黃體酮對(duì)腦梗死大鼠腦組織mmp-9、imp-1表達(dá)及血腦屏障通透性的影響

黃體酮對(duì)腦梗死大鼠腦組織mmp-9、imp-1表達(dá)及血腦屏障通透性的影響

基底金屬酶9（matopsis-9，mmp-9）和金屬酶組織抑制劑1（tissuebilite-1，tip-1）在腦梗死的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。MMP-9在腦水腫的形成過程中具有重要的作用,而TIMP-1則對(duì)其具有一定的抑制作用。觀察腦梗死后兩者表達(dá)水平的變化對(duì)于評(píng)價(jià)藥物的治療價(jià)值具有重要的意義。近期國外的研究表明,黃體酮對(duì)腦損傷具有一定的治療價(jià)值,其可以明顯減輕腦組織含水量與促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。但是對(duì)于黃體酮減輕腦水腫的機(jī)制研究甚少。為了解腦梗死后腦組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)情況并探討黃體酮減輕腦水腫的機(jī)制,特進(jìn)行如下研究。1免疫組化染色1.1動(dòng)物與分組Sprague-Dewley雄性大鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),清潔級(jí),體質(zhì)量250~300g,共120只。將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、HBC溶劑治療組和黃體酮治療組。其中后3組每組設(shè)24h、48h、7d3個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)12只大鼠。1.2動(dòng)物模型制作及給藥方法采用線栓法制備大腦永久性局灶性腦缺血模型。假手術(shù)組只分離、暴露血管,不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,不插入尼龍魚線。選擇蘇醒后左上肢屈曲、行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進(jìn)行實(shí)驗(yàn),否則視為栓堵失敗,棄之不用。將黃體酮溶于22.5%2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HBC)黃體酮治療組于術(shù)后腹腔注射黃體酮1次(15mg/kg體質(zhì)量),以后1次/d;溶劑治療組給予等體積的環(huán)糊精溶液治療。1.3腦含水量測(cè)定每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取6只進(jìn)行腦水含量測(cè)定。按麻醉后快速斷頭取腦,沿橋腦上界水平面切斷,稱取右半腦組織濕重,110℃恒溫烤箱中烘烤48h,稱取其干重,計(jì)算腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。1.4MMP-9及TIMP-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)常規(guī)灌注取腦,切取視交叉到小腦前的冠狀位切片,經(jīng)4%多聚甲醛溶液后固定72h,常規(guī)脫水石蠟包埋,作2μm厚的切片,HE染色。免疫組化染色采用SP法常規(guī)染色。MMP-9及TIMP-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)均以細(xì)胞質(zhì)染為棕色為陽性,以PBS代替一抗作陰性對(duì)照,用以知陽性切片作陽性對(duì)照。每張切片取5個(gè)高倍視野,每個(gè)高倍視野查100個(gè)細(xì)胞數(shù),計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。不同組同一時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(LSD法),方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSSforWindows13.0軟件包處理,取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2結(jié)果2.1各組小鼠腦含水量比較模型組和HBC溶劑治療組在梗死后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量與假手術(shù)組相比均有增高(P<0.05)。而黃體酮治療組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量則較模型組與HBC溶劑治療組均明顯降低,但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表1。2.2綜合分析cmp-9免疫組織化學(xué)結(jié)果假手術(shù)組MMP-9的表強(qiáng)度較低;黃體酮治療組MMP-9的表達(dá)強(qiáng)度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于模型組與溶劑治療組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見表2。2.3穩(wěn)定性下降4hTIMP-1在假手術(shù)組幾乎未有表達(dá);而在模型組梗塞后24h達(dá)到高峰,48h后開始下降;HBC溶劑治療組和黃體酮治療組亦有此規(guī)律,但黃體酮治療組TIMP-1表達(dá)均低于HBC溶劑治療組與模型組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見表3。3黃體酮的調(diào)節(jié)作用血腦屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜及附著于基底膜外層的星型膠質(zhì)細(xì)胞足突等構(gòu)成,在維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定方面有著重要的意義。在正常生理情況下血管細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和降解保持著動(dòng)態(tài)平衡,而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)本身的平衡對(duì)維持這種平衡起到了重要作用。MMPs/TIMPs的失衡會(huì)影響到細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解的平衡。在腦缺血過程中,表達(dá)增高的MMP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致腦微血管結(jié)構(gòu)完整性破壞和血腦屏障損壞,造成繼發(fā)性腦水腫和腦損傷。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1可能產(chǎn)生一種內(nèi)源性保護(hù)作用,且TIMP-1還是MMP-9的特異性抑制劑,因此調(diào)節(jié)兩者在梗死后腦組織中的平衡對(duì)維持基底膜細(xì)胞外基質(zhì)正常代謝和血腦屏障完整性方面顯得尤重要。黃體酮屬于神經(jīng)甾體激素,是一種新的對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生廣泛影響的神經(jīng)調(diào)質(zhì),并且在腦缺血的保護(hù)中具有重要作用。本研究通過建立大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(pMCAO)模型來觀察黃體酮對(duì)大鼠腦缺血后腦水腫、MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響,了解其能否通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1使其回復(fù)正常的平衡狀態(tài)而起到腦保護(hù)劑的作用。結(jié)果表明MMP-9在腦缺血24h時(shí)表達(dá)增加,于48h達(dá)到峰值,7d時(shí)表達(dá)下降,其表達(dá)變化與腦水腫程度動(dòng)態(tài)變化發(fā)生的時(shí)間一致。這也進(jìn)一步證實(shí)了MMP-9與缺血后腦水腫的形成密切相關(guān)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用黃體酮治療后缺血半暗帶內(nèi)MMP-9表達(dá)有明顯下降趨勢(shì),且腦水含量也較模型組及HBC治療組明顯降低。提示黃體酮可能通過抑制MMP-9的表達(dá)來減輕血腦屏障破壞,進(jìn)而減輕腦組織損傷。實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)TIMP-1在腦梗死后24h達(dá)到高峰,48h后下降。應(yīng)用黃體酮干預(yù)后TIMP-1的表達(dá)明顯降低。這可能與黃體酮通過抑制MMP-9的表達(dá),從而使伴隨MMP-9病理性表達(dá)升高的TIMP-1也相應(yīng)減少;也可能黃體酮自身對(duì)TIMP-1有一定的抑制作用。綜上所述,黃體酮可能通過