樣品預(yù)處理技術(shù)在中藥活性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

樣品預(yù)處理技術(shù)在中藥活性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

中醫(yī)學(xué)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)。通常，樣品中包含幾十或幾百種成分，不同成分之間的含量差異很大。由于這些特點(diǎn),中藥材通常需要進(jìn)行樣品預(yù)處理后才可以進(jìn)行各種儀器分析。否則,不但不能得到穩(wěn)定而可靠的測(cè)定結(jié)果,而且還會(huì)污染儀器。所以在進(jìn)行中藥材中活性成分的檢測(cè)時(shí),樣品預(yù)處理是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。樣品預(yù)處理技術(shù)也是分析化學(xué)的一個(gè)前沿課題。隨著對(duì)分析方法靈敏度、選擇性和分析速度要求的不斷提高,樣品預(yù)處理技術(shù)也必須跟上發(fā)展的步伐。但傳統(tǒng)的樣品預(yù)處理技術(shù)很難同時(shí)高效地完成樣品提取、凈化、濃縮和預(yù)分離的任務(wù),而且通常存在操作步驟繁瑣費(fèi)時(shí)、溶劑昂貴、毒性大、萃取效率低、液態(tài)樣品易乳化、難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和與儀器分析方法聯(lián)用等缺點(diǎn),樣品預(yù)處理已成為完成分析任務(wù)的制約環(huán)節(jié)。因此,樣品預(yù)處理技術(shù)的研究已引起了廣大分析工作者的關(guān)注,各種新技術(shù)與新方法的探索與研究已成為當(dāng)代分析化學(xué)的重要課題與發(fā)展方向之一。快速、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化的樣品預(yù)處理技術(shù)不僅可以省時(shí)、省力,而且可以減少由于不同人員的操作及樣品多次轉(zhuǎn)移所帶來的誤差,對(duì)避免使用大量溶劑及減少對(duì)環(huán)境的污染也有深遠(yuǎn)的意義。本文對(duì)近年來出現(xiàn)的各種樣品預(yù)處理新技術(shù)的特點(diǎn)及其在中藥活性成分檢測(cè)中的應(yīng)用情況進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。1spe檢測(cè)固定相SPE于20世紀(jì)70年代提出,至今已發(fā)展成為許多領(lǐng)域樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)模式,商品化程度很高。SPE的基本原理是基于樣品在固相(吸附劑)和液相(溶劑)之間的分配差異,其保留或洗脫的機(jī)制取決于待測(cè)物與吸附劑表面的活性基團(tuán),以及待測(cè)物與液相之間的分子間作用力。SPE有兩種洗脫模式,一種是待測(cè)物與固相之間的親和力比其與所存在的基質(zhì)間的親和力更強(qiáng),因而被保留,然后用一種對(duì)待測(cè)物親和力更強(qiáng)的溶劑洗脫;另一種是待測(cè)物與其所存在的基質(zhì)間的親和力較之與固相之間親和力更強(qiáng),則待測(cè)物被直接洗脫。通常使用的是前一種洗脫方式。現(xiàn)代SPE方法采用長(zhǎng)約2~3cm的聚丙烯小柱,內(nèi)裝各種填料。除了經(jīng)典的柱管式SPE外,圓盤式SPE的使用也日漸廣泛。SPE的填料種類繁多,包括吸附型填料、化學(xué)鍵合相填料、離子交換劑、高分子聚合物等。除了這些與HPLC使用的固定相類似的填料外,限入性介質(zhì)、分子印跡聚合物正在成為固相萃取的新型固定相。SPE所需樣本量少,避免了乳化現(xiàn)象,回收率高,重現(xiàn)性好,而且便于自動(dòng)化操作。但SPE由于多采用商品化小柱,價(jià)格較為昂貴。