植物揮發(fā)性次生物質(zhì)的提取方法

植物揮發(fā)性次生物質(zhì)的提取方法

明確昆蟲與植物的關(guān)系是找到和有效使用天然抗蟲藥物的先決條件。植物可以通過(guò)釋放次生蒸發(fā)來(lái)避免或減少昆蟲的損害。研究植物揮發(fā)性次生物質(zhì)與昆蟲的關(guān)系已有幾十年的歷史,近20年來(lái),隨著分析手段的提高,化學(xué)生態(tài)學(xué)得到了長(zhǎng)足發(fā)展,并利用生物技術(shù)手段,從根本意義上揭示植物—昆蟲關(guān)系的趨勢(shì)。研究與昆蟲有關(guān)的植物揮發(fā)性次生物質(zhì)的大致流程為:植物揮發(fā)物的樣品制備→生物測(cè)定→活性物質(zhì)的鑒定→進(jìn)一步的研究。本文從以上幾個(gè)方面就已被廣為采用及近年來(lái)提出的新方法加以綜述。1制備樣品前處理植物揮發(fā)物的提取技術(shù)很多借鑒于食品風(fēng)味化學(xué)的研究手段。傳統(tǒng)的方法有溶劑提取、水蒸汽蒸餾提取、吸附提取等。然后經(jīng)過(guò)濃縮富集,得到其濃度可以達(dá)到儀器檢測(cè)限的樣品。現(xiàn)代提取方法有固相萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取等,一般可以不經(jīng)過(guò)濃縮,直接進(jìn)樣分析。1.1熱脫—傳統(tǒng)提取技術(shù)使用溶劑提取的關(guān)鍵在于溶劑的選擇,可以根據(jù)相似相溶的原則選擇相應(yīng)極性的溶劑,也可以使用不同的溶劑逐步萃取。索氏抽提(Soxhletextraction)是較為常用的提取方法,所得的粗提物可以通過(guò)短程蒸餾、精制、提純得樣品。溶劑提取的優(yōu)點(diǎn)在于其裝置簡(jiǎn)單,但難以得到特異性強(qiáng)的樣品,并對(duì)環(huán)境有不同程度的污染。水蒸汽蒸餾提取利用蒸汽形成的負(fù)壓將樣品的揮發(fā)性物質(zhì)帶出,比較常用的是水蒸汽蒸餾—同步萃取(simultaneousdistillation-extraction,SDE),揮發(fā)性物質(zhì)在被水蒸汽帶出的同時(shí),與另一臂汽化的有機(jī)萃取溶劑(一般是乙醚)先進(jìn)行氣相萃取,在冷凝的過(guò)程中再液相萃取,然后通過(guò)不同的支壁回流到各自容器中,反復(fù)地汽化—萃取—回流。用這種方法使用的溶劑量較少,能在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)提取大量的揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)。SDE最早由Linkens和Nickerson設(shè)計(jì),現(xiàn)在有多種改進(jìn)裝置,已有商品SDE。氣相回流提取與此類似。用這些方法提取,一般需氮?dú)獗Ｗo(hù)。分子蒸餾需要至少0.133322Pa(10-3mmHg)真空度及低溫環(huán)境,縮短揮發(fā)性組分從蒸發(fā)面到冷凝的“平均自由路程”。利用分子蒸餾可以減少產(chǎn)生雜質(zhì)的機(jī)會(huì)。熱脫—吸附提取法利用熱源破碎植物體內(nèi)的細(xì)胞,把植物體內(nèi)、體外的揮發(fā)物趕出,然后以惰性氣體或氮?dú)獯党?由低溫冷阱中的溶劑吸附。Birkett等提取黑葡萄抗蟲揮發(fā)物利用的微波爐輔助法亦屬于此類。