羥化反應(yīng)的研究進(jìn)展

羥化反應(yīng)的研究進(jìn)展

這種藥物是抗生素的第二次主要藥物。它的合成、應(yīng)用和抗生素被稱為20世紀(jì)醫(yī)學(xué)工業(yè)最受關(guān)注的兩個(gè)成果。主要由植物起源的肥皂組成，并通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)皮質(zhì)產(chǎn)品。近些年來(lái),微生物催化轉(zhuǎn)化在甾體藥物合成過(guò)程應(yīng)用的發(fā)展迅速,形成了一條生物—化學(xué)相耦聯(lián)的轉(zhuǎn)化新技術(shù)。相對(duì)化學(xué)全合成來(lái)說(shuō),生物轉(zhuǎn)化有著高效、低成本、低污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。1952年美國(guó)普強(qiáng)藥廠(Upjohn)的Peterson和Murray首次發(fā)現(xiàn)黑根霉(Rhizopunigricans)對(duì)甾體具有C11羥化能力,從而使孕酮到皮甾酮的合成縮短為三步,收率達(dá)90%,從此解決了可的松等皮質(zhì)激素類化合物合成的難題,由此開(kāi)創(chuàng)了微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的先例。1958年黃鳴龍等利用黑根霉將沃氏氧化物引入C11α-羥基,因而開(kāi)創(chuàng)了從薯蕷皂素通過(guò)開(kāi)環(huán)、環(huán)氧、羥化、上溴、脫溴、上碘、置換等7步合成可的松的路線。這是我國(guó)第一個(gè)將微生物用于甾體激素的合成工藝中,使我國(guó)可的松的合成跨入了世界先進(jìn)行列。1關(guān)于工程應(yīng)用微生物羥化、脫氫逐漸成為工業(yè)上生產(chǎn)甾體藥物的重要手段,其中羥基化反應(yīng)是甾體藥物生物轉(zhuǎn)化類型中最重要的反應(yīng)。微生物利用酶的作用能在甾體母核的任何位置進(jìn)行羥基化,而化學(xué)方法除了C17容易進(jìn)行羥基化反應(yīng)外,在甾體母核其他位置都較難引入羥基。在甾體微生物羥化反應(yīng)研究中,最為常見(jiàn)的屬C11α、C11β、C16α、C9α,因其能產(chǎn)生高級(jí)皮質(zhì)甾類化合物而備受關(guān)注,并取得了較大的成果。半個(gè)多世紀(jì)以來(lái),人們先后在自然界中發(fā)現(xiàn)了許多種微生物具有甾體C11的羥化能力,研究較為成熟的有黑根霉(Rhizopusnigricans)、犁頭霉(Absidia)、彎孢霉(Curvularia)、小克銀漢霉(Cunninghemella)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)及綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)等。甾體羥化反應(yīng)所需的關(guān)鍵酶是一種以游離或膜結(jié)合形式廣泛存在的細(xì)胞色素P450依賴型單加氧酶(mono-oxygenases)。這種酶可以在底物分子中增加一個(gè)氧原子,另一個(gè)氧原子則用于氧化還原型輔酶Ⅰ(NADH)或還原型輔酶Ⅱ(NADPH),反應(yīng)如下:根據(jù)18O2、DO2及H2O18同位素示蹤實(shí)驗(yàn),羥化過(guò)程的氧原子不是來(lái)自水分子,而是空氣中的氧,證實(shí)了轉(zhuǎn)化到甾體上的羥基直接取代了甾體碳架上的氫原子,并且取代過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生立體構(gòu)象的變化,也不是先通過(guò)形成烯的中間體來(lái)完成的,這也從理論上說(shuō)明了工業(yè)上用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化甾體時(shí)需要提高通氣量的原因。微生物C11-羥化反應(yīng)根據(jù)羥化酶可分為C11α和C11β-羥化反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),11β-羥基的甾體化合物具有十分重要的藥理活性,現(xiàn)有的高級(jí)皮質(zhì)激素藥物都具有C11β-羥基。但由于C10位、C13位的甲基容易造成C11β-羥基的立體位阻比C11α-羥基大,并致使C11β-羥基化比C11α-羥基化效率低、副產(chǎn)物多,在一定程度上制約著它的大規(guī)模應(yīng)用。工業(yè)上更多的是進(jìn)行C11α-羥化反應(yīng),但因?yàn)槿梭w對(duì)C11α-羥基甾體不能直接吸收,故需要通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)將羥基構(gòu)象進(jìn)行重建,一般方法是先將羥基氧化為羰基再進(jìn)行還原。2高哌體轉(zhuǎn)化率研究甾體的微生物羥化反應(yīng)是利用微生物的羥化酶向甾體特定部位引入羥基。