實(shí)驗(yàn)20植物組織中游離氨基酸總量的測定

實(shí)驗(yàn)20植物組織中游離氨基酸總量的測定果蔬游離氨基酸含量的測定氨基酸(aminoacid,AA)是組成蛋白質(zhì)的基本單位，游離氨基酸與果蔬品質(zhì)和特殊風(fēng)味的呈現(xiàn)有關(guān)。在果蔬的生長發(fā)育、成熟衰老過程中，游離氨基酸含量的變化與果蔬組織生理生化代謝密切相關(guān)。測定果蔬組織中游離氨基酸的含量對于研究果蔬采后生理、氮素代謝及營養(yǎng)狀況等具有重要意義。常用茚三酮顯色法測定果蔬組織中游離氨基酸含量(freeaminoacidcontent)。一、實(shí)驗(yàn)原理在酸性條件下,氨基酸與茚三酮共熱時,能定量地生成顯示藍(lán)紫色的產(chǎn)物二酮茚胺，稱為Ruhemans紫。該產(chǎn)物在波長570nm處有吸收峰,而且在一定范圍內(nèi)吸光度值與氨基酸濃度成正比。因此,可用分光光度計(jì)法測定其含量。氨基酸與茚三酮的反應(yīng)分兩步進(jìn)行。第一步,氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,茚三酮被還原成還原型茚三酮;第二步,所形成的還原型茚三酮與另一個茚三酮分子和一分子氨脫水縮合生成二酮茚-二酮茚胺(Ruhemans紫),反應(yīng)式如下:二、實(shí)驗(yàn)儀器分光光度計(jì)、研缽、水浴鍋、錐形瓶、電子天平;漏斗、濾紙、具塞刻度試管(20mL)、容量瓶(50mL、100mL)、燒杯、移液器、玻璃棒.吸水紙擦鏡紙、電爐、水浴鍋。三、實(shí)驗(yàn)試劑1、無氨蒸餾水

在每升蒸餾水中加入2mL濃硫酸和少量高錳酸鉀混合，保持紫紅色,再蒸餾一次即可。2、pH5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液

稱取54.4g乙酸鈉加人100mL無氨燕餾水,在電爐上加熱至沸，使體積蒸發(fā)至60mL左右。冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中加30mL冰醋酸,冉用尤氨蒸餾水稀釋至100mL。3、水合茚三酮試劑

稱取0.6g重結(jié)晶的茚三酮,置于燒杯中,加入15mL正丙醇,攪拌使茚二E酮溶解。再加入30mL正丁醇及60mL乙二醇，最后加入9mLpH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻，貯于棕色瓶,置4℃下保存?zhèn)溆茫?0d內(nèi)有效。4、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液

稱取46.8mg在80℃烘干的亮氨酸(相對分子質(zhì)量為131.11),溶于少量10%異丙醇中，并用該溶液定容至100mL混勻。取5ml.該溶液,用蒸餾水稀釋至50mL,即1mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液含5μg的氨基氮。5、1g/L抗壞血酸溶液

稱取50mg抗壞血酸,溶于50mL無氨蒸餾水中,隨配隨用。6、10%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液

量取10mL冰醋酸,用無氨蒸餾水稀釋至100mL。7、95%乙醇四、實(shí)驗(yàn)步驟1、制作標(biāo)曲取6支20mL具塞刻度試管,編號,按表2加入各種試劑，蓋上玻璃塞,混勻。再在100℃水浴中加熱15min(加熱時封口),取出后立即置于冷水中迅速冷卻。然后迅速向每管中加入5.0mL95%乙醇,塞好塞子,猛搖試管,使加熱時形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色,此時溶液呈藍(lán)紫色。然后用60%乙醇稀釋至20mL,以0號管為參比進(jìn)行調(diào)零,于波長570nm處測定溶液的吸光度值。重復(fù)三次,以氨基氮的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出線性回歸方程。2、提取稱取1.0g果蔬組織樣品,置于研缽中,加入5.0mL10%乙酸溶液,研磨勻漿后,轉(zhuǎn)移.到100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋、定容至刻度,混勻。然后用干濾紙過濾到三角瓶中備用。3、測定吸取1.0mL樣品濾液,置于20mL干燥具塞刻度試管中,加入1.0mL無氨蒸餾水。其它操作步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法相同。4、計(jì)算結(jié)果根據(jù)顯色液的吸光度值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的氨基氮質(zhì)量。果蔬組織中游離氨基酸總量以每100g果蔬(鮮重)中氨態(tài)氮的質(zhì)量表示，即mg/100g。計(jì)算公式:m'——從