微圖像顯示出經(jīng)外切纖維素酶吸附結(jié)合結(jié)構(gòu)域作用后,微纖維間的排列表現(xiàn)出無(wú)序化和單一基元纖維鏈分離的情景(圖1).而用纖維長(zhǎng)度和粗度自動(dòng)測(cè)量?jī)x,對(duì)數(shù)千根纖維的纖維長(zhǎng)度和粗度的自動(dòng)測(cè)量的結(jié)果(表1).更進(jìn)一步證實(shí)了經(jīng)CBD作用后,微纖維鍵間氫鏈結(jié)合減弱,吸水力增加,導(dǎo)致纖維溶脹(直徑增大)的結(jié)果.這與紅外光譜分析結(jié)果也相一致(圖2,3).上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,清楚地顯示出經(jīng)CBD作用后,纖維素聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,為近年來(lái)關(guān)于纖維素在酶解過(guò)程中其超分子結(jié)構(gòu)應(yīng)發(fā)生變化的推測(cè),給予了試驗(yàn)證實(shí).2分子活性化合物遠(yuǎn)在半個(gè)世紀(jì)前,Reese等即提出應(yīng)存在破壞結(jié)晶纖維素的“氫鍵酶”,但遺憾的是至今未能在微生物中獲得證實(shí).1994年,McQueen-Mason,等在黃瓜胚軸中,分離出一種蛋白質(zhì)——“expansin”,具有使離體的植物細(xì)胞壁伸長(zhǎng)的作用,也可使濾紙強(qiáng)度減弱,但無(wú)還原糖的產(chǎn)生.他們推測(cè)這類(lèi)酶應(yīng)具有破壞氫鍵的作用.近來(lái)我們由T.pseudokoningii濾液中分離到一個(gè)分子量約為24×104的蛋白,pI為7.0.它可使棉纖維,幾丁質(zhì)等膨脹但無(wú)還原糖的產(chǎn)生.紅外光譜分析表明,它確可減弱棉纖維的氫鍵區(qū)的吸收強(qiáng)度(3600～3200cm-1羥基吸收區(qū))關(guān)于它的結(jié)構(gòu)與功能的研究正在進(jìn)行中.3轉(zhuǎn)換株的產(chǎn)生機(jī)理1996年以來(lái),先后從分屬于18屬的約50種(株)真菌中檢測(cè)到可氧化性降解纖維素的短肽類(lèi)化合物[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13].在擬康氏木霉中和密粘摺菌的培養(yǎng)濾液中分離到毛細(xì)管電泳純的短肽組分:“singlefibergenegationfactor,SFGF”和“Gloeophyllumtrabeum,Gt”,1),并用電子自旋共振法(ESR)檢測(cè)到Gt引發(fā)的羥基自由基HO.和超氧陰離子自由基的產(chǎn)生(圖5).結(jié)合由其導(dǎo)致的纖維素物理、化學(xué)性質(zhì)的變化,提出了這類(lèi)短肽化合物,絡(luò)合并還原鐵(Fe3+),活化分子氧,引發(fā)Fenton反應(yīng)和氧化纖維素羥基,促進(jìn)糖苷鏈斷裂,形成短纖維的作用機(jī)理,1).纖維素和木素主要存在于植物細(xì)胞次生壁的中層,大分子的酶無(wú)法直接進(jìn)入次生壁.但電鏡切片可觀察到,次生壁可首先發(fā)生降解.于是研究者們推測(cè),應(yīng)存在此類(lèi)可降解木素,纖維素的低分子類(lèi)化合物.但由于觀察到的現(xiàn)象都來(lái)自粗酶濾液的混合作用,難于確證.在1997年,才見(jiàn)有部分純化此類(lèi)物質(zhì)的報(bào)道.我們?cè)谧C實(shí)此類(lèi)物質(zhì)普遍存在的基礎(chǔ)上,基于對(duì)純組分(SFGF/GT)的系統(tǒng)研究提出了它們作用機(jī)理的模式圖.表明氧化性降解也是纖維素生物降解的一個(gè)組成部分(圖6,7),這在過(guò)去研究中是被忽略的.上述實(shí)驗(yàn)表明,Gt因子產(chǎn)生HO.依賴(lài)于Fe3+并需要O2,H2O2的參與.