《基因工程》-考試重點總結(jié)

?基因工程?考試重點總結(jié)基因工程概述第一節(jié)基因操作與基因工程基因操作〔genemanipulation〕：指對基因進行別離、分析、改造、檢測、表達、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱?；蚬こ獭瞘eneengineering〕：通過工具酶，在體外將目的基因、基因片段或其它DNA元件進行切割，與適當(dāng)?shù)妮d體進行連接和重組，導(dǎo)入相應(yīng)受體細胞，并使外源基因進行復(fù)制和表達，定向改造受體生物性狀或獲得表達產(chǎn)物?；虿僮髋c基因工程的關(guān)系：基因操作的核心是基因重組〔generecombination〕技術(shù)，基因工程是基因操作、基因重組的核心內(nèi)容和主要目的?；蚬こ痰倪z傳學(xué)效果：受體生物發(fā)生遺傳信息或遺傳性狀的變化并能穩(wěn)定遺傳給下一代。第二節(jié)基因工程是生物科學(xué)開展的必然產(chǎn)物基因是基因重組的物質(zhì)根底遺傳因子、基因：是遺傳信息的根本單位。從物質(zhì)結(jié)構(gòu)上看，基因是染色體組核酸分子?；颉瞘ene〕是作為遺傳物質(zhì)的核酸分子上的一段片段并具有遺傳學(xué)功能，可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色體上，也可存在于染色體之外〔如質(zhì)粒、噬菌體等〕?；蚬こ痰睦碚摳祝孩?明確了遺傳信息的攜帶者—基因的載體是DNA，明確了遺傳的物質(zhì)根底。⑵.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保存復(fù)制模型得以說明，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題。⑶.中心法那么、操縱子學(xué)說的提出以及遺傳密碼子的破譯，解決了遺傳信息的流向和表達問題。(4).遺傳物質(zhì)根底和中心法那么的通用性決定了基因工程原理和技術(shù)在生物界普遍適用，尤其是可以實現(xiàn)跨越任何物種界限的遺傳成分轉(zhuǎn)移。自此，從理論上講，基因工程已有可能成為現(xiàn)實基因工程的技術(shù)根底：⑴.DNA體外切割和連接技術(shù)〔限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，標(biāo)志著DNA重組時代的開始〕。⑵.克隆載體的開展與應(yīng)用。⑶.大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立。⑷.瓊脂糖電泳技術(shù)的應(yīng)用。⑸.DNA測序技術(shù)的應(yīng)用。⑹.核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用。從技術(shù)上為基因工程的誕生奠定了根底。四、基因工程的內(nèi)容1、基因操作原理：〔1〕DNA和RNA的操作。〔2〕基因克隆與功能研究?！?〕基因組學(xué)與生物信息學(xué)的應(yīng)用。2、基因工程的應(yīng)用：〔1〕生物反響器〔bioreactor〕：大規(guī)模生產(chǎn)生物活性分子如生長激素、胰島素等?！?〕遺傳改進〔geneticimprovement〕、分子育種〔molecularbreeding〕、設(shè)計構(gòu)建新物種?！?〕基因治療〔genetherapy〕：人體轉(zhuǎn)基因或基因組編輯。第三節(jié)基因的結(jié)構(gòu)——基因操作的理論根底一、基因的結(jié)構(gòu)組成對基因操作的影響1、基因及其產(chǎn)物的共線性：一個基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列一一對應(yīng)。N個氨基酸=3N個編碼堿基。2、基因及其產(chǎn)物的非共線性。間斷基因。內(nèi)含子〔intron〕是指真核基因在RNA加工過程中從原初轉(zhuǎn)錄本中剪去而不進入成熟RNA結(jié)構(gòu)、不具有氨基酸編碼能力的一段序列。外顯子〔exon〕：是真核基因轉(zhuǎn)錄本中剪去內(nèi)含子后所保存的RNA片段，它們拼接并進行適當(dāng)修飾后成為成熟RNA并執(zhí)行相應(yīng)功能。3、基因的重疊性與可變性：基因的重疊性：單個DNA序列可編碼一個以上的蛋白質(zhì)，它們在結(jié)構(gòu)上可以具有序列重復(fù)性，也可以是相互完全不同的全新蛋白質(zhì)。原因：可變性轉(zhuǎn)錄起始位點、可變性起始位密碼子、可變性編碼終止位點、可變性剪接。開放讀碼框〔openreadingframe，ORF〕：成熟mRNA中從起始密碼子ATG至終止密碼子〔TAA、TAG或TGA之一〕之間形成的一個連續(xù)的氨基酸編碼區(qū)間。以起始密碼子的第1個堿基作為+1，其5’方向的第1個堿基為-1。4、啟動子和終止子啟動子〔promoter〕：基因轉(zhuǎn)錄過程中控制起始的部位，通常是位于轉(zhuǎn)錄起始位點5’上游的一段DNA區(qū)間，其上有許多順式元件。轉(zhuǎn)錄起始位點〔transcriptionstartsite〕：起始轉(zhuǎn)錄的第一個堿基，也是摻入到RNA中的第1個堿基。