馬鈴薯甲醇對植物揮發(fā)物的田間誘集試驗

馬鈴薯甲醇對植物揮發(fā)物的田間誘集試驗

馬蹄甲蟲（其他人）屬于鞘臂科，也被稱為馬蹄葉甲蟲。它是世界著名的毀滅性檢疫害蟲。馬鈴薯甲蟲自20世紀(jì)90年代從哈薩克斯坦口岸傳入我國新疆塔城、伊犁等地,現(xiàn)已擴(kuò)展到新疆伊犁、塔城、阿勒泰、博樂、奎屯、石河子、昌吉、巴音郭楞和烏魯木齊市11個地(州)、師的35個縣(市)、258個鄉(xiāng)(鎮(zhèn)、團(tuán)場),發(fā)生行政轄區(qū)總面積29.72萬km2,耕地面積發(fā)生范圍2073.4萬畝(王俊等,2008)。據(jù)報道,該蟲僅在伊犁河谷每年發(fā)生面積約0.7萬km2,造成直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1000多萬元,嚴(yán)重發(fā)生田塊產(chǎn)量損失達(dá)50%以上(何海明,2005)。目前對于馬鈴薯甲蟲的防治仍以化學(xué)防治為主,而在美國馬鈴薯甲蟲已對25種以上殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性(Roushetal.,1990;Grafius,1997),所以尋找一種能夠替代殺蟲劑或配合殺蟲劑防治的方法勢在必行。引誘劑作為一種替代化學(xué)農(nóng)藥或增強(qiáng)化學(xué)農(nóng)藥防治效果的防治藥劑,被用于影響害蟲交配、寄主選擇以及初期害蟲種群數(shù)量的控制和監(jiān)測上。Martel等(2007)研究發(fā)現(xiàn)在擬除蟲菊酯中加入一種由3種植物揮發(fā)物所構(gòu)成的引誘劑可以作為一種誘殺劑對馬鈴薯甲蟲起到很好的防治作用。引誘劑的主要化學(xué)成分為影響昆蟲行為的化學(xué)信號物質(zhì),包括植物揮發(fā)物和昆蟲產(chǎn)生的信息素(HartliebandAnderson,1999),其中對昆蟲具有引誘作用的植物揮發(fā)物主要為寄主植物所揮發(fā)的物質(zhì);具有引誘作用的信息素主要包括性信息素和聚集素。而聚集素的引誘作用可以被寄主植物揮發(fā)物所增強(qiáng)(Dickens,1989;Dickensetal.,1990)或者被非寄主植物揮發(fā)物所打斷(Dickensetal.,1992)。目前研究表明對馬鈴薯甲蟲具有觸角電位反應(yīng)的寄主植物揮發(fā)物包括:芳樟醇、水楊酸甲酯、順乙酸-3-己烯酯、(Z)-3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯-1-醇、壬醛和2-苯乙醇(Dickens,1999,2002)。Dickens等(2002)發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯甲蟲聚集素,其結(jié)構(gòu)為一種單一對映體(S)-3,7-dimethyl-2-oxo-6-octene-1,3-dio[(S)-CPB-1](Oliveretal.,2002)。(S)-CPB-1的商業(yè)化合成路線的發(fā)現(xiàn)(MoriandTashiro,2004;Bathini,2009),使得進(jìn)一步開發(fā)一種含有植物揮發(fā)物和馬鈴薯甲蟲聚集素的馬鈴薯甲蟲引誘劑成為可能。本實驗的目的在于通過室內(nèi)行為選擇試驗,篩選對馬鈴薯甲蟲具有強(qiáng)引誘作用的植物揮發(fā)物或其混合物,將篩選出的植物揮發(fā)物和馬鈴薯甲蟲聚集素進(jìn)行田間誘集試驗,以確定其田間引誘作用,為開發(fā)馬鈴薯甲蟲引誘劑提供研究基礎(chǔ)。1材料和方法1.1馬鈴薯葉片的飼養(yǎng)于新疆昌吉市馬鈴薯大田中采集4齡馬鈴薯甲蟲幼蟲,然后在實驗室用紫花白馬鈴薯葉片飼養(yǎng)。并使其在栽有馬鈴薯的花盆中入土化蛹。對剛羽化出土的成蟲分雌雄于不同的塑料盒內(nèi),用新鮮的馬鈴薯葉片飼養(yǎng),每天更換葉片一次并清洗干凈塑料盒。實驗采用羽化后6-15d的成蟲。