中藥軟肝纖消湯預(yù)防及治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

中藥軟肝纖消湯預(yù)防及治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

肝實(shí)質(zhì)是由多種因素引起的肝組織異常增生和虛細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）過度積聚引起的疾病。這是慢性肝炎發(fā)展到肝硬化和必要階段的第一階段。慢性肝病是因肝病既久,乘脾犯胃及腎,致肝、脾、腎俱損,氣、血、水博結(jié),其關(guān)鍵在于氣滯血淤,因此治則要以活血化淤、軟堅(jiān)散結(jié)為主。我們用自制的中藥軟肝纖消湯是中藥復(fù)方合劑,具有舒肝理氣活血化淤的作用。為了進(jìn)一步探討其預(yù)防和治療肝纖維化的作用,我們用自制的中藥軟肝纖消湯給藥,經(jīng)四氯化碳造大鼠肝纖維化模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究觀察其血清學(xué)和病理學(xué)的變化1材料和方法1.1研究適用的藥材中藥軟肝纖消湯(柴胡10g黃芩10g、半夏10g、當(dāng)歸10g、枸杞子10g、香附10g澤瀉10g、穿山甲3g、鱉甲3g、丹參20g、白芍10g、甘草10g、黨參15g、白術(shù)10g、桃仁10g),由承德中藥材公司提供合格藥材,經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所煎煮制備;四氯化碳為北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品(分析純);護(hù)肝片,國藥準(zhǔn)字號(hào)黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠,體重160～180g,雌雄各半由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號(hào)吉?jiǎng)釉O(shè)字10-1011號(hào)。1.4病理分類方法1.4.1空泡和球加多的臟器(-)肝細(xì)胞內(nèi)未見空泡變性;(+)部分肝細(xì)胞(<25%)內(nèi)出現(xiàn)空泡;(++)較多的肝細(xì)胞(25%～50%)內(nèi)出現(xiàn)空泡;(+++)大量肝細(xì)胞(>50%)內(nèi)出現(xiàn)空泡。1.4.2點(diǎn)、灶狀死(-)肝細(xì)胞未見壞死;(+)肝細(xì)胞呈點(diǎn)、灶狀壞死,散在分布;(++)肝細(xì)胞呈點(diǎn)、灶狀壞死,分布范圍較廣;(+++)肝細(xì)胞呈大片狀或橋接壞死、彌散分布。1.4.3隔肝治療組織細(xì)度++膠原纖維表土(-)肝組織正常;(+)膠原纖維含量增加,很少形成條索分隔肝小葉,可見匯管區(qū)擴(kuò)大,纖維化;(++)膠原纖維呈細(xì)條索狀分隔肝小葉、散在分布,表現(xiàn)為不完全分隔假小葉;(+++)膠原纖維呈較寬的條索狀分隔肝小葉,表現(xiàn)為完全分隔成假小葉。1.5預(yù)防護(hù)肝片和治療模型將Wistar大鼠60只,隨機(jī)分為預(yù)防組和治療組,預(yù)防組又分為預(yù)防中藥軟肝纖消湯組、預(yù)防護(hù)肝片組和預(yù)防模型組,治療組又分為治療中藥軟肝纖消湯組、治療護(hù)肝片組和治療模型。造模采用四氯化碳皮下注射法,首次皮下注射四氯化碳原液(0.5ml/100g),以后每周皮下注射40%四氯化碳2次(0.3ml/100g),進(jìn)行反復(fù)強(qiáng)化刺激,共持續(xù)7周。1.5.1評估肝、脾指標(biāo)預(yù)防中藥軟肝纖消湯組在造模的同時(shí)給中藥軟肝纖消湯,給藥途徑采用灌胃給藥法(2ml/100g,1次/d),劑量為臨床成人用藥量的10倍;預(yù)防護(hù)肝片組在造模的同時(shí)給用生理鹽水制成的護(hù)肝片混懸液(0.9ml/100g,1次/d);預(yù)防模型組在造模的同時(shí)給常水。均為7周,然后在第8周左心室取血離心取血清測生化指標(biāo);處死后稱體重及肝、脾重量并計(jì)算肝、脾指數(shù);剖腹取肝組織,肝組織固定在10%的中性甲醛液中,用于病理學(xué)的HE染色和天狼猩紅染色,HE染色用于觀察肝細(xì)胞脂肪變性和肝細(xì)胞壞死情況,天狼猩紅染色用于觀察肝纖維組織增生情況。1.6統(tǒng)計(jì)方法2結(jié)果2.1預(yù)防小組2.1.1肝功能損害總生化指標(biāo)檢測結(jié)果預(yù)防組中中藥軟肝纖消湯組、護(hù)肝片組和預(yù)防模型組大鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGP)、血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、白/球比(A/G)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)肝功能系列生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。預(yù)防中藥軟肝纖消湯組、預(yù)防護(hù)肝片組與預(yù)防模型組ALT和GGP活力相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而軟肝纖消湯組與預(yù)防護(hù)肝片組相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。軟肝纖消湯組、預(yù)防護(hù)肝片組與預(yù)防模型組A/G、TP相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。軟肝纖消湯組與預(yù)防護(hù)肝片組相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。軟肝纖消湯組、預(yù)防護(hù)肝片組與預(yù)防模型組LDH活力相比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而軟肝纖消湯組與預(yù)防護(hù)肝片組相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.1.2防模型組與防模型組比較軟肝纖消湯組、預(yù)防護(hù)肝片組肝、脾指數(shù)與預(yù)防模型組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而軟肝纖消湯組與預(yù)防護(hù)肝片組肝、脾指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.1.3各組大鼠肝臟脂肪變性,肝纖維組織增生率比較預(yù)防組大鼠肝臟的病理學(xué)變化。