在轉(zhuǎn)錄研究中記為+1，其5’方向的第1個堿基〔已屬于啟動子而非轉(zhuǎn)錄區(qū)〕為-1。側(cè)翼序列〔flankingsequence〕：一條核酸單鏈上位于某一特定位置的5’或3’方向的序列。上游〔upstream〕：一條核酸單鏈上位于某一堿基的5’方向。下游〔downstream〕：一條核酸單鏈上位于某一堿基的3’方向。終止子〔terminator〕：位于基因的3’部位、終止基因轉(zhuǎn)錄過程的一段DNA區(qū)間。有依賴不依賴ρ因子兩種。核糖體結(jié)合位點〔ribosomalbindingsite,RBS〕：位于mRNA起始密碼子及其正上游的一段區(qū)間，是核糖體結(jié)合并起始翻譯過程的位點。原核和真核的RBS顯著不同。轉(zhuǎn)錄單位〔transcriptionunit〕/轉(zhuǎn)錄本〔transcript〕：從轉(zhuǎn)錄起始位點直至轉(zhuǎn)錄的最后一個堿基之間被轉(zhuǎn)錄的RNA序列，可以包含一或多個蛋白編碼框。亞克隆〔subcloning〕：1、將大片段克隆子的DNA重新打斷成小片段，然后分別克隆到新的載體中，供進一步研究。初步克隆中的外源片段往往較長，含有許多目的基因片段以外的DNA片段，在諸如表達序列分析和突變等操作中不便進行，因此必須將目的基因所對應(yīng)的一小段DNA找出來，這個過程叫“亞克隆〞。2、通指將DNA片段從一個載體穿梭克隆到另一個載體的過程。亞克隆技術(shù)：泛指實驗室中以DNA在大腸桿菌中經(jīng)典克隆操作為核心的根本技術(shù)體系。分子克隆工具酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶一、限制與修飾1、限制與修飾現(xiàn)象：限制(restriction)：指一定類型的細菌可以通過限制性內(nèi)切酶〔restrictionednonuclease〕的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主范圍受到限制。限制作用實際就是限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶〔methylase〕的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用宿主細胞通過甲基化作用到達識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。甲基化作用：最主要的堿基修飾，使腺嘌呤A成為N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成為5’-甲基胞嘧啶。限制酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸水解酶。限制酶存在于細菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中沒有限制酶。3.限制性核酸內(nèi)切酶的種類據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。Ⅱ型限制酶用途大，多為同源二聚體，其中切口酶只在單鏈上產(chǎn)生切口，Ⅱs型識別序列和切割位置特殊。二、限制酶識別的序列1、限制酶識別序列的長度(n)：一般為4-8個堿基對，最常見為6bp。識別位點出現(xiàn)頻率：4n2、限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)：多數(shù)為回文結(jié)構(gòu)〔palindrome〕即鏡像對稱結(jié)構(gòu)。一些酶可識別多種結(jié)構(gòu)尤其是允許一些堿基是簡并的，還有一些酶識別序列呈間斷對稱，即回文對稱序列之間可以間隔一定長度的任意堿基。3、限制酶的切割位置：多數(shù)在識別序列內(nèi)部，也有在外部、兩端、兩側(cè)或單側(cè)的。三、Ⅱ限制酶的功能和產(chǎn)生的末端類型Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶有嚴格的識別、切割順序，它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH，識別序列一般為4～6個堿基對，通常是反向重復(fù)順序，具有180°的旋轉(zhuǎn)對稱性，即回文結(jié)構(gòu)。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的酶活性〔稱為PI-prefix〕。它們識別序列很長，核心識別序列一般為10-12bp，識別位點極少。四、DNA末端長度對限制酶切割效率的影響限制性核酸內(nèi)切酶識別和切割靶序列時需要識別序列兩側(cè)具有一定長度的DNA，否那么會降低切割效率。對側(cè)翼長度敏感性較低的酶有EcoRⅠ等，只要一個側(cè)翼堿基即保證90%的效率。對側(cè)翼長度敏感性高的酶有AccⅠ、HindⅢ、PstⅠ等，側(cè)翼3個堿基以上也未必理想。設(shè)計引物、接頭等時要考慮適當(dāng)長度的保護堿基，載體構(gòu)建時多克隆位點中的相臨位置的酶的切割序列的選擇也很重要。限制酶的活性單位〔unit〕：1個單位的酶是指在建議的緩沖液及溫度下，在20μl反響液中反響1h，使1μgDNA〔多用λ〕完全消化所需要的酶的量。