由此推斷,Gt因子可能通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH.,在圖5(b)中還出現(xiàn)了一個(gè)三重峰,表明體系中有的形成且推測(cè)是Gt因子的加入、Fe3+的還原驅(qū)動(dòng)了超氧陰離子自由基的形成,.我們由此可推測(cè)H2O2的形成途徑:眾所周知,H2O2的形成可通過(guò)O2接受兩個(gè)電子形成或接受一個(gè)電子產(chǎn)生這兩條中間途徑,由圖5(b)所知體系中產(chǎn)生了,因此可以斷定,H2O2是通過(guò)這一中間路徑產(chǎn)生.在生物系統(tǒng)中,極易通過(guò)歧化反應(yīng)形成H2O2,,或者通過(guò)接受兩個(gè)來(lái)自Fe2+的電子而形成H2O2,.雖然無(wú)法分辨H2O2由上述哪條途徑產(chǎn)生,但可以斷定Gt因子介導(dǎo)的H2O2的生成是通過(guò)超氧陰離子自由基——這一中間產(chǎn)物形成的,在這個(gè)過(guò)程中,Gt因子還原Fe3+是OH.生成的前提,Fe3+的還原驅(qū)動(dòng)了的產(chǎn)生,從而引發(fā)了H2O2的形成.4雜合酶的結(jié)構(gòu)與功能經(jīng)木瓜蛋白酶有限酶切和系列分離純化后,得到了擬康氏木霉內(nèi)切、外切纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域.測(cè)定了CBHⅠ,EGⅠ全酶分子及其2個(gè)結(jié)構(gòu)域在纖維材料上的吸附和脫吸附能力,以及它們酶解幾種纖維材料時(shí)的比活力.結(jié)果表明,雖然單一的CD或CBD仍然可表現(xiàn)出水解和吸附能力,但是任何單一的結(jié)構(gòu)域,或者兩個(gè)結(jié)構(gòu)域等物質(zhì)的量的混合液的水解或吸附能力,都遠(yuǎn)低于其相應(yīng)的全酶分子.例如,CBHⅠ的CBD及CD都可吸附于棉纖維上,但很易被洗脫.而CBHⅠ全酶分子吸附后,用1mol/LNaCl也洗脫不下來(lái).CBHⅠ和EGⅠ協(xié)同降解結(jié)晶纖維素的功能,也只能體現(xiàn)在這2個(gè)酶分子共同反應(yīng)條件下,用等物質(zhì)的量的4個(gè)結(jié)構(gòu)域的混合液作用時(shí),表現(xiàn)出的協(xié)同能力大為降低.進(jìn)而用來(lái)自不同纖維素酶分子的CBD和CD,用基因工程方法組建成雜合酶分子,深入探討了其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1).瑞氏木霉.EGⅢ的Km值比EGⅠ的低幾百倍,而其轉(zhuǎn)換數(shù)(Nt)則比EGⅠ的低50～200倍,結(jié)果,這兩種酶的催化效率(Nt/Km)處在同一數(shù)量級(jí)上.從理論上講,將底物親和力高的EGⅢ的CBD區(qū)與催化能力強(qiáng)的EGⅠ的CD區(qū)雜交組合起來(lái),有可能提高酶的催化效率.本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆到了EGⅢ基因.為了研究鏈接區(qū)的功能及CBD與CD區(qū)的相互作用,從瑞氏木霉cDNA文庫(kù)中克隆出EGⅠ基因,采用重組PCR技術(shù)將編碼EGⅢ信號(hào)肽、CBD和鏈接區(qū)(第1～90位氨基酸)的基因片段與編碼EGⅠ催化區(qū)(第1～371位氨基酸)的基因片段重組為雜合酶基因,轉(zhuǎn)入釀酒酵母中表達(dá).對(duì)EGⅠ,EGⅢ和雜合酶的最佳作用溫度及pH值的測(cè)定結(jié)果顯示,3種酶的最佳作用溫度均為60℃,和pH值為5.0.它們?cè)谧罴炎饔脳l件下酶的比活分別為:0.98,1.11,0.28IU/mg蛋白,與其雙親相比,雜合酶的蛋白分泌量沒(méi)有明顯變化,但比活力卻顯著降低.EGⅠ,EGⅢ和雜合酶對(duì)磷酸膨脹纖維素的吸附力分別為:66.5%,74.9%和37.7%.顯然,雜合酶對(duì)纖維素的吸附能力也明顯下降.雜合酶與其親本性質(zhì)的比較結(jié)果說(shuō)明,雜合酶EG的CD和CBD的重組并未能體現(xiàn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間簡(jiǎn)單的協(xié)同作用關(guān)系.