利用雙水平法制備烏梅低聚肽的研究

利用雙水平法制備烏梅低聚肽的研究

genwall是中國的一種獨特雞，含有豐富的營養(yǎng)成分，是高質量蛋白質的來源。通過酶解制得烏雞低聚肽,能夠釋放出烏雞蛋白質中的活性肽段。低聚肽具有吸收快、耗能低、易于被人體消化和吸收等特點,對烏雞的開發(fā)利用具有重要的意義。但烏雞低聚肽作為食品原料,加工條件是否影響其穩(wěn)定性目前尚不明確。因此,本文以烏雞為原料制備烏雞低聚肽,在對其基礎理化成分進行分析的基礎上,以分子量分布為指標,研究溫度、pH值和蛋白酶消化對烏雞低聚肽穩(wěn)定性的影響,以期為其在食品工業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料和機器1.1.1白酶、鹽酸、堿烏雞:市售;堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶:諾維信生物技術有限公司;鹽酸、氫氧化鈉:北京化工廠,分析純;乙腈:美國Fisher公司,色譜純;三氟乙酸:英國AlfaAesar公司,分析純。1.1.2噴霧干燥機TJ12-H絞肉機:廣東恒聯(lián)食品機械有限公司;RJT03勻漿機:北京市和莫機電研究所;YG30噴霧干燥機:無錫市陽光干燥設備廠;FE20K型pH計:瑞士梅特勒-托利多公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:普瑞斯機械有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀、凝膠色譜柱(TSKgelG2000SWXL300mm×7.8mm):日本島津公司。1.2方法1.2.1果汁酶解果汁alcarlog的制備將烏雞除去內(nèi)臟后,用水洗凈,切塊后稱取2kg,用絞肉機絞碎,分多次加適量水用勻漿機勻漿。轉移到酶解罐中,用蒸餾水定容至6L。用NaOH溶液調節(jié)pH值為8.5,升溫恒定至60℃后,以每克蛋白質3000單位的酶量加入Alcalase2.4L,酶解2h。之后調節(jié)pH值為7.0,溫度為60℃,以每克蛋白質2500單位的酶量加入木瓜蛋白酶,酶解2h。酶解結束后,升溫至100℃,保持10min,滅酶。冷卻后6000r/min離心15min,取上清液。用截留分子量為2×106u的陶瓷膜過濾2～3h,以虹吸方法吸出中間清液,棄去上層油脂。然后用截留分子量為1000u的超濾膜超濾,得到分子量小于1000u的濾過液,將濾過液噴霧干燥,進口溫度220℃,出口溫度200℃,轉速40r/min,得到烏雞低聚肽干粉。1.2.2水分含量、灰分含量、脂肪含量測定蛋白質含量測定采用GB/T5009.5規(guī)定方法,水分含量測定采用GB/T5009.3規(guī)定的方法,灰分含量測定采用GB/T5009.4規(guī)定的方法,脂肪含量測定采用GB/T5009.6規(guī)定的方法。1.2.3檢測波長和流速將樣品經(jīng)孔徑0.2μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后,用高效液相色譜儀進行凝膠過濾。流動相:乙腈:水:三氟乙酸,45:55:0.1(v/v/v);檢測波長:220nm;進樣體積:10μL;流速:0.5mL/min;柱溫:30℃,利用紫外檢測器檢測,使用GPC軟件處理數(shù)據(jù)。5種肽標準品為乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、桿菌酶(分子量1450)、抑肽酶(分子量6500)、細胞色素C(分子量12500),配制成0.1%(m/v)溶液,過膜后進樣,用來制作相對分子量校正曲線。1.2.4水浴溫度和時間用蒸餾水溶解烏雞低聚肽干粉,配制成濃度為2mg/mL的溶液,分裝至5支50mL離心管,置于水浴鍋中,分別在20、40、60、80、100℃下水浴,2h后冷卻至室溫,分別檢測其分子量分布。1.2.5ph對離心系數(shù)的影響用蒸餾水溶解烏雞低聚肽干粉,配制成濃度為2mg/mL的溶液,分裝至5支50mL離心管中,分別用1mol/LHCl和1mol/LNaOH調節(jié)各管pH為2、4、6、8、10,在37℃的水浴鍋中放置2h,冷卻至室溫后分別檢測其分子量分布。1.2.6外部模擬對胃腸胃的消化實驗1.2.6.消化前對照處理用蒸餾水溶解烏雞低聚肽干粉,配制成濃度為2mg/mL的溶液,將40mL溶液置于50mL離心管中,用1mol/LHCl調節(jié)pH為2,在37℃的水浴鍋中預熱片刻,加入3%(E/S)胃蛋白酶,混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管,沸水中滅酶活10min,以此作為樣品消化前對照。取出后,將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h,沸水中滅酶活10min,冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品分子量分布。