五、位點偏愛某些限制酶對同一底物中的不同位置的識別位點的切割效率不同，表現(xiàn)出偏愛性，這種現(xiàn)象稱作位點偏愛。某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點對酶的敏感性不同。λ噬菌體DNA為48502bp，兩端為12bp粘性末端。EcoRⅠ酶切割λ噬菌體中的5個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍；EcoRⅠ對腺病毒2DNA不同位置切點的切割速率也不同。由于位點偏愛性，λDNA用HindⅢ消化而制備的λHindⅢDNAmarker中4.3kb條帶甚至比2.0kb條帶還弱。原因：切割時需要同時與2個識別位點作用〔如NarⅠ等〕，或識別和切割時要求在DNA上有2個明顯不同的結(jié)合位點，其中1個是另1個的被切割時起激活作用的變構(gòu)位點。應(yīng)對方法：超量用酶、延長切割時間。七、限制酶的星活性(staractivity)在極端非標(biāo)準(zhǔn)反響條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識別序列不同但相似的序列，降低酶切反響的特異性，這種改變的特殊性稱為限制性核酸內(nèi)切酶的星活性。產(chǎn)生原因：①反響體系中甘油的濃度大于5%。②酶用量過大，大于100U/μgDNA。③低離子強度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有機劑如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價離子的存在。易發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。方法：對因改進。八、單鏈DNA的切割多數(shù)限制酶很難切割單DNA模板。局部限制酶除切割雙鏈DNA外，還可切割單DNA，但活性一般都不高。切口酶雖然識別雙鏈，但只在單鏈上切口，名稱前要加一個N。九、酶切位點的引入現(xiàn)代基因工程中通過引物化學(xué)合成等方式可以很方便進向目標(biāo)位置引入設(shè)計的酶切位點。通過不同酶切末端的連接重組也可產(chǎn)生新的酶切位點，對具體情況的分析在設(shè)計中有價值：5’突出末端補平后重連；同尾末端連接；平末端連接。十、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素①DNA樣品的純度DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性?？刹捎靡韵路椒?，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反響總體積延長反響時間②DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、Mbol等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影響。采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。十一、基因組中酶切位點分布的不均一性在基因組中酶切位點的分布并不是均一的。大腸桿菌中六堿基識別的酶SpeⅠ平均60kb才出現(xiàn)1次。酵母中重復(fù)序列以外富含GC的識別序列較少。哺乳動物基因組中CG序列只有隨機概率值的1/5，且多數(shù)發(fā)生胞嘧啶甲基化，SmaⅠ位平均約65kb才出現(xiàn)1次。果蠅和線蟲中CG基序雖然少，但不發(fā)生甲基化。限制性核酸內(nèi)切酶操作的考前須知①商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時應(yīng)使用新的吸頭去取酶，參加酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否那么酶液中的甘油濃度超過5%時將會抑制酶的活性。②整個操作應(yīng)在0℃進行，即在冰浴中進行，而且是在參加其它試劑之后，最后參加酶。③當(dāng)切割大量DNA時，通常采用延長反響時間，減少酶的用量。④當(dāng)DNA需2種或以上酶切時，應(yīng)用通用緩沖液，假設(shè)沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進行下一個酶切反響。⑤正確保存、分裝和取用限制酶，抽提高質(zhì)量的DNA。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途①在特異位點上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構(gòu)建基因文庫。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。第二節(jié)甲基化酶一、甲基化酶的種類原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶〔methylase〕，又稱甲基轉(zhuǎn)移酶〔methyltransferase〕，大腸桿菌中有3種。三、甲基化對限制酶切的影響1、修飾酶切位點：敏感的酶不能切開。2、產(chǎn)生新的酶切位點：為依賴于甲基化的限制酶創(chuàng)造切點。