利用酸性蛋白酶分離雞體內的蛋雞花青素

利用酸性蛋白酶分離雞體內的蛋雞花青素

烏骨雞是世界上罕見的珍稀鳥類。它集藥物、補充和營養(yǎng)于一體。對人體具有特殊的營養(yǎng)功能，可以調節(jié)身體的生理機能，提高身體的競爭力。烏骨雞與普通雞最明顯的差異就是黑色素。研究表明烏骨雞中的黑色素具有保護功效,可以避免紫外線引起的急慢性改變,具有清除自由基抗氧化等功能,從而可以預防癌癥、抗衰老、提高肌體的免疫力。由于烏骨雞黑色素與蛋白質結合在一起,對于烏骨雞黑色素的分離,目前主要采用鹽酸降解蛋白質的方法分離提取,其它方法幾乎未見報道,但是該法可能造成黑色素形態(tài)和化學結構的損傷。因此,本實驗擬采用蛋白酶法分離黑色素,旨在找出酶法分離烏骨雞黑色素的最佳條件,為烏骨雞產品開發(fā)提供服務。1材料和方法1.1蛋白酶和果汁試劑供試材料。泰和烏骨雞,購自江西省泰和縣生物谷食品科技工業(yè)園。酶制劑。537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP堿性蛋白酶(酶活力≥10萬IU,上海酶制劑廠);木瓜蛋白酶(酶活力≥6000萬IU,國藥集團化學試劑有限公司)。使用化學試劑均為分析純。1.2烏骨雞黑色素提取工藝烏骨雞→屠宰凈毛→清洗→剔骨取肉→絞碎→加酶、調pH、恒溫水解→酶水解液→離心→濾渣→清洗→黑色素。1.3確定最佳酶解工藝條件取全凈膛烏骨雞,剔骨取肉絞碎混勻,稱取一定量雞肉進行酶解實驗,根據水解液中氨基態(tài)氮含量確定試驗用酶種類。采用黃金分割法,依據水解液中氨基態(tài)氮含量確定最佳酶解工藝條件。酶解后將水解液離心(5000r/min,20min),沉淀物用醚、蒸餾水反復洗滌(至少4次),經真空冷凍干燥得黑色素。1.4氨基氮的測定采用電位滴定法檢測。2結果與分析2.1激素的取得取一定量烏雞肉按固液比肉水比1∶2,加入蛋白酶,在其最適pH和溫度下水解烏雞肉,每隔2h取樣測定水解液中氨基態(tài)氮含量,并將水解液按黑色素分離方法取得黑色素。以氨基態(tài)氮含量為橫坐標,其對應的黑色素重量(g)為縱坐標,利用EXCELL軟件,進行線性回歸分析,其回歸方程和相關系數分別為:Y=0.0381X+0.0084,R=0.9939從圖1中我們可以看出烏雞肉中黑色素重量與水解液中氨基態(tài)氮含量成高度線性相關,其相關系數值達0.9939,因此,為了研究方便,我們采用水解液中氨基態(tài)氮含量來間接表示烏雞肉中的黑色素的含量。2.2烏雞肉水解蛋白質的活性比較選用537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP堿蛋白酶、木瓜蛋白酶4種蛋白酶,按肉水比(烏雞肉∶水=1∶4,酶解時間4h,酶用量(相對烏雞肉重)2%,在各自的適宜反應條件下,水解烏雞肉,測定水解液中氨基態(tài)氮含量,結果見表1。由表1可知,4種蛋白酶對烏雞蛋白質的水解效果不同,537酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶對烏雞肉有較強的水解能力,分別達到0.2644g/100ml、0.2403g/100ml;1398中性蛋白酶次之,為0.1272g/100ml;HAP堿性蛋白酶水解能力最差,只有0.0565g/100ml。