實驗前對供試?yán)ハx饑餓處理2～3h,然后黑暗處理1～2h。1.2馬鈴薯甲烷的合成本試驗以Visser(1979)和Dickens(1999,2002)所做的馬鈴薯甲蟲對寄主植物揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)為基礎(chǔ),選擇了以下有較高生物活性的植物揮發(fā)物(表1)。馬鈴薯甲蟲聚集素由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院農(nóng)藥合成實驗室協(xié)助合成。這些用于室內(nèi)行為測定試驗的化合物的名稱、純度及來源如表1所示。1.3內(nèi)部行為測試1.3.1馬鈴薯甲烷聚集素的測定方法采用“Y”型嗅覺儀,參照李繼泉等(2003)以及嚴(yán)善春等(2006)改進(jìn)而成。依次由QC-1(B)型大氣采樣儀、活性炭過濾裝置、GDX-101過濾裝置、空氣加濕器、250mL三角瓶陷阱和“Y”形管組成,各部件之間用硅膠管連接,“Y”形管的適應(yīng)臂長20cm、直徑4cm,測試臂長20cm、直徑3cm,兩臂之間的夾角為80°(圖1)。植物揮發(fā)物的標(biāo)樣分別用石蠟油稀釋至2.5μg/μL,馬鈴薯甲蟲聚集素用正己烷稀釋至1μg/μL。測定每種物質(zhì)時,吸取25μL的溶液滴在2cm2的定性濾紙上,放入一側(cè)的三角瓶陷阱內(nèi),另一側(cè)的三角瓶陷阱內(nèi)放滴有25μL相應(yīng)溶劑的定性濾紙作為對照。如果測定的物質(zhì)為混合物,則按照相同的比率加入各種物質(zhì),并使其總量為25μL,例如:芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯的3種物質(zhì)的混合物,則各加入8.3μL。如果測定的物質(zhì)是單純的植物揮發(fā)物或者馬鈴薯甲蟲聚集素,則將溶液滴在濾紙的中間。如果測定的物質(zhì)是植物揮發(fā)物和聚集素的混合物,則將植物揮發(fā)物溶液滴在濾紙的中心,而將聚集素溶液滴在濾紙的邊緣。每完成一次測試,將樣品與對照的位置互換,并更換一次濾紙,以消除方位和濃度降低所產(chǎn)生的影響。測定的空氣流量為1L/min。整個實驗在溫度為25℃左右避光的實驗室內(nèi)進(jìn)行。唯一的光源為2盞置于“Y”型嗅覺儀上方且與“Y”形管支臂平行的40W日光燈。如果馬鈴薯甲蟲在10min內(nèi)進(jìn)入測試臂5cm以內(nèi)記為一次有效測定,否則記為無反應(yīng)。每次測定投放1頭試蟲,每種物質(zhì)有效測定雌雄成蟲各20頭。1.3.2數(shù)據(jù)分析軟件室內(nèi)行為測定的試驗數(shù)據(jù)采用χ2檢驗比較差異顯著性。數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS13.0。引誘率的計算方法為:引誘率=(有效測定的總蟲數(shù)-對照臂的蟲數(shù))/有效測定的總蟲數(shù)×100%1.4農(nóng)田收集試驗1.4.1添加馬鈴薯甲烷馬鈴薯甲蟲聚集素被溶解在含有20%聚乙二醇、42%甲醇、25%甘油和13%的蒸餾水的混合溶液中,稀釋至1μg/μL。芳樟醇、水楊酸甲酯和順乙酸-3-己烯酯3種物質(zhì)的混合物以1∶1∶1的比例稀釋在以上混合溶劑中,使混合物濃度為1%(V/V)。2-苯乙醇也用相同的混合溶劑稀釋至1%(V/V)。對于馬鈴薯甲蟲聚集素+(芳樟醇+水楊酸甲酯+順乙酸-3-己烯酯)的處理,則在混合好的1%的芳樟醇+水楊酸甲酯+順乙酸-3-己烯酯混合藥劑中加入馬鈴薯甲蟲聚集素,使聚集素的濃度為1μg/μL。所有試劑均在田間試驗前的1～2h內(nèi)配好。實驗前將配好的試劑吸取1mL裝在2mL的離心管中,離心管的側(cè)邊鉆4個直徑約1.5mm的小孔使里面的揮發(fā)物質(zhì)得以緩慢釋放。在馬鈴薯大田中選取直徑為6m的一片馬鈴薯地塊,試驗前清除這片地塊上及地塊周圍的馬鈴薯甲蟲。并將此地塊劃分為一個正六邊形,在六個角上埋入直徑為30cm的裝滿水的塑料盆,在水中放入少量洗衣粉并使盆沿與周圍地面平行。