3、對基因組作圖的影響：哺乳動物具有較多的m5CG序列具有組織細胞特異性，而且一個細胞內(nèi)的m5CG甲基化不徹底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶作圖時具有可變性，對圖的穩(wěn)定性帶來影響。植物的基因組DNA的甲基化程度高，作圖時也要求選用對m5CG甲基化不敏感的限制酶。第三節(jié)DNA聚合酶DNA聚合酶〔DNApolymerase〕的主要活性是催化DNA的合成〔在具備模板、引物、dNTPs等情況下〕及其相輔的活性。真核生物有4種DNA聚合酶：α、β、γ、線粒體型。原核生物有3種DNA聚合酶：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。二、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)〔1〕Klenow酶的根本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’核酸外切酶活性。〔2〕Klenow酶的根本用途〔可被T4DNA聚合酶代替〕：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3′粘性凹陷末端抹平DNA的3′粘性凸出末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列三、T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)〔1〕T4DNA酶的根本特性：有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3的DNA聚合酶活性。在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切－在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸。－在四種dNTPs均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。四、T7噬菌體DNA聚合酶(T7phageDNApolymerase)持續(xù)合成能力最強有3’→5’外切酶活性是Klenow酶的1000。可代替T7噬菌體DNA聚合酶的用途。五、耐熱性的DNA聚合酶〔第八章詳講〕來自噬高溫細菌，如Taq、Pfu等。高溫下具有5’→3’DNA聚合酶活性，一般在72℃最理想。有5’→3’外切酶活性。具3’→5’外切酶活性者具校正〔proofreading〕功能，如Pfu。否那么無校正功能，如Taq。用于PCR擴增。反轉(zhuǎn)錄酶：是依賴于RNA的DNA聚合酶，以RNA為模板聚合cDNA鏈，具有5′→3′的DNA聚合酶活性、5′→3′的RNA外切核酸酶活性和RNaseH活性，但缺乏3′→5′RNA外切核酸酶活性，所以反轉(zhuǎn)錄過程中無校正功能。末端轉(zhuǎn)移酶：是不依賴于模板的DNA聚合酶，催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端?？僧a(chǎn)生同源多聚尾用于連接、引物退火，也可用于末端標(biāo)記。第四節(jié)其它分子克隆工具酶一、依賴于DNA的RNA聚合酶依賴于DNA的RNA聚合酶ATP〔DNAdependentRNApolymerase〕包括SP6噬菌體和T4噬菌體RNA聚合酶?；钚裕恨D(zhuǎn)錄活性，無需引物，但識別特異啟動子序列。用途：體外合成RNA分子作探針等。用于表達外源基因的mRNA，然后用于翻譯蛋白。二、DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸根和3′-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反響需要供應(yīng)能量，大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶那么以ATP作為能量來源。1、T4DNA連接酶的作用機制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3′羥基形成3’,5’-磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。3、平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接那么屬于分子間的連接，因此后者反響速度要慢的多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量〔10倍大于粘性末端的連接〕。加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞時機。參加10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用。參加單價陽離子〔NaCl〕,最終濃度150-200mmol/L。基因工程載體一、根本概念利用重組DNA技術(shù)別離目的基因，稱之為基因克隆(genecloning)?？寺?clone)：作物動詞時是指從單一祖先產(chǎn)生同一的DNA分子群體或細胞群體的過程，作名詞時指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊群體?；蛭膸?genelibrary)：由大量的含有基因組DNA的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體。