機(jī)械損傷及溫度的變化會(huì)使植物揮發(fā)物的釋放發(fā)生變化,而上面幾種方法需要系統(tǒng)溫度發(fā)生劇烈的變化,且樣品需要粉碎或剪碎,這可能會(huì)破壞常溫下植物揮發(fā)物的組成,并且前兩種在不損失樣品質(zhì)量的前提下難以提純。用以上方法也很難得到植物在被植食昆蟲危害時(shí)釋放的揮發(fā)物。吸附法從某種意義上解決了上述問(wèn)題。此法不需要任何熱源,完全在常溫下進(jìn)行,也是現(xiàn)在最常用的方法。吸附法利用特異性吸附劑將揮發(fā)性成分吸附,然后再用少量的溶劑洗脫?；钚蕴际鞘褂幂^早的吸附劑,它對(duì)非極性分子有很強(qiáng)的吸附作用,但不易洗脫?，F(xiàn)在用得最多的是網(wǎng)絡(luò)多孔高分子吸附劑,如PorapakQ(乙基乙烯基苯/二乙烯基苯共聚物),SuperQ,Tenax(2,6-二苯基對(duì)氧化次苯醚,有3種,分別為TenaxGC,TenaxTA,TenaxGR),XAD(二乙烯基苯/苯乙烯共聚物,常用的有-4,-7,-9)等,現(xiàn)在已有商品吸附柱。但這些吸附劑在某些溶劑中是可溶的,所以應(yīng)根據(jù)吸附劑選擇不同的洗脫溶劑,常用的洗脫溶劑有正己烷、乙醚、二氯甲烷等。使用動(dòng)態(tài)吸附的氣流應(yīng)為潔凈的穩(wěn)定氣體,最好是惰性氣體,以防止某些組分被氧化,如果使用空氣,需先經(jīng)過(guò)活性碳等凈化后(有的還需調(diào)節(jié)濕度),再進(jìn)入放置樣品的缸體。利用吸附法可以提取植物活體狀態(tài)下的揮發(fā)物,但不排除非目標(biāo)揮發(fā)物也被吸附劑吸附的可能,這些揮發(fā)物可能來(lái)自空氣、土壤或培養(yǎng)液。Turlings等提取玉米揮發(fā)物時(shí),采取控流措施,使缸體進(jìn)氣流量大于吸附管出氣流量,多出的一部分氣流把可能從缸體底座反吸的氣流推出缸體,以保證吸附劑吸附的氣體來(lái)自植株本身。吸附法可以用于研究植物在某一時(shí)間序列內(nèi)揮發(fā)物釋放的變化及誘導(dǎo)性揮發(fā)物的形成。植物揮發(fā)性物質(zhì)是微量的混合物質(zhì),溶劑背景是影響鑒定的重要因素。所以提取過(guò)程中所用的溶劑需要重蒸精制。如果不需要對(duì)提取揮發(fā)物進(jìn)行全化學(xué)指紋定量(即不能用歸一化法定量時(shí)),則應(yīng)在溶劑中加入內(nèi)標(biāo)。提取過(guò)程中所用的容器為玻璃介質(zhì),連接管最好使用Teflon管(可用聚四氟乙烯代替),或硅膠管。1.2催化蒸濃縮法法如果提取使用的溶劑量較大,所得的樣品則需要濃縮,至少去掉大部分的溶劑,以達(dá)到儀器可檢測(cè)的濃度范圍。濃縮之前需除去樣品內(nèi)的水,通常的方法是在樣品中加入脫水劑,如無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂等,并置于低溫環(huán)境過(guò)夜。減壓濃縮可以降低溶劑的蒸餾溫度,加快濃縮速度,它的缺點(diǎn)是容易喪失與溶劑沸點(diǎn)相近的植物揮發(fā)性組分。常用的減壓濃縮裝置有K-D瓶(即三球濃縮儀)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。濃縮過(guò)程中可以通氮?dú)獗Ｗo(hù)?？梢岳梦絼饪s。當(dāng)粗提物經(jīng)過(guò)吸附劑時(shí),微量揮發(fā)性物質(zhì)被吸附,溶劑及某些雜質(zhì)流走,然后用少量溶劑將揮發(fā)性物質(zhì)洗出。這種吸附濃縮以及上述的吸附法收集都屬于固相萃取(solidphaseextraction)的范疇。