試驗時,用鐵絲將裝好引誘劑的離心管懸掛在離塑料盆約40cm的正上方。六個角上依次放上兩種含有誘劑的離心管和對照用的只含有混合溶劑的離心管。使每兩個含有相同試劑的離心管處在對角線位置。重復(fù)試驗時,變更誘劑的方位,通過3次方位變更,剛好可以消除方位因素帶來的影響。掛好誘劑后將處理好的200頭雌蟲或雄蟲釋放于六邊形地塊的中心位置。釋放試蟲后開始計時,每6h收集一次掉入陷阱(水盆)的試蟲,連續(xù)收集24h。田間試驗的設(shè)計簡圖如圖2。1.4.2現(xiàn)場檢測試驗處理田間誘集數(shù)據(jù)采用t檢驗檢測差異顯著性,數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS13.0。2結(jié)果與分析2.1馬鈴薯甲烷及其衍生物的誘發(fā)作用馬鈴薯甲蟲對所測試的7種植物揮發(fā)物單體、8種揮發(fā)物混合物、馬鈴薯甲蟲聚集素以及芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯+馬鈴薯甲蟲聚集素的混合物的“Y”型嗅覺反應(yīng)結(jié)果如表2所示。2-苯乙醇(5號試劑)對馬鈴薯甲蟲雄蟲和雌蟲都具有比較高的引誘作用,引誘率分別為73.33%和71.67%。芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯3種物質(zhì)的混合物(13號試劑)對馬鈴薯甲蟲的引誘作用具有性別間反應(yīng)差異現(xiàn)象:雄蟲具有很高的引誘率(81.67%),但是對雌蟲的引誘率并不高(63.33%)。另外,芳樟醇(1號試劑)、順乙酸-3-己烯酯(4號試劑)、順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯(9號試劑)對馬甲雄蟲表現(xiàn)為引誘作用,芳樟醇(1號試劑)對馬甲雌蟲表現(xiàn)為引誘作用,但是引誘率都很低,對進(jìn)一步進(jìn)行田間誘集試驗意義不大。馬鈴薯甲蟲聚集素(8號試劑)對馬鈴薯甲蟲雄蟲和雌蟲都具有很高的引誘率,分別為78.33%和76.67%。有意思的是在芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯中加入馬鈴薯甲蟲聚集素(17號試劑)不但提高了雄蟲的引誘率(88.33%),也消除了之前的雌雄反應(yīng)差異現(xiàn)象,對雌蟲的引誘率達(dá)到83.33%。根據(jù)以上室內(nèi)行為測定試驗的結(jié)果,我們選擇了引誘率較高的2-苯乙醇、芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯、馬鈴薯甲蟲聚集素、芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯+馬鈴薯甲蟲聚集素,即5,8,13和17號共4種引誘劑配方進(jìn)行田間誘集試驗,進(jìn)一步確定田間的引誘作用。2.2馬鈴薯無機(jī)溶劑最佳添加量試驗結(jié)果田間誘集試驗的結(jié)果如表3所示,2-苯乙醇田間誘蟲量雖然和對照具有顯著性差異,但是在很高的蟲口密度下誘蟲量很低,即:釋放試蟲后的24h內(nèi)每個誘捕器平均誘蟲量為雄蟲3.33頭,雌蟲2.17頭。芳樟醇+水楊酸甲酯+順乙酸-3-己烯酯的田間誘集結(jié)果和室內(nèi)試驗結(jié)果一致,也具有雌雄反應(yīng)差異現(xiàn)象,對雄蟲具有較高的誘蟲量(6.17頭),而對雌蟲的引誘作用和對照差異不顯著。馬鈴薯甲蟲聚集素的田間誘蟲數(shù)雖比較高,雄蟲為7.83頭,雌蟲為7.5頭。但是這組試驗的對照誘蟲數(shù)也比較高,雌雄分別為3.33頭和2.17頭。當(dāng)在芳樟醇+水楊酸甲酯+順乙酸-3-己烯酯中加入馬鈴薯甲蟲聚集素之后不但消除了雌雄反應(yīng)差異現(xiàn)象,也使誘蟲量大幅增加,雌雄的誘蟲量分別為14.17頭和14.67頭。