造成重組酶活性改變可能有兩方面原因:(ⅰ)CBD和CD雖然可以彼此獨(dú)立,而保持各自的結(jié)構(gòu)和功能,但是,當(dāng)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)一段由34個(gè)氨基酸組成的鉸鏈區(qū)連接成一條肽鏈,折疊為具有三維空間結(jié)構(gòu)的酶分子時(shí),CD和CBD的肽鏈之間相互影響,相互作用,會(huì)改變它們的三維空間結(jié)構(gòu).如果同源的CD和CBD的連接,它們的拓?fù)淇臻g結(jié)構(gòu)適合于降解纖維素.反之,異源的CD和CBD的重組,可能會(huì)破壞它們的最適作用的空間結(jié)構(gòu),致使雜合酶對(duì)纖維素的吸附及降解能力都顯著降低.(ⅱ)盡管EGⅠ,EGⅢ如CBHⅠ,CBHα都有兩個(gè)結(jié)構(gòu)和功能的區(qū)域:一個(gè)CD連結(jié)一個(gè)CBD,而且,它們的CBD有70.5%的同源性,但是,EGⅠ和CBHⅠ的CBD位于酶分子的C-端,EGⅢ和CBHⅡ的CBD卻位于蛋白質(zhì)的N-端.CBD和CD之間的方向性可能與它們的三維結(jié)構(gòu)及其協(xié)同作用關(guān)系密切,從而對(duì)纖維酶分子的整體結(jié)構(gòu)影響很大.EGⅠ的CBD從酶分子C-端刪除,而在其N(xiāo)-端加上EGⅢ的CBD,這樣,重組酶分子上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置發(fā)生了改變,不利于它們之間的協(xié)同作用.因而,重組酶對(duì)纖維素的降解能力顯著下降.5棉纖維酶的功能纖維素酶在酶解過(guò)程中的失活和殘余纖維素結(jié)晶度的增加,曾被認(rèn)為是纖維素難被酶降解的主要原因.我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),多次使用新鮮纖維素酶液酶解殘存纖維時(shí),并未能提高其酶解效率.另外,當(dāng)無(wú)定型區(qū)被酶解后,結(jié)晶區(qū)在大幅度被酶降解過(guò)程中,其結(jié)晶度基本不變,但酶的吸附效率卻大幅度減低,而活化能卻大幅度增加.這都反映了上述認(rèn)識(shí)的局限性.CBD作用棉纖維后(圖2,3)導(dǎo)致微纖維鏈間氫鍵結(jié)合減弱,吸水力增加,纖維溶脹.但對(duì)長(zhǎng)期酶解過(guò)程中,棉纖維樣品的紅外光譜的比較還可看出,纖維素晶格發(fā)生了由Ⅰ型到Ⅱ型的轉(zhuǎn)變.纖維Ⅱ中氫鏈平均長(zhǎng)度較纖維素Ⅰ為短,堆砌數(shù)為緊密,所以它在熱力學(xué)上較穩(wěn)定.而發(fā)生這些復(fù)雜的超分子結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化,在過(guò)去酶解過(guò)程研究中被互略.由于一個(gè)纖維素酶分子如CBHⅠ(圖8)吸附纖維時(shí),其寬度要跨越2～4根微纖維,其排列間隙的加大和取向無(wú)序化,都會(huì)造成纖維素酶吸附的困難,而纖維素酶的吸附是其降解固體纖維素的必需階段,水解速率又正比于吸附量.我們認(rèn)為,上述超分子結(jié)構(gòu)的變化,應(yīng)是導(dǎo)致纖維素酶在殘存的纖維上吸附能力顯著下降,而水解活化能卻顯著增加的原因,因而難以被酶降解.6cdh促進(jìn)木素酶及木素降解作用CDH發(fā)現(xiàn)20余年來(lái),只明確它可氧化纖維二糖,但它在木素和纖維素降解中的作用卻不清楚.我們的研究表明,在23種(株)真菌中,9種可合成CDH的既能降解纖維素又能降解木素的菌株,表明它與木素的降解有關(guān).進(jìn)一步觀察到,裂菌褶的纖維二糖脫氫酶,可以氧化纖維二糖并還原多種物質(zhì),催化的是一雙底物雙產(chǎn)物反應(yīng),符合乒乓機(jī)制.在電子供體纖維二糖存在下,CDH可以還原由豆殼過(guò)氧化物酶(soybeanhulloeroxidase,SHP)氧化多種芳香化合物所生成的產(chǎn)物.SHP氧化1-羥基苯丙三唑(hydroxybenzotriazole,HBT)生成的產(chǎn)物對(duì)SHP有失活作用.