也可以用氮?dú)?也有用空氣)快速吹走樣品內(nèi)的溶劑,或在頂空吹氮保護(hù)的條件下自然濃縮。1.3固相微萃取法俞惟樂(lè)等在《毛細(xì)管氣相色譜和分離分析新技術(shù)》一書中對(duì)現(xiàn)代提取技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。用于植物揮發(fā)物提取的新技術(shù)有固相萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取等。固相微萃取(solidphasemicro-extraction,SPME)是用一根熔融的石英纖維,它的表層涂有特異性涂層,如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane),在提取過(guò)程中,它被手柄推出保護(hù)針,植物揮發(fā)物在植物表面、頂空(headspace)以及纖維涂層達(dá)到平衡,然后將石英纖維直接注入氣相色譜的進(jìn)樣口,吸附在其表層的揮發(fā)物在瞬時(shí)高溫條件下快速解吸附,進(jìn)入色譜柱分離。用固相微萃取提取揮發(fā)物耗時(shí)短,且吸附量的檢測(cè)極限可低達(dá)10-12,并且可以得到線性較好的結(jié)果。由于無(wú)需溶劑,鑒定時(shí)沒有溶劑的影響,而且提取成本相對(duì)較低,利于快速取樣分析。Supelco公司已將SPME商品化,并得到廣泛使用。Core等利用超臨界流體萃取提取了Medicago7個(gè)亞種的揮發(fā)性物質(zhì)。超臨界流體萃取(supercriticalfluidextraction,SFE)一般采用CO2作為提取溶劑,當(dāng)處于臨界溫度、臨界壓力以上時(shí),它不會(huì)液化,但也非氣態(tài),而是以一種高擴(kuò)散度、低粘度的超臨界流體狀態(tài)存在。超臨界流體能以高蒸汽壓將揮發(fā)物快速地從樣品中蒸發(fā)分離,超臨界流體的密度大于正常氣體,可以溶解揮發(fā)性物質(zhì)。這種方法有提取快、不破壞揮發(fā)性成分、得率高、少污染、后處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),但對(duì)設(shè)備要求較高,它主要運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前已經(jīng)有了試驗(yàn)室用的SFE。2生物測(cè)定方法2.1多通管昆蟲工具利用“通管”嗅覺儀,可以測(cè)定昆蟲對(duì)揮發(fā)物的趨性行為,包括昆蟲的取向選擇以及其對(duì)某種揮發(fā)物質(zhì)的響應(yīng)時(shí)間。有關(guān)“通管”的類型、樣圖在杜家緯著《昆蟲信息素及其應(yīng)用》一書中有詳細(xì)的介紹。這類嗅覺儀大至分為“I”型兩通管(單刺激源)、“Y”型三通管(雙刺激源)以及多通管(多刺激源)。這幾種嗅覺儀有一臂接蟲籠,另幾臂接揮發(fā)性物質(zhì)刺激源。測(cè)定時(shí),氣流由刺激源臂流向蟲籠臂。昆蟲接受刺激逆風(fēng)爬行或不響應(yīng)。使用的氣流亦需先經(jīng)過(guò)凈化。刺激源可以是活體植物、揮發(fā)性粗提物、揮發(fā)物單體、植物—植食昆蟲復(fù)合體等,根據(jù)需要選擇。提取物或揮發(fā)物單體的載體一般為濾紙,為保證它們能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地?fù)]發(fā),可以用醫(yī)用毛細(xì)管作為載體。