一方面由于羥化酶的不穩(wěn)定性,在提取過(guò)程中極易失活;另一方面,甾體化合物的水溶性差(10-6~10-5mol/L),底物的傳質(zhì)成為影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵因素,并且催化反應(yīng)所需的酶大多為胞內(nèi)酶,細(xì)胞膜通透性也是影響傳質(zhì)的主要障礙。為此,提高底物在轉(zhuǎn)化液中的有效濃度、增加細(xì)胞膜的通透性是開(kāi)發(fā)新型轉(zhuǎn)化工藝以提高甾體轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵技術(shù)。近5年來(lái),國(guó)內(nèi)外從事甾體C11羥化的研究報(bào)道并不多,而國(guó)內(nèi)主要集中于黑根霉、赭曲霉等對(duì)16α,17α-環(huán)氧黃體酮和坎利酮的C11α羥化以及小克銀漢霉和犁頭霉對(duì)6α,17α-環(huán)氧黃體酮和氫化可的松中間體的C11β羥化(表1)。迄今為止,對(duì)微生物細(xì)胞甾體C11β-羥化酶體系的研究仍較薄弱。雖然C11β-羥化相對(duì)困難,投料濃度低,難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,但近年來(lái)國(guó)內(nèi)也已經(jīng)出現(xiàn)了一些突破。比如成都生物研究所楊順楷課題組,利用犁頭霉和新月彎孢霉的雙霉菌協(xié)同轉(zhuǎn)化,在底物投料濃度為0.1%的條件下,轉(zhuǎn)化RSA制備氫化可的松的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了85%。天津輕工業(yè)學(xué)院王敏等也有較多的C11β-羥化的報(bào)道,在將化合物RS-21醋酸酯轉(zhuǎn)化為氫化可的松的工藝研究中,其β體轉(zhuǎn)化率達(dá)75%。還有浙江大學(xué)的關(guān)怡新課題組利用短刺小克銀漢霉C11β羥化轉(zhuǎn)化環(huán)氧黃體酮為11β-羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮時(shí),在0.2%的底物投料量下,通過(guò)發(fā)酵液稀釋補(bǔ)料的投料方式,有效地將產(chǎn)物得率從35%提高到43%。2012年,NaghibiF等首次報(bào)道了赭曲霉的C11β羥化能力,將皮甾酮(RS)一步轉(zhuǎn)化為氫化可的松。目前,甾體藥物的研究主要集中于提高底物溶解性、改善細(xì)胞通透性、建立新型轉(zhuǎn)化體系等工藝技術(shù)上。2.1對(duì)細(xì)胞的毒性由于甾體化合物都難溶于水,目前的研究通常先把甾體底物盡可能地溶解于乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇、丙酮等有機(jī)溶劑中,然后投入發(fā)酵液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。該投料方式往往受到兩個(gè)因素的限制:一是甾體在溶劑中的溶解度有限,二是有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性。徐詩(shī)偉等在研究地塞米松中間體的C1,4脫氫和11α羥基化時(shí),采用N,N-二甲基甲酰胺溶解底物后進(jìn)行投料,使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高了約40%,且底物轉(zhuǎn)化完全。萬(wàn)金營(yíng)等在研究黑根霉催化16α,17α-環(huán)氧黃體酮的C11α-羥基化時(shí),底物經(jīng)吐溫-80處理后最終轉(zhuǎn)化率比對(duì)照提高了18%。通過(guò)添加溶劑提高底物在轉(zhuǎn)化體系中的溶解度是目前甾體微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中最為常見(jiàn)和簡(jiǎn)單的方法,并且在很多的產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目上得以應(yīng)用。筆者曾在上海某公司利用黑根霉、赭曲霉、綠僵菌等對(duì)16α,17α-環(huán)氧黃體酮進(jìn)行C11α-羥基化時(shí),通過(guò)對(duì)添加適當(dāng)甲醇、乙醇溶劑的方法對(duì)工藝進(jìn)行了改進(jìn),使轉(zhuǎn)化率提高約10%。該方法還在節(jié)桿菌對(duì)地塞米松、倍他米松的1,2位脫氫等工藝上也得到了很好的應(yīng)用。2.2原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化多數(shù)甾體化合物在水中的溶解度都很低,因此底物在發(fā)酵液中的傳質(zhì)是影響轉(zhuǎn)化速率的關(guān)鍵因素。超聲波處理、添加表面活性劑、磁場(chǎng)及原生質(zhì)體處理等都是增強(qiáng)底物溶解性和細(xì)胞膜透性的有效手段。