載體(vector)：在基因工程中，攜帶著目的基因或DNA片段進入宿主細胞進行擴增或表達的工具DNA分子。分類按載體功能分：克隆載體、表達載體按載體性質(zhì)分：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、人工染色體表達體系 載體 宿主原核生物表達體系 質(zhì)粒、噬菌體 細菌酵母表達體系 大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒 酵母轉(zhuǎn)基因植物體系 大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭載體〔Ti質(zhì)?！?、病毒等 植株哺乳細胞表達體系 大腸桿菌-病毒穿梭載體、脂質(zhì)體等 培養(yǎng)動物細胞基因直接導(dǎo)入 DNA本身〔基因槍微粒轟擊法、注射法等〕 生殖細胞、體細胞、個體三、基因工程載體必須具備的條件：※〔1〕有復(fù)制起點※〔2〕具有假設(shè)干個限制性內(nèi)切酶的單一識別位點※〔3〕具備適宜的篩選標(biāo)記※〔4〕具備適宜的拷貝數(shù)目〔5〕分子量要相對較小〔6〕在細胞內(nèi)穩(wěn)定性要高〔7〕易別離純化※表示載體必須具備的條件第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒(plasmid)的根本特性Plasmid獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。質(zhì)粒是細菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。質(zhì)粒DNA多呈超螺旋的共價閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)，大小為1-200kb，可以持續(xù)穩(wěn)定地處于游離狀態(tài)，但一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此應(yīng)用廣泛。1、質(zhì)粒的復(fù)制：由復(fù)制子(ori，復(fù)制起始區(qū)及與此相關(guān)的順式作用元件)決定。質(zhì)粒復(fù)制的機理請見教材。2、質(zhì)粒的拷貝數(shù)：根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復(fù)制質(zhì)?！部截悢?shù)少，為1-5個〕與松弛型復(fù)制質(zhì)?！部截悢?shù)多，可達10-200個拷貝〕。作為載體的質(zhì)粒一般應(yīng)該是松弛型的。拷貝數(shù)是由復(fù)制起始點的類型決定的，如pMB1或ColE1。pUC系列載體中的突變型pMB1復(fù)制子可達500-700個拷貝。3、質(zhì)粒的不親和性(incompatibility)：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。涉及細胞分裂過程中的競爭性選擇。不相容群。4、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：自然條件下質(zhì)?？赏ㄟ^細菌的接合(conjugation)的作用而轉(zhuǎn)移到新的宿主細胞中。三親雜交法。質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件：1有特定的復(fù)制起始子。2有多種限制性內(nèi)切酶切點，但每種切口最好只有1個；2有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍白斑試驗；3有一定容量；4有相當(dāng)?shù)目截悢?shù)，即每個宿主菌可能容納的最多數(shù)。二、標(biāo)記基因1、轉(zhuǎn)化子標(biāo)記基因：用于鑒別目的DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。Ampr〔氨芐青霉素抗性基因〕：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)。Tetr〔四環(huán)素抗性基因〕：阻止四環(huán)素進入細胞。Cmr〔氯霉素抗性基因〕：編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Kanr〔卡那霉素抗性基因〕：編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶。supF〔琥珀突變抑制基因〕：編碼細菌抑制性tRNA，可翻譯UAG為酪氨酸。赭石突變〔UAA〕，乳白突變〔UGA〕。正向選擇標(biāo)記：蔗糖致死基因sacB。2、重組子標(biāo)記基因：用于將重組子與非重子區(qū)別開來。α-互補(αcomplementation)：人工突變使大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而載體那么攜帶有LacZ基因的N-端140個氨基酸和編碼區(qū)段(lacZ’)，二者單獨存在時均無功能，但共存于一個大腸桿菌細胞時那么發(fā)生功能互補，形成具有完全活性的LacZ酶。