利用酸性蛋白酶分離雞體內(nèi)的蛋雞花青素

利用酸性蛋白酶分離雞體內(nèi)的蛋雞花青素

烏骨雞是世界上罕見的珍稀鳥類。它集藥物、補(bǔ)充和營(yíng)養(yǎng)于一體。對(duì)人體具有特殊的營(yíng)養(yǎng)功能，可以調(diào)節(jié)身體的生理機(jī)能，提高身體的競(jìng)爭(zhēng)力。烏骨雞與普通雞最明顯的差異就是黑色素。研究表明烏骨雞中的黑色素具有保護(hù)功效,可以避免紫外線引起的急慢性改變,具有清除自由基抗氧化等功能,從而可以預(yù)防癌癥、抗衰老、提高肌體的免疫力。由于烏骨雞黑色素與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,對(duì)于烏骨雞黑色素的分離,目前主要采用鹽酸降解蛋白質(zhì)的方法分離提取,其它方法幾乎未見報(bào)道,但是該法可能造成黑色素形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的損傷。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用蛋白酶法分離黑色素,旨在找出酶法分離烏骨雞黑色素的最佳條件,為烏骨雞產(chǎn)品開發(fā)提供服務(wù)。1材料和方法1.1蛋白酶和果汁試劑供試材料。泰和烏骨雞,購(gòu)自江西省泰和縣生物谷食品科技工業(yè)園。酶制劑。537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP堿性蛋白酶(酶活力≥10萬(wàn)IU,上海酶制劑廠);木瓜蛋白酶(酶活力≥6000萬(wàn)IU,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。使用化學(xué)試劑均為分析純。1.2烏骨雞黑色素提取工藝烏骨雞→屠宰凈毛→清洗→剔骨取肉→絞碎→加酶、調(diào)pH、恒溫水解→酶水解液→離心→濾渣→清洗→黑色素。1.3確定最佳酶解工藝條件取全凈膛烏骨雞,剔骨取肉絞碎混勻,稱取一定量雞肉進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn),根據(jù)水解液中氨基態(tài)氮含量確定試驗(yàn)用酶種類。采用黃金分割法,依據(jù)水解液中氨基態(tài)氮含量確定最佳酶解工藝條件。酶解后將水解液離心(5000r/min,20min),沉淀物用醚、蒸餾水反復(fù)洗滌(至少4次),經(jīng)真空冷凍干燥得黑色素。1.4氨基氮的測(cè)定采用電位滴定法檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1激素的取得取一定量烏雞肉按固液比肉水比1∶2,加入蛋白酶,在其最適pH和溫度下水解烏雞肉,每隔2h取樣測(cè)定水解液中氨基態(tài)氮含量,并將水解液按黑色素分離方法取得黑色素。以氨基態(tài)氮含量為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的黑色素重量(g)為縱坐標(biāo),利用EXCELL軟件,進(jìn)行線性回歸分析,其回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為:Y=0.0381X+0.0084,R=0.9939從圖1中我們可以看出烏雞肉中黑色素重量與水解液中氨基態(tài)氮含量成高度線性相關(guān),其相關(guān)系數(shù)值達(dá)0.9939,因此,為了研究方便,我們采用水解液中氨基態(tài)氮含量來間接表示烏雞肉中的黑色素的含量。2.2烏雞肉水解蛋白質(zhì)的活性比較選用537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP堿蛋白酶、木瓜蛋白酶4種蛋白酶,按肉水比(烏雞肉∶水=1∶4,酶解時(shí)間4h,酶用量(相對(duì)烏雞肉重)2%,在各自的適宜反應(yīng)條件下,水解烏雞肉,測(cè)定水解液中氨基態(tài)氮含量,結(jié)果見表1。由表1可知,4種蛋白酶對(duì)烏雞蛋白質(zhì)的水解效果不同,537酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)烏雞肉有較強(qiáng)的水解能力,分別達(dá)到0.2644g/100ml、0.2403g/100ml;1398中性蛋白酶次之,為0.1272g/100ml;HAP堿性蛋白酶水解能力最差,只有0.0565g/100ml。由于酸性蛋白酶酶解條件溫和(30~50℃),便于水解操作,因而我們選擇537酸性蛋白酶作為水解烏雞肉蛋白質(zhì)用酶。