陽(yáng)葵等考察了磁化水處理菌種對(duì)羥化16α,17α-環(huán)氧黃體酮的效應(yīng),結(jié)果表明經(jīng)磁化水處理的綠僵菌對(duì)底物11α羥化能力有明顯改善。2001年,陽(yáng)葵等采用單組分分散劑PSE來(lái)增加溶液中沃氏氧化物的含量,結(jié)果顯著加速反應(yīng)初期的轉(zhuǎn)化,但迅速累積的產(chǎn)物也對(duì)中后期的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生明顯阻遏,其最終轉(zhuǎn)化率約42%。甾體轉(zhuǎn)化過(guò)程中,原生質(zhì)體可以有效解除細(xì)胞壁的阻礙作用。1982年,Jawofski等在潑尼松的11β-羥化中利用稀KOH、蝸牛酶、乙二胺四乙酸(EDTA)等處理小克銀漢霉孢子,最終羥化產(chǎn)量提高了2~4倍。又如Dtugonski等用溶菌酶處理雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)細(xì)胞,獲得的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化11-脫氧皮甾醇,5mg底物經(jīng)4h轉(zhuǎn)化,獲得1.1mg11α-羥化產(chǎn)物和0.4mg11β-羥化產(chǎn)物。王敏等利用溶壁酶和纖維素酶處理新月彎孢霉(Curvularialunata)、藍(lán)色犁頭霉,對(duì)化合物RSA進(jìn)行了11β羥基化轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化速度是菌絲體的1.88倍,在底物濃度相等的情況下,轉(zhuǎn)化周期縮短12h。2.3新的轉(zhuǎn)化體系2.3.1離子液氧化對(duì)蝌蚪體催化氧化的影響1991年,InoueA等人研究了油酸/水兩液相體系中赭曲霉(Aspergillusochraceus)游離細(xì)胞對(duì)黃體酮C11α羥基化,發(fā)現(xiàn)11羥基化活力取決于有機(jī)相與水相的組成比例,油酸的比例越高對(duì)強(qiáng)化反應(yīng)越不利。離子液在甾體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用也是近年來(lái)形成的一種新型轉(zhuǎn)化體系,具有高效、無(wú)毒、無(wú)污染、回收方便和可重復(fù)使用等優(yōu)勢(shì)。Wu等發(fā)現(xiàn)黑根霉在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[BMIm]PF6離子液-水組成的兩相體系中能將底物轉(zhuǎn)化率提高到90%,且連續(xù)利用3個(gè)批次后,總轉(zhuǎn)化率仍維持87%以上。兩相轉(zhuǎn)化體系在C11羥化的生物轉(zhuǎn)化中研究甚少,但在甾體的微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛,本課題組在利用植物油/水—雙液相體系轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮、雄二烯二酮,轉(zhuǎn)化率高。該項(xiàng)目也在多個(gè)廠家實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn),值得借鑒、推廣于甾體C11羥基化。2.3.2性固定化介質(zhì)對(duì)哌體傳質(zhì)的影響固定化技術(shù)在甾體藥物生物催化中應(yīng)用廣泛。對(duì)甾體藥物固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)研究的最多和最有成效的是固定化細(xì)胞包埋技術(shù)。采用疏水性固定化介質(zhì)將更有利于水不溶性甾體底物與產(chǎn)物的擴(kuò)散和傳質(zhì)。由于羥化酶穩(wěn)定性較差,霉菌的菌絲比較脆弱,因此在甾體11α-羥化生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用中顯得相對(duì)困難。臺(tái)灣的Jer-YiingHoung等報(bào)道了在海藻酸鈉包埋的凝膠顆粒表層外包裹一層聚尿(polyurea),制得的固定化細(xì)胞在雙液相體系中進(jìn)行孕酮的11α-羥基化時(shí),其轉(zhuǎn)化速率為未包裹聚尿細(xì)胞的6倍。2.3.3微生物的制備生物轉(zhuǎn)化工藝趨向于高濃度底物轉(zhuǎn)化,采用細(xì)粉末固體直接投料方式或采用輔助溶料。由于甾體化合物的疏水性,在底物濃度較高時(shí),產(chǎn)物在發(fā)酵液中呈結(jié)晶析出,屬于擬結(jié)晶發(fā)酵。這種采用微生物菌體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通常分兩個(gè)階段,第一階段是菌體的培養(yǎng),第二階段是加入甾體。當(dāng)前,有一種很具吸引力的生物轉(zhuǎn)化技術(shù),即靜息細(xì)胞法。