容易出現(xiàn)的問(wèn)題是響應(yīng)時(shí)間難以估計(jì),對(duì)于較大的昆蟲還可能會(huì)有空間的限制,可以采用較大的玻璃缸體代替蟲籠臂,缸體四周有對(duì)稱的開口與刺激源臂相通,缸體中心有開口以供抽氣,將各刺激源臂中的揮發(fā)物吸入缸體。丁紅建等設(shè)計(jì)的四臂嗅覺儀使用了紅外錄像設(shè)備,可以標(biāo)定包括夜出性昆蟲在內(nèi)的活動(dòng)節(jié)率。風(fēng)洞是研究昆蟲性信息素的常用手段,近年來(lái)在植物—昆蟲關(guān)系的研究中也有應(yīng)用,它可較大程度地模擬室外真實(shí)環(huán)境,能系統(tǒng)地研究昆蟲對(duì)植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)。2.2感覺系統(tǒng)elica觸角的嗅覺感受細(xì)胞在接受有效刺激后,細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化,因而導(dǎo)致膜內(nèi)外電勢(shì)差的變化。利用電生理記錄儀將電勢(shì)差變化記錄、放大并加以比較,可以確認(rèn)揮發(fā)物對(duì)昆蟲嗅覺的刺激是否有效,進(jìn)而尋找有電生理活性的揮發(fā)性組分。有關(guān)電生理在昆蟲嗅覺反應(yīng)研究的歷史及發(fā)展參見文獻(xiàn)。測(cè)定時(shí),參考電極插入(觸角)嗅覺感器,記錄電極套在嗅覺感器的頂端。電極由玻璃拉制而成,內(nèi)部充滿相應(yīng)的電生理緩沖液,并通有更細(xì)的金屬電極(如銀—氯化銀)。EAG(electroantennography)記錄的是觸角某一(幾)類嗅覺感器全細(xì)胞或全觸角電位的變化,采用的電極一般為毛細(xì)管玻璃電極。SCR(singlecellrecording)可以記錄感受細(xì)胞單細(xì)胞電位的變化,使用的電極是更細(xì)的玻璃微電極。用于EAG測(cè)定的昆蟲大多為鱗翅目等觸角較大的昆蟲。SCR從原理上可以突破昆蟲大小的限制,同時(shí)也能在EAG研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示昆蟲嗅覺反應(yīng)的本質(zhì)。與普通嗅覺儀相比,通過(guò)測(cè)定嗅覺感受細(xì)胞電位來(lái)尋找活性成分的效率要高,并且花費(fèi)相對(duì)較低,但它并不是尋找活性成分的終極手段。昆蟲對(duì)揮發(fā)物質(zhì)的響應(yīng)是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程,EAG反應(yīng)與普通取向選擇反應(yīng)相矛盾的現(xiàn)象也有報(bào)道,結(jié)合宏觀和微觀生物測(cè)定才能更有效地解釋昆蟲對(duì)揮發(fā)物的反應(yīng)行為。3gc-ms-ir通常用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)來(lái)鑒定植物揮發(fā)物。利用事先在毛細(xì)管氣相色譜上摸索的色譜條件,先由GC將揮發(fā)物餾分分開,流出色譜柱后進(jìn)入質(zhì)譜,質(zhì)譜的離子碎片信號(hào)由計(jì)算機(jī)采集,掃描可檢測(cè)的有效峰,通過(guò)自帶的譜庫(kù),得出可能的鑒定結(jié)果。GC-MS使用的色譜柱最好與探索色譜條件的色譜柱一致,用于同類研究的色譜柱基本都是毛細(xì)管柱。