1.2.6.樣品的消化用蒸餾水溶解烏雞低聚肽干粉,配制成濃度為2mg/mL的溶液,將40mL溶液置于50mL離心管中,用1mol/LNaOH調節(jié)pH為6.8,在37℃的水浴鍋中預熱片刻,加入3%(E/S)胰蛋白酶,混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管,沸水中滅酶活10min,以此作為樣品消化前對照。取出后,將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h,沸水中滅酶活10min,冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品分子量分布。1.2.6.不同的胰蛋白酶樣品及消化前對照按照1.2.6.1的方法進行胃蛋白酶消化后,用1mol/LNaOH調節(jié)pH為6.8,在37℃的水浴鍋中預熱片刻,加入3%(E/S)胰蛋白酶,混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管,沸水中滅酶活10min,以此作為樣品消化前對照。取出后,將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h于沸水中滅酶活10min,冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布。2結果與討論2.1各項功能含量通過蛋白酶解制備的烏雞低聚肽中,總蛋白質含量很高,占82.26%,其余成分含量較少,其中水分含量為4.95%,灰分含量為7.59%,脂肪含量為0.73%?？梢姙蹼u低聚肽含有較高的蛋白質,是一種優(yōu)質的蛋白質物質。2.2分子量分布的變化熱處理是食品加工中常用的方式,本研究考察了不同熱處理溫度對烏雞低聚肽熱穩(wěn)定性的影響。烏雞低聚肽經(jīng)過不同的溫度處理后,其分子量分布凝膠色譜圖如圖1所示。烏雞低聚肽分別在20、40、60、80、100℃水浴2h之后,分子量分布凝膠色譜圖基本沒有變化。利用GPC軟件處理后,分子量分布數(shù)據(jù)如表1所示。各個分子量區(qū)間的比例變化不超過2%,分子量小于1000u的總含量均在90%。這表明在加工過程中,溫度的變化對烏雞低聚肽組分的影響很小,因此在加工中不必擔心產(chǎn)品外觀和性質的改變。陳亮等考察了玉米低聚肽在不同溫度條件下的熱穩(wěn)定性,與本研究結果一致,玉米低聚肽組分中分子量在1000u以下的總含量基本沒有變化,具有較好的熱穩(wěn)定性。2.3不同ph對雞低聚肽組分的影響酸堿處理是食品加工中常用的技術手段。烏雞低聚肽經(jīng)過不同的pH值處理后,其分子量分布凝膠色譜圖如圖2所示,烏雞低聚肽在pH值分別為2、4、6、8、10的條件下水浴2h之后,分子量分布凝膠色譜圖基本沒有變化。利用GPC軟件處理后,分子量分布數(shù)據(jù)如表2所示,各個分子量區(qū)間的比例變化不超過2%,分子量小于1000u的總含量均在90%。這表明烏雞低聚肽在廣泛的pH范圍內(nèi)有良好的穩(wěn)定性,因此在加工過程中,pH的變化對烏雞低聚肽組分的影響很小。王若敏等對大豆肽的酸堿穩(wěn)定性進行了研究,結果表明在不同pH值下,大豆肽的分子量分布沒有顯著性差異,與本文結果一致。2.4分子量分布情況本研究模擬人體的胃腸消化情況,對烏雞低聚肽進行了體外消化穩(wěn)定性實驗。烏雞低聚肽樣品分別經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后,其分子量分布凝膠色譜圖如圖3所示。從該圖3可以看出,經(jīng)過不同的消化模式,烏雞低聚肽分子量分布凝膠色譜圖基本上沒有變化。利用GPC軟件處理后,分子量分布數(shù)據(jù)如表3所示,烏雞低聚肽的組分中分子量小于1000u的總含量略有升高,但升高不到4%。體外消化實驗中,消化時間為3h,與人體胃腸消化的實際情況接近。這表明烏雞低聚肽能夠耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶作用。3雞低聚肽的穩(wěn)定性通過兩步酶解法制備出烏雞低聚肽,含有較高的蛋白質,是一種優(yōu)質的蛋白質物質。經(jīng)過不同的溫度、pH值和體外模擬胃腸道消化實驗,烏雞低聚肽中分子量小于1000u的總含量均在90%,各個分子量區(qū)間變化均不明顯,這表明烏雞低聚肽具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及消化穩(wěn)定性,在食品加工過程中,能夠保持較好的穩(wěn)定性,有利于保健食品的開發(fā)和利用,并且被人體攝入后,能夠耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用,可能在體內(nèi)發(fā)揮原有的生理活性。與未消化對照組相