靜息細(xì)胞法又稱細(xì)胞懸浮法或置換培養(yǎng)法,它將微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)同生物轉(zhuǎn)化嚴(yán)格地分開(kāi)進(jìn)行。該技術(shù)在本單位生物法制備丙烯酰胺項(xiàng)目上已經(jīng)相當(dāng)成熟,即微生物的菌絲體經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)后,采用膜過(guò)濾或離心的方法收集細(xì)胞,并經(jīng)過(guò)洗滌后懸浮在合適的緩沖液介質(zhì)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。早在1976年,馮漢昌等就報(bào)道了將培養(yǎng)的微生物菌體分離,置于蒸餾水中使化合物“S”在固—液相中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,既可簡(jiǎn)化工藝,又使氧化速度(C11β-羥化速度)提高1~2倍,縮短了發(fā)酵周期。王敏等[6在犁頭霉對(duì)RSA的C11β-羥基化研究中,篩選了數(shù)種緩沖體系對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果的研究,結(jié)果表明檸檬酸緩沖系統(tǒng)有利于C11β-羥基化,且洗滌菌絲體或稀釋發(fā)酵液可以提高羥化酶的專一性,減少異構(gòu)體的形成。2.3.4烷基可的松hc的制備協(xié)同轉(zhuǎn)化法,即采用多種不同的微生物進(jìn)行連續(xù)或混合培養(yǎng),同時(shí)實(shí)現(xiàn)甾體化合物的多步反應(yīng)。1981年,法幼華等利用諾卡氏菌62-1和藍(lán)色犁頭霉AS3.65的協(xié)同轉(zhuǎn)化作用將5α-娠烷-3β17α-二羥基-20-酮-21-醋酸酯(RSA)一步轉(zhuǎn)化生成了氫化可的松(HC)。它是通過(guò)諾卡氏菌脫氫酶進(jìn)行C4,5位脫氫,再通過(guò)藍(lán)色犁頭霉進(jìn)行水解和C11β羥基化,一次投料即可生成氫化可的松。又如范林萍等建立了藍(lán)色犁頭霉AS3.65和新月彎孢霉AS3.4381協(xié)同多輪轉(zhuǎn)化(RSA)制備氫化可的松新工藝,在甾體底物RSA平均投料質(zhì)量濃度為1.3g/L和1g/L的條件下,達(dá)到了81.6%和85%的轉(zhuǎn)化率。近年來(lái),有不少關(guān)于用多菌協(xié)同轉(zhuǎn)化制備甾體激素藥物的報(bào)道,這是一種新興的生產(chǎn)技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)一次生物轉(zhuǎn)化完成了多步反應(yīng),可以大大節(jié)約成本,減少環(huán)境壓力。因此,它也是一種綠色、經(jīng)濟(jì)的工藝技術(shù),值得開(kāi)發(fā)。3工程研究趨勢(shì)近年來(lái),由于皂素資源逐漸枯竭,吸引并刺激了大批國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)甾體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)和工藝的開(kāi)發(fā)。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展,甾體的微生物羥化雖然在菌種、溶解度提高、新轉(zhuǎn)化工藝等方面取得了一定的成果,但多數(shù)仍處于基礎(chǔ)研究階段,實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的工藝并不很多。中國(guó)和印度是甾體激素原料藥及其制劑的主要生產(chǎn)國(guó),中國(guó)的甾體激素原料藥年產(chǎn)值近100億元,其中70%出口,且皮質(zhì)激素類原料的生產(chǎn)規(guī)模已居世界之首。但很多的原料藥卻只能出口至印度,印度的廠商經(jīng)過(guò)加工、包裝后以成倍的價(jià)格出口至美國(guó)。這就是技術(shù)壁壘所帶來(lái)的巨大代價(jià),利潤(rùn)微薄,而污染卻留在了國(guó)內(nèi)?？梢?jiàn)提升我國(guó)甾體激素藥物生產(chǎn)技術(shù)迫在眉睫,任重而道遠(yuǎn)。在甾體藥物的開(kāi)發(fā)過(guò)程中,不僅可以通過(guò)化學(xué)合成法實(shí)現(xiàn)生產(chǎn),某些特定的化學(xué)反應(yīng)通過(guò)微生物酶的作用同樣能夠?qū)崿F(xiàn)?；瘜W(xué)法與生物法的聯(lián)合應(yīng)用不僅減少了化學(xué)全合成所帶來(lái)的污染,也大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。C11羥基化作為生物法生產(chǎn)甾體藥物的重要方法之一,已受到了人們的重視。尤其是C11β-羥基的甾體化合物具有十分重要的藥理活性,現(xiàn)有的高級(jí)皮質(zhì)激素