2.3酶解條件的確定2.3.1加酶量的確定取pH3.0,溫度40℃,固液比1∶4,酶解時(shí)間4h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知,在固定底物下,氨基態(tài)氮含量隨加酶量的增加而增加,但加酶量增加到3.8%以后,氨基態(tài)氮含量不再增加,說明底物可能已被酶飽和,再增加酶量,也不會(huì)增加氨基態(tài)氮產(chǎn)量,相反,可能會(huì)導(dǎo)致酶分子之間的相互水解,因而加酶量可確定為3.8%。2.3.2不同黃金分割法酶解溫度的確定各種酶都有各自熱穩(wěn)定性和最適作用溫度,已知酸性蛋白酶作用范圍在30~50℃,在加酶量3.8%,pH2.0,固液比(肉∶水)1∶4,酶解時(shí)間4h下,根據(jù)黃金分割法在30~50℃的含優(yōu)區(qū)間內(nèi),找出最佳酶解溫度。各試驗(yàn)點(diǎn)溫度及水解結(jié)果見表3。從表3可知,溫度為34.8℃為最佳酶解溫度。2.3.3ph值的測(cè)定酸性蛋白酶在pH2.0~4.0時(shí)穩(wěn)定,超過此范圍,失活較嚴(yán)重,由黃金分割法,在pH2.0~4.0含優(yōu)區(qū)間內(nèi)找出最適pH,經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得最適pH=2.8(表4),另外,需注意的是,由于試驗(yàn)中隨著蛋白質(zhì)水解和氨基酸逐漸溶出,水解液中酸度會(huì)逐漸下降,因此需在酶水解過程中不斷補(bǔ)充酸液,以維持水解體系中pH值基本不變。2.3.4氨基態(tài)氮含量對(duì)水解能力的影響酸性蛋白酶水解烏雞肉,在相同條件下,底物濃度不同,其水解效果亦有差異。由表5結(jié)果可知,固液比為1∶2時(shí),氨基態(tài)氮含量最多,水解能力最強(qiáng),而超過這一值時(shí),水解能力均降低。當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃髸r(shí)黏度也增大,影響酶分子的擴(kuò)散和定向,不利于酶與底物充分接觸,因而酶水解能力降低;另一方面,底物濃度減小,則影響了酶與底物的接觸頻率。所以底物濃度過大過小都不利于酶水解。因此,固液比采用1∶2為宜。2.3.5不同濃度和添加5對(duì)烏雞肉的水解結(jié)果在相同酶用量下,進(jìn)行一次性加入,分兩次加入進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn),酶解條件為:pH2.8,溫度34.8℃,固液比(肉∶水)=1∶2,水解時(shí)間4h,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表6。從表6可以看出,在不增加酶用量的情況下,分兩次加入537酸性蛋白酶對(duì)烏雞肉進(jìn)行水解,效果比一次性投入更加理想;而采用混合酶制劑效果優(yōu)于單一酶制劑。分析認(rèn)為,當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí),加酶量過大,可能導(dǎo)致酶本身相互水解,使酶活力降低,分次加入酶可以增強(qiáng)酶的活性,故水解的效果較好。2.3.6不同時(shí)間時(shí)間對(duì)水解液氨基氮的影響取10g烏雞肉,加入0.38g537酸性蛋白酶和20g水。調(diào)節(jié)pH2.8置大燒杯中,放入34.8℃的恒溫鍋中進(jìn)行酶解,每隔2h測(cè)定其水解液中氨基氮含量,其結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出,在0~20h之間,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),水解液中氨基態(tài)氮呈上升趨勢(shì),當(dāng)達(dá)到20h時(shí),水解液中氨基態(tài)氮含量最高,達(dá)0.4736g/100ml,水解能力最強(qiáng),20h以后水解液中氨基態(tài)氮含量幾乎不再增加,這可能與酶的活性下降有關(guān)。因而,可選定酶解時(shí)間為20h。2.4不同鹽酸降解蛋白質(zhì)法提取從雞氧化酶按照上述酶解最佳工藝,提取出黑色素;同時(shí)我們也參照劉望夷的鹽酸降解蛋白質(zhì)法對(duì)泰和烏雞黑色素進(jìn)行提取,得到兩者的提取率分別為:0.36%,0.30%,鹽酸法分離出黑色素重量低于蛋白酶法,這可能與酶法提取黑色素?fù)p失小或未受損傷有關(guān)。3酸性蛋白酶