見表3。預(yù)防組中中藥軟肝纖消湯組、護(hù)肝片組肝細(xì)胞脂肪變性,肝細(xì)胞壞死,肝纖維組織增生與預(yù)防模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而軟肝纖消湯組與護(hù)肝片組肝細(xì)胞脂肪變性,肝細(xì)胞壞死,肝纖維組織增生相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2治療組2.2.1各組ast活力、bun含量治療組中中藥軟肝纖消湯組、護(hù)肝片組和預(yù)防模型組大鼠血清肝功能系列生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表4。治療中藥軟肝纖消湯組、治療護(hù)肝片組AST活力、BUN含量與治療模型組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而治療中藥軟肝纖消湯組與治療護(hù)肝片組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2.2組脾指數(shù)的比較治療中藥軟肝纖消湯組和治療護(hù)肝片組大鼠的肝、脾指數(shù)見表5。治療中藥軟肝纖消湯組和治療護(hù)肝片組與治療模型組脾指數(shù)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而治療中藥軟肝纖消湯組與治療護(hù)肝片組脾指數(shù)相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2.3組大鼠肝功能指標(biāo)及模型的比較治療組中中藥軟肝纖消湯組、護(hù)肝片組和治療模型組肝臟的病理學(xué)變化見表6。治療中藥軟肝纖消湯組與護(hù)肝片組肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞壞死、肝纖維組織增生與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而治療中藥軟肝纖消湯組和護(hù)肝片組肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞壞死、肝纖維組織增生相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3中藥軟肝纖消湯對大鼠肝纖維化中alt和gpp活性的影響肝纖維化是多種慢性肝病在疾病發(fā)展過程中共同的病理基礎(chǔ),是ECM合成與降解失衡從而導(dǎo)致其過度沉積的結(jié)果。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)在肝纖維化病理生理過程中起著十分關(guān)鍵的作用,當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷后HSC活化、增生、分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast),可合成多種與肝纖維化有關(guān)的ECM。肝纖維化是許多肝臟疾病的一個(gè)中間環(huán)節(jié),其病變有一定的可逆性,因此,積極的防治肝纖維化是防止病情進(jìn)展為肝硬化的關(guān)鍵。肝纖維化的病機(jī)為“因肝病既久,乘脾犯胃及腎,致肝、脾、腎俱損,氣、血、水博結(jié)”,其關(guān)鍵在于氣滯血淤,因此治則要以活血化淤、軟堅(jiān)散結(jié)為主,中藥軟肝纖消湯中丹參、柴胡、香附、木香、甘草具有舒肝理氣、活血化瘀功效,黨參、枸杞子、當(dāng)歸、白芍具有益氣養(yǎng)血養(yǎng)陰功效,山甲軟堅(jiān)散結(jié),黃芩清瀉少陽之熱,半夏有降逆止嘔,澤瀉利水滲濕泄熱的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),服用中藥軟肝纖消湯和護(hù)肝片后大鼠血清中ALT、GPP的活性降低;經(jīng)血清學(xué)檢測LDH及TP和A/G明顯高于模型組(P<0.05);中藥軟肝纖消湯能促進(jìn)肝細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)合成,減輕肝細(xì)胞變性壞死保護(hù)了肝細(xì)胞的穩(wěn)定性進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖病理學(xué)觀察顯示,服用中藥軟肝纖消湯組與護(hù)肝片組一樣還可使肝臟重量相對增加,明顯抑制脾臟的增生,軟肝纖消湯對肝細(xì)胞壞死及肝纖維化也有一定的抑制作用,從而也抑制了大鼠肝硬化的發(fā)展;中藥軟肝纖消湯與護(hù)肝片組一樣還可以降低大鼠血清中AST及BUN,ALT也有降低趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)證明中藥軟肝纖消湯有保護(hù)肝細(xì)胞、恢復(fù)肝功能和抑制肝纖維化的作用,中藥軟肝纖消湯與護(hù)肝片一樣對預(yù)防和治療肝纖維化有一定的作用。近年來,實(shí)驗(yàn)與臨床表明丹參具有明顯的降低急慢性肝損傷、動(dòng)物血清中轉(zhuǎn)氨酶活力,促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抑制膠原纖維增生、促進(jìn)已形成的膠原纖維降解和肝纖維的重吸收的作用,故在中藥軟肝纖消湯配方中重用了丹參?？傊?中藥軟肝纖消湯對肝纖維化有一定的預(yù)防和治療作用。1.2全自動(dòng)生化分析方法GB204型精密電子秤由瑞士梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn);7150型全自動(dòng)生化分析儀由日本國日立公司生產(chǎn);380-2型離心沉淀器由上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)(離心力4390kg),CMIAS真彩色病理圖象分析系統(tǒng)由北京航空航天大學(xué)研