SPE在中藥活性成分提取和體液中中藥代謝物檢測(cè)方面已有很多應(yīng)用。徐筱杰研究小組以中藥活性成分為模板制備分子印跡聚合物,作為固相萃取填料,已成功地用于中草藥以及大鼠血漿中目標(biāo)化合物的分離提取。2spme萃取技術(shù)SPME是20世紀(jì)90年代初由加拿大Waterloo大學(xué)的Pawliszyn及其同事首先提出的。其裝置簡(jiǎn)單、操作方便,已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制,適用于現(xiàn)場(chǎng)分析。它采用的是一個(gè)類似氣相色譜微量進(jìn)樣器的萃取裝置(如圖1所示)。由一根涂布多聚物固定相的熔融石英纖維從液/氣態(tài)基質(zhì)中萃取待測(cè)物,并直接與氣相色譜或高效液相色譜聯(lián)用,在進(jìn)樣口(GC即為氣化室)將萃取的組分解吸附后進(jìn)行色譜分離檢測(cè)。SPME集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一身,極大地提高了分析速度。萃取模式可分為直接固相微萃取(Direct-SPME)和頂空固相微萃取(Headspace-SPME,HS-SPME)兩種。Direct-SPME將涂有高分子固相液膜的石英纖維直接伸入樣品基質(zhì)中進(jìn)行萃取,經(jīng)過一定時(shí)間達(dá)到分配平衡,即可取出進(jìn)行色譜分析,這種模式適用于氣體基質(zhì)或干凈的水基質(zhì);而HS-SPME則是將石英纖維放在樣品溶液上方進(jìn)行頂空萃取,避免了基質(zhì)的干擾,因此HS-SPME適合于任何基質(zhì),尤其是Direct-SPME無法處理的污水、油脂、血液、污泥、土壤等樣品。SPME技術(shù)目前應(yīng)用最活躍的領(lǐng)域是環(huán)境樣品、食品和臨床。在天然植物研究方面的應(yīng)用也有報(bào)道。Kim等用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用分析鑒定了馬鞭草屬植物中的14種芳香成分,比較了6種纖維涂層的萃取效率。Deng等將HS-SPME與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,分離、鑒定了中藥Schisandrachinensis(Turz.)Bail果實(shí)中的33種揮發(fā)性成分。采用了聚二甲基硅氧烷和聚乙二醇-二乙烯基苯兩種不同的纖維來吸附揮發(fā)性成分。他們還將HS-SPME法與水蒸氣蒸餾法進(jìn)行了對(duì)比,二者結(jié)果相似。技術(shù)上,SPME已由初期的與GC聯(lián)用發(fā)展到與HPLC聯(lián)用,溶劑解吸取代了SPME-GC的熱解吸,因此適用范圍更為廣泛。3從植物凈化方面的應(yīng)用超臨界流體(SF)是指溫度與壓力均在其臨界點(diǎn)之上的流體。在研究過的超臨界流體體系中,CO2因其價(jià)格低廉且無毒,應(yīng)用最為廣泛。超臨界流體同時(shí)表現(xiàn)出液體與氣體的優(yōu)點(diǎn),既有與液體相近的密度,又有與氣體相近的粘度及高的擴(kuò)散系數(shù)。因此具有很高的溶解能力和良好的流動(dòng)、傳遞性能,可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有毒、易揮發(fā)、易燃的有機(jī)溶劑。從20世紀(jì)60年代Zosel第一次提出用SFE技術(shù)萃取咖啡豆中的咖啡因并使之工業(yè)化以來,SFE作為一種新型分離技術(shù)引起了世人關(guān)注,但它在分析化學(xué)領(lǐng)域的全面應(yīng)用是在20世紀(jì)80年代末。該技術(shù)操作溫度低,溶劑為化學(xué)惰性,不會(huì)引起熱敏性物質(zhì)的分解變質(zhì),使用的有毒溶劑少,從而減少了化學(xué)藥品對(duì)萃取成分的污染。由于天然藥物熱敏性高,易氧化,SFE內(nèi)在的特征決定了它是從植物材料中萃取天然藥物的理想方法。