而在纖維二糖存在下,CDH可以還原該氧化產(chǎn)物,從而阻止其對(duì)酶的失活作用.CDH還可以抑制SHP氧化聚合愈創(chuàng)木酚等酚型化合物的反應(yīng).從而證實(shí)CDH可以促進(jìn)木素酶對(duì)木素的降解.繼而發(fā)現(xiàn),在白腐菌的錳過(guò)氧化物酶(Mnp)酶解硫酸鹽漿酶分離木素(cellulaseenzymalysislignin,CEL)時(shí),加入CDH,能使木素降解溶出物質(zhì)明顯增加,表明CDH也能促進(jìn)Mnp的降解作用,使CEL中甲氧基、羥基、酚羥基和總羥基含量減少.1HNMR分析表明,錳氧化物酶處理時(shí),加入CDH還能使CEL中質(zhì)子數(shù)進(jìn)一步減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),CDH具有促進(jìn)Mnp對(duì)木素降解的作用,從而表明CDH不僅能促進(jìn)纖維素降解,而且也是木素生物降解體系中的重要組成部分之一.7ph誘導(dǎo)的結(jié)合在純化得到內(nèi)、外切纖維素酶的純組分并對(duì)酶的生物學(xué)、物理化學(xué)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了2類(lèi)酶的內(nèi)源熒光、圓二色譜、氨基酸殘基化學(xué)元素修飾及酶解過(guò)程中動(dòng)力學(xué)的比較研究.目的是探索色氨酸在內(nèi)、外切纖維素酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用.結(jié)果表明,它位于酶的活性位點(diǎn)附近,而且與底物結(jié)合有關(guān).熒光光譜測(cè)定指出,酶的熒光幾乎都來(lái)自色氨酸殘基.在酶分子中,色氨酸所處微環(huán)境對(duì)pH變化非常敏感,降低pH導(dǎo)致了酶分子構(gòu)象發(fā)生了較大變化.配基結(jié)合使酶分子色氨酸環(huán)境產(chǎn)生了改變,引發(fā)了與pH誘導(dǎo)不同的構(gòu)象變化.表明色氨酸很可能位于或接近酶的底物結(jié)合位點(diǎn).熒光激發(fā)和發(fā)射峰值測(cè)定結(jié)果表明:配基(纖維二糖)結(jié)合使色氨酸微環(huán)境發(fā)生了變化,很可能使色氨酸從羧基或咪唑基的附近離開(kāi)了,而導(dǎo)致熒光不再表現(xiàn)大的pH依賴(lài)性.pH誘導(dǎo)的結(jié)合是敏感的,降低pH可能導(dǎo)致了一些色氨酸更加暴露;配基結(jié)合改變了色氨酸的微環(huán)境,同時(shí)使酶分子構(gòu)象發(fā)生了變化,但酶的整體構(gòu)象不再隨pH變化.并由此證明,內(nèi)、外切纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別,是其底物專(zhuān)一性不同的原因.以低濃度的十二烷基磺酸鈉(SDS)為微擾劑處理外切酶CBHⅠ時(shí),可顯著增加CBHⅠ的內(nèi)切酶活力.熒光和圓二色譜測(cè)定表明,其內(nèi)切酶活力增加的原因可能為CBHⅠ活性部位附近色氨酸所處微環(huán)境變化所致.進(jìn)一步觀察N-溴代琥珀酸鈉修飾內(nèi)切酶EGⅠ時(shí),酶活力的完全喪失先于酶的熒光強(qiáng)度淬滅發(fā)生,增加纖維二糖濃度可增加對(duì)酶熒光淬滅發(fā)生的保護(hù),表明催化結(jié)構(gòu)域中的色氨酸位于底物結(jié)合位處.用熒光和圓二色譜研究了CBHⅠ和EGⅠ在不同pH和配基結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化,無(wú)配基時(shí),兩者構(gòu)象變化相似,加入配基時(shí)導(dǎo)致了不同的變化.在低pH區(qū),EGⅠ構(gòu)象變化的pH依賴(lài)性較CBHⅠ大,EGⅠ較CBHⅠ更易受外源干擾.