3浮物和其他物物對馬鈴薯甲烷誘變的作用從室內(nèi)行為反應(yīng)測定的試驗結(jié)果來看,芳樟醇+乙酸葉醇酯+水楊酸甲酯的混合物雖然對馬鈴薯甲蟲雄蟲引誘率很高(81.67%),而對雌蟲的引誘率卻很低(63.33%)。這與國外其他研究工作者的研究結(jié)果基本一致(Dickens,2000)。但是順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯,芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯,芳樟醇+壬醛+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯,芳樟醇+壬醛+水楊酸甲酯+(Z)-3-己烯-1-醇(微量)+(E)-2-己烯-1-醇(微量)4種混合物(即室內(nèi)生測試驗的9,10,15和16號試劑)均對馬鈴薯甲蟲不具有引誘性或引誘率極低,這與Dickens(2000)的研究結(jié)果卻不一致,導(dǎo)致這種情況產(chǎn)生的原因可能與馬鈴薯甲蟲的種群差異性有關(guān)。比如,在美國馬鈴薯甲蟲的寄主植物包括番茄,而在新疆用番茄飼養(yǎng)馬鈴薯甲蟲則不能使其正常完成世代發(fā)育,說明在新疆番茄不能作為馬鈴薯甲蟲的獨立寄主。從室內(nèi)行為反應(yīng)測定的結(jié)果也可以看出,對馬鈴薯甲蟲起引誘作用的植物揮發(fā)物主要包括2-苯乙醇以及芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯的混合物,而其他的揮發(fā)物單體或混合物卻對馬鈴薯甲蟲引誘作用不明顯。在觸角電位的研究中(Dickens,2002),對馬鈴薯甲蟲觸角產(chǎn)生強(qiáng)烈電位反應(yīng)的化合物包括:2-苯乙醇、壬醛和馬鈴薯甲蟲聚集素。通過室內(nèi)行為反應(yīng)試驗我們也進(jìn)一步證實了2-苯乙醇和馬鈴薯甲蟲聚集素確實對馬鈴薯甲蟲具有很高的引誘率(表2中的5、8號試劑)。而壬醛的單體卻不具有引誘作用,這一點與Schütz等(1997)的研究結(jié)果相同。近些年來關(guān)于寄主植物揮發(fā)物和昆蟲信息素的互作的研究很多(Landolt,1997;LandoltandPhillips,1997;ReddyandGuerrero,2004)。在鞘翅目昆蟲中,首先發(fā)現(xiàn)信息素的作用被寄主植物揮發(fā)物所加強(qiáng)是在南部松小蠹Dendroctonusfrontalis中,南部松小蠹所產(chǎn)生的聚集素的作用被其寄主植物揮發(fā)物α-蒎烯所加強(qiáng)(RenwickandVité,1969)。最佳的使用信息素進(jìn)行害蟲防治的方法可能需要依靠寄主植物揮發(fā)物和昆蟲信息素的互作作為基礎(chǔ)(LandoltandPhillips,1997)。在本研究中,不論是室內(nèi)生測試驗還是田間誘集試驗,在芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯的混合物中加入馬鈴薯甲蟲聚集素之后,不但消除了之前的雌雄反應(yīng)差異現(xiàn)象,也使引誘率得到提升,由此可見芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯的混合物對馬鈴薯甲蟲聚集素的引誘作用起著增強(qiáng)的作用。從田間誘集試驗的結(jié)果我們可以看出,2-苯乙醇在田間也具有一定的引誘作用(表3),但是引誘效果不是很好。芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯的混合物和馬鈴薯甲蟲聚集素在田間都具有一定的引誘作用(Marteletal.,2005),本研究田間誘集試驗的結(jié)果也再次證明了這一點(表3)。另外馬鈴薯甲蟲聚集素+(芳樟醇+水楊酸甲酯+順乙酸-3-己烯酯)的田間誘集結(jié)果(表3)顯示,在芳樟醇+順乙酸-3-己烯酯+水楊酸甲酯的混合物中加入馬鈴薯甲蟲聚集素可以使田間誘蟲數(shù)得到提升,這也說明了以