實(shí)際應(yīng)用證明它耗時(shí)短,選擇性好,易于與多種分析儀器聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。而且超臨界流體(SF)的溶解力可隨壓力和溫度變化,這種可變的溶解力為選擇性萃取提供了可能,這對(duì)基體復(fù)雜的天然產(chǎn)物樣品尤為重要。SFE已用于從天然植物中提取揮發(fā)油、萜類、生物堿、黃酮類及木質(zhì)素類化合物。4微波萃取技術(shù)的特點(diǎn)MAE是將樣品置于不吸收微波的容器中,用微波加熱,進(jìn)行萃取。1986年,Ganzler首先報(bào)道了利用微波萃取從土壤、種子、食品、飼料中分離各種類型的化合物。與傳統(tǒng)萃取方法相比,MAE具有如下特點(diǎn):(1)萃取時(shí)間短,用己烷萃取薄菏葉時(shí),用索氏提取需6h以上才能達(dá)到用MAE萃取20s對(duì)葉面腺體的破壞程度;(2)溶劑用量少;(3)可根據(jù)吸收微波能力的大小選擇不同的萃取溶劑,控制樣品與溶劑間的熱交換;(4)可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的同時(shí)萃取。近年發(fā)展起來的動(dòng)態(tài)MAE可在萃取進(jìn)行過程中隨時(shí)引入新鮮溶劑,萃取效率更高,導(dǎo)出的萃取液可直接進(jìn)行SPE萃取或HPLC檢測(cè),裝置易于自動(dòng)化。運(yùn)用微波萃取技術(shù)提取天然藥物的化學(xué)成分具有很高的實(shí)用價(jià)值,有待開展多方面的深入研究?，F(xiàn)在,利用微波萃取技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)中藥提取技術(shù)進(jìn)行改革,提高天然藥物中有效成分的提取率,降低生產(chǎn)成本,提高質(zhì)量,改善生產(chǎn)條件等,已經(jīng)受到科技工作者的廣泛關(guān)注。例如,Mattina等利用微波萃取法從紅豆杉中提取紫杉醇,Pan等利用微波萃取法從丹參中提取丹參酮都取得了很好的效果。5高溫、高壓條件下萃取PLE也被稱作加速溶劑萃取(Acceleratedsolventextraction,ASE)。PLE是將樣品放在密封容器中,加熱到高于溶劑沸點(diǎn)的溫度(通常50~200℃),引起容器中壓力升高,同時(shí)給予一定壓力使溶劑不氣化,從而大大提高萃取速度。PLE實(shí)現(xiàn)了高溫、高壓條件下的萃取。高溫比室溫具有如下優(yōu)勢(shì):增加待測(cè)物的溶解度,增加擴(kuò)散速度,降低溶質(zhì)與基質(zhì)活性位點(diǎn)間的相互作用,降低溶劑的粘度,降低溶劑與基質(zhì)間的表面張力等。高壓可以使溶劑保持液態(tài),并迫使溶劑進(jìn)入常壓下無法接觸到的基質(zhì)內(nèi)部。PLE的優(yōu)點(diǎn)在于:溶劑用量少,萃取時(shí)間短,回收率、精度與索氏提取相當(dāng)。PLE在天然植物藥活性成分提取中的應(yīng)用最早開始于Benthin等人的工作,后來,PLE被相繼應(yīng)用于藥用植物中黃連素、紫杉醇、人參皂苷的提取。6亞臨界水萃取亞臨界水的介電常數(shù)ε隨溫度增加而減少,在250℃時(shí),ε值只有27(介于甲醇與乙醇之間),比常溫常壓下水的介電常數(shù)ε=80下降了許多。亞臨界水極性的減弱,使它對(duì)中等極性和非極性有機(jī)化合物的溶解度大大增加。1994年,Hawthorne等人根據(jù)亞臨界水的上述性質(zhì)制作了一套亞臨界水萃取裝置,該裝置由4部分組成:高壓注射泵,加熱柱箱,萃取柱,接收裝置。接收裝置可分為3類,即液液萃取,固相萃取和固相微萃取接收裝置。利用亞臨界水萃取中草藥的有效成分比用有機(jī)溶劑提取更接近于實(shí)際(傳統(tǒng)的方法是用水煎煮中草藥)。亞臨界水萃取還可通過調(diào)節(jié)溫度來提取不同種類的成分。Castro小組報(bào)道了用亞臨界水萃取藥用植物小茴香的精油,國(guó)內(nèi)學(xué)者徐志宏等則用亞臨界水萃取了丹參中的脂溶性成分以及黃芩中的黃芩苷。該法快速、有效,可通過改變萃取參量選擇萃取成分,并可用于藥物生產(chǎn)自動(dòng)化。