這都表明,EGⅠ活性部位的“結(jié)合色氨酸”較CBHⅠ的“結(jié)合色氨酸“更加暴露于溶劑中.根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,我們提出了一個(gè)解釋內(nèi)、外切纖維素酶與表纖維作用時(shí),底物專(zhuān)一性不同的運(yùn)動(dòng)模式:CBHⅠ活性部位呈桶狀,只能允許單根纖維分子鏈進(jìn)入.EGⅠ活性部位為一開(kāi)放的裂隙,可使酶分子“騎”在纖維表面上,進(jìn)行隨機(jī)性內(nèi)切,水解出纖維寡糖(圖9).8糖基化是纖維素酶水解纖維素活力的手段纖維素酶分子都是糖基化的糖蛋白,但對(duì)其糖基化的功能一直沒(méi)有確認(rèn).我們分析了纖維素酶被木瓜蛋白酶有限酶切的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)其酶切位點(diǎn)都位于“l(fā)inker”附近.而且是發(fā)生在一些由Gly,Ser和Thr組成的寡肽上.而這樣的肽已被證明是蛋白酶的酶切位點(diǎn):G-S-T,A-G/G-A,G-G-Y,這里的Y時(shí)常是疏水基團(tuán).我們和已報(bào)道的結(jié)果都表明:糖基化不是纖維素酶水解纖維素活力所必需.什么是糖基化的作用呢?仔細(xì)考察不難發(fā)現(xiàn):外切酶的linker是糖基化的,內(nèi)切酶的linker不是糖基化的,外切酶的linker中含有一些可能的蛋白酶切位點(diǎn),而內(nèi)切酶中卻幾乎沒(méi)用.所以,糖基化的作用應(yīng)該是防止蛋白酶切.這種作用對(duì)纖維素酶的功能可能是很重要的.但是這些基于序列分析的認(rèn)識(shí)還需進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí).我們進(jìn)一步利用體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(不含催化糖基化的酶類(lèi)),研究了微紫青霉CBHⅠ的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制.分別以pGEM-3ZcDNA和擴(kuò)增的DNACBHⅠ為轉(zhuǎn)錄-翻譯模板,在體外兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中成功表達(dá)了不含糖基化的CBHⅠ,表達(dá)量達(dá)21.7μg/mL.以二糖苷(pNPC)為底物,表現(xiàn)為有正?；盍Φ拿傅鞍?CBHⅠ在體外兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中,得到正確轉(zhuǎn)錄和翻譯成非糖基化的CBHⅠ,和糖基化修飾并不影響纖維素酶比活力的結(jié)果,進(jìn)一步為糖基化的作用是防止蛋白酶水解的新觀點(diǎn)提供了試驗(yàn)證據(jù).9關(guān)于纖維素酶活性位點(diǎn)的研究在對(duì)纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上,為了對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)提供新的線索,我們對(duì)已知其三維結(jié)構(gòu)的23個(gè)酶(分屬于6大類(lèi)酶)的活性位點(diǎn)區(qū)域的氨基酸殘基出現(xiàn)規(guī)律做了統(tǒng)計(jì)分析.發(fā)現(xiàn)它們都是富含G(甘氨酸)-X-Y殘基的,而且一般以G-X-Y(或Y-X-G)寡肽出現(xiàn),與X,Y殘基的極性相反,它們的分子量和極性也較小,G-X-Y寡肽出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)較其他區(qū)域高.酶的其他區(qū)域則無(wú)此特征性寡肽,表明甘氨酸可為酶類(lèi)活性部位提供柔性,這是酶活性位點(diǎn)構(gòu)象變化所必需的.以纖維素酶和過(guò)氧化物酶為例,對(duì)此做了構(gòu)象分析.表明用G-X-Y寡肽來(lái)構(gòu)