由于酸性蛋白酶酶解條件溫和(30~50℃),便于水解操作,因而我們選擇537酸性蛋白酶作為水解烏雞肉蛋白質用酶。2.3酶解條件的確定2.3.1加酶量的確定取pH3.0,溫度40℃,固液比1∶4,酶解時間4h,實驗結果見表2。由表2可知,在固定底物下,氨基態(tài)氮含量隨加酶量的增加而增加,但加酶量增加到3.8%以后,氨基態(tài)氮含量不再增加,說明底物可能已被酶飽和,再增加酶量,也不會增加氨基態(tài)氮產量,相反,可能會導致酶分子之間的相互水解,因而加酶量可確定為3.8%。2.3.2不同黃金分割法酶解溫度的確定各種酶都有各自熱穩(wěn)定性和最適作用溫度,已知酸性蛋白酶作用范圍在30~50℃,在加酶量3.8%,pH2.0,固液比(肉∶水)1∶4,酶解時間4h下,根據黃金分割法在30~50℃的含優(yōu)區(qū)間內,找出最佳酶解溫度。各試驗點溫度及水解結果見表3。從表3可知,溫度為34.8℃為最佳酶解溫度。2.3.3ph值的測定酸性蛋白酶在pH2.0~4.0時穩(wěn)定,超過此范圍,失活較嚴重,由黃金分割法,在pH2.0~4.0含優(yōu)區(qū)間內找出最適pH,經實驗測得最適pH=2.8(表4),另外,需注意的是,由于試驗中隨著蛋白質水解和氨基酸逐漸溶出,水解液中酸度會逐漸下降,因此需在酶水解過程中不斷補充酸液,以維持水解體系中pH值基本不變。2.3.4氨基態(tài)氮含量對水解能力的影響酸性蛋白酶水解烏雞肉,在相同條件下,底物濃度不同,其水解效果亦有差異。由表5結果可知,固液比為1∶2時,氨基態(tài)氮含量最多,水解能力最強,而超過這一值時,水解能力均降低。當底物濃度增大時黏度也增大,影響酶分子的擴散和定向,不利于酶與底物充分接觸,因而酶水解能力降低;另一方面,底物濃度減小,則影響了酶與底物的接觸頻率。所以底物濃度過大過小都不利于酶水解。因此,固液比采用1∶2為宜。2.3.5不同濃度和添加5對烏雞肉的水解結果在相同酶用量下,進行一次性加入,分兩次加入進行酶解實驗,酶解條件為:pH2.8,溫度34.8℃,固液比(肉∶水)=1∶2,水解時間4h,其實驗結果詳見表6。從表6可以看出,在不增加酶用量的情況下,分兩次加入537酸性蛋白酶對烏雞肉進行水解,效果比一次性投入更加理想;而采用混合酶制劑效果優(yōu)于單一酶制劑。分析認為,當底物濃度一定時,加酶量過大,可能導致酶本身相互水解,使酶活力降低,分次加入酶可以增強酶的活性,故水解的效果較好。2.3.6不同時間時間對水解液氨基氮的影響取10g烏雞肉,加入0.38g537酸性蛋白酶和20g水。調節(jié)pH2.8置大燒杯中,放入34.8℃的恒溫鍋中進行酶解,每隔2h測定其水解液中氨基氮含量,其結果見圖2。從圖2中可以看出,在0~20h之間,隨著酶解時間的延長,水解液中氨基態(tài)氮呈上升趨勢,當達到20h時,水解液中氨基態(tài)氮含量最高,達0.4736g/100ml,水解能力最強,20h以后水解液中氨基態(tài)氮含量幾乎不再增加,這可能與酶的活性下降有關。因而,可選定酶解時間為20h。2.4不同鹽酸降解蛋白質法提取從雞氧化酶按照上述酶解最佳工藝,提取出黑色素;同時我們也參照劉望夷的鹽酸降解蛋白質法對泰和烏雞黑色素進行提取,得到兩者的提取率分別為:0.36%,0.30%,鹽酸法分離出黑色素重量低于蛋白酶法,這可能與酶法提取黑色素損失小或未受損傷有關。3酸性蛋白酶