7動(dòng)態(tài)lpme-gc分析1997年Jeannot小組和He小組提出LPME技術(shù),將有機(jī)液滴掛在氣相色譜(GC)微量進(jìn)樣器針頭上對(duì)物質(zhì)進(jìn)行萃取。微量進(jìn)樣器既用作GC進(jìn)樣器,又用作微量分液漏斗。LPME分動(dòng)態(tài)和靜態(tài)兩種,靜態(tài)LPME是用10μL微量進(jìn)樣器抽取1μL溶劑,浸入到水樣中,水樣中有機(jī)物通過擴(kuò)散作用分配到有機(jī)溶劑中,一定時(shí)間后,將溶劑抽回進(jìn)樣器中,進(jìn)行GC分析。與靜態(tài)LPME操作不同,動(dòng)態(tài)LPME用微量進(jìn)樣器抽取1μL溶劑,將微量進(jìn)樣器浸入到水樣中,抽取3μL水樣進(jìn)入進(jìn)樣器中,停留一定時(shí)間,推出3μL水樣,如此反復(fù),取有機(jī)溶劑進(jìn)行GC分析。與動(dòng)態(tài)LPME相比,靜態(tài)LPME重復(fù)性較好,但富集倍數(shù)小,萃取時(shí)間長(zhǎng)。動(dòng)態(tài)LPME的重復(fù)性差,有待用自動(dòng)微量進(jìn)樣器來克服。動(dòng)態(tài)LPME所用微量進(jìn)樣器成本低,方法簡(jiǎn)單,有望替代靜態(tài)LPME。但靜態(tài)LPME可用于頂空方法。關(guān)于LPME在中藥研究中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。8u3000cpe法CPE是近年來出現(xiàn)的一種新興的液-液萃取技術(shù),它以表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ),通過改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離,從而將目標(biāo)化合物與基質(zhì)分開。一個(gè)均一的表面活性劑水溶液在外界條件(如溫度)變化時(shí),因?yàn)橐l(fā)相分離而突然出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象叫濁點(diǎn)現(xiàn)象,此時(shí)的溫度叫做濁點(diǎn)溫度。靜置一段時(shí)間(或離心)后會(huì)形成兩個(gè)透明的液相:一為表面活性劑相;另一為水相。若外界條件(如溫度)向相反方向變化,兩相便消失,再次成為均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物質(zhì)與表面活性劑的疏水基團(tuán)結(jié)合,被萃取進(jìn)表面活性劑相,親水性物質(zhì)留在水相,這種利用濁點(diǎn)現(xiàn)象使樣品中疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離的萃取方法就是濁點(diǎn)萃取。圖2顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現(xiàn)象。CPE法具有如下優(yōu)點(diǎn):操作步驟簡(jiǎn)單,無須使用專門儀器;應(yīng)用范圍廣,萃取效率高;不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑,經(jīng)濟(jì),安全,不影響環(huán)境;具有生物活性的化合物在萃取過程中不易變性;表面活性劑易于處理;作為分離純化方法,易于大規(guī)模生產(chǎn);作為樣品前處理方法可與高效液相色譜(HPLC)、流動(dòng)注射分析(FIA)、毛細(xì)管電泳(CE)等后序儀器分析方法聯(lián)用。目前,該法已成功地應(yīng)用于金屬螯合物、生物大分子的分離與純化及金屬離子檢測(cè)[66,67,68,69,70,71]、環(huán)境中有機(jī)污染物檢測(cè)的樣品預(yù)處理中。在天然植物活性成分提取方面也有報(bào)道。Huie等報(bào)道了采用濁點(diǎn)萃取法從西洋參中萃取人參皂苷等化合物。9含