利用GC-MS鑒定植物揮發(fā)物化學(xué)指紋的有效性與質(zhì)譜的精度及其所帶的譜庫(kù)的大小有很大關(guān)系,所以MS并不能直接鑒定所有物質(zhì)精確的空間結(jié)構(gòu),而且有研究表明昆蟲對(duì)不同構(gòu)型的同類揮發(fā)性組分有不同響應(yīng),所以GC-MS得出的揮發(fā)物全化學(xué)指紋并沒有完全顯示揮發(fā)物的全貌。作為GC-MS的延伸,氣—質(zhì)—紅外三聯(lián)(GC-MS-IR)可以將MS流出的組分做進(jìn)一步分析。如果有必要得到更完善的結(jié)果或需要進(jìn)一步研究,還可以利用其它輔助手段。一方面,可以使用制備用氣相色譜或柱層析將粗提物分開為多段的“粗餾分”(前者需要超低溫冷阱)。由于每個(gè)“粗餾分”的組成比全粗提物簡(jiǎn)單且相互不同,從而易于選擇不同極性的、不同手性的色譜柱進(jìn)行分析,以在GC上更好地分離。另一方面,如果可以分離到單一的有意義的特異組分,可以進(jìn)一步利用核磁共振(NMR)、紅外吸收、紫外(UV)等波譜分析手段定性。如果只檢測(cè)某種(些)特異組分的含量或有使用相同條件所得到的參考色譜峰,(可以以高效為前提)利用GC積分儀或工作站標(biāo)定這些峰的保留時(shí)間來(lái)定性,或者直接采取外標(biāo)法定性。用于揮發(fā)物研究的GC檢測(cè)器多為氫火焰離子檢測(cè)器(FID)。在線分析(online-analysis)是將自動(dòng)取樣和鑒定融為一體的檢測(cè)手段。由于取樣時(shí)間短,自動(dòng)化程度高,減少了其它方法中人為因素造成的影響,易于分析活體植物揮發(fā)性氣味及揮發(fā)性成分在時(shí)間上的動(dòng)態(tài)變化,得到的結(jié)果與實(shí)際情況更相符合。這種方法的關(guān)鍵在于取樣和進(jìn)樣,Ruther等設(shè)計(jì)的一種在線分析方法使用的是頂空取樣,以六通閥控制取樣系統(tǒng)和進(jìn)樣系統(tǒng)。取樣時(shí),冷阱與樣品室相通,獲得流自樣品室的氣體;進(jìn)樣時(shí),六通閥將冷阱與GC進(jìn)樣口相通,把冷阱內(nèi)的樣品送入GC-MS分析。4gc-eag-scr法衡量活性的標(biāo)準(zhǔn)由生物活性測(cè)定而定。如果在鑒定后逐一篩選標(biāo)樣,不僅工作量大,而且花費(fèi)也較大。可以先制備上述“粗餾分”,然后將各餾分進(jìn)行生物測(cè)定,鑒定有活性的餾分,再做進(jìn)一步的生物測(cè)定。如果“粗餾分”制備有效,可以節(jié)省人力、財(cái)力。通過(guò)氣相色譜分離,利用電生理儀測(cè)定可以進(jìn)一步提高工作效率,組分從GC毛細(xì)管柱流出后分流,一部分進(jìn)入FID,記錄下色譜信號(hào),另一部分進(jìn)入EAG或SCR,信號(hào)與色譜信號(hào)同步記錄到色譜及電生理記錄儀上。同時(shí)用冷阱逐一收集有電生理活性的餾分,即待檢的活性組分。也可采用在線的GC-EAG分析尋找有EAG活性的組分,如SPME-GC-EAG。揮發(fā)物是微量的復(fù)雜混合物質(zhì),越來(lái)越多的研究表明,昆蟲有趨性反應(yīng)或者有電生理活性的組分不止一種,作物品種的揮發(fā)物在成分和濃度上的差異就會(huì)導(dǎo)致品種表現(xiàn)是抗蟲還是感蟲。所以確定揮發(fā)物的有效成分需要做大量的工作。5揮發(fā)油的誘導(dǎo)植食昆蟲誘導(dǎo)的揮發(fā)物(herbivore-inducedvola