多克隆位點(multiplecloningsite，MCS)：載體上的一段人工設(shè)計和人工合成的DNA序列，含有多個在該載體唯一的限制性內(nèi)切酶的切點，以方便載體與外源片段的重組。插入失活(insretionalinactivation)：當(dāng)一段足夠長的外源DNA片段插入到一個功能基因的編碼區(qū)后，導(dǎo)致ORF移碼或提前終止，嚴重破壞原基因的編碼能力而使該基因失活。藍白斑篩選(white-bluescreening)：空載體轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，由于α-互補而形成的功能性的LacZ蛋白，能夠轉(zhuǎn)化無色底物X-gal而形成深藍色的產(chǎn)物，使菌落或噬菌斑顯藍色(藍斑)；重組載體的轉(zhuǎn)化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互補，在IPTG+X-gal條件下菌落或噬菌斑不顯藍色(白斑)；通過菌落或噬菌斑的藍/白色差異而到達篩選鑒定出重組子與非重組子的目的。三、質(zhì)粒載體的種類質(zhì)粒的開展階段第一階段〔1977年前〕：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量〔降低載體長度〕，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3、T7、SP6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。許多實用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的根底上改建而成含LacZ基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker。pUC18與pUC19只是多克隆位點的排列方向相反，其余一致。表達載體：一般是在克隆的載體上添加和完善了用于外源基因表達的一些根本元件，如強啟動子、蛋白純化標(biāo)簽、信號肽、誘導(dǎo)表達元件等。如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。λ噬菌體載體一、λ噬菌體的分子生物學(xué)λ噬菌體的組成結(jié)構(gòu)和用途噬菌體是比細菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細胞一樣，噬菌體侵犯細菌，也可以認為它是細菌里的“寄生蟲〞。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內(nèi)。λ噬菌體為線性雙鏈DNA的細菌病毒，具有互補的12bp粘性末端，感染細菌后粘端互補成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個基因。λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：結(jié)構(gòu)區(qū)：A～J19個基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū)。組區(qū)att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。調(diào)控區(qū)啟動子、終止子和N、CI基因。裂解區(qū)：Q-R。λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達20kb的λDNA，換入相應(yīng)長度的目的基因?；蛭膸鞓?gòu)建常使用λ載體。不少先進的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進行構(gòu)建。四、λ載體的克隆原理和步驟1、通過裂解過程增殖λ載體。2、載體與外源DNA的酶切。載體一般要純化左路、右臂，并進行去磷酸化處理。3、外源DNA與載體的連接，形成的是多聯(lián)體。4、重組噬菌體的體外包裝，需要單獨制備衣殼蛋白，包裝過程對DNA大小有選擇性。5、包裝后的噬菌體顆粒感染大腸桿菌，經(jīng)過λ的復(fù)制、包裝和裂解過程，重組載體得到擴增，一個λ的感染和擴增會導(dǎo)致它周圍一圈范圍內(nèi)的大腸桿菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。6、篩選。每個噬菌斑代表了一個重組λ，所有噬菌斑的集合就為一個文庫。pfu:plaqueformingunit，噬菌斑形成單位，指每微克包裝λDNA感染大腸桿菌后形成的噬菌斑數(shù)，要求100萬以上。第四章人工染色體載體第一節(jié)粘粒載體一、粘粒的結(jié)構(gòu)特征和用途粘粒實際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。cos序列是l噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點、抗性標(biāo)記、cos位點，因而能像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般5-7kb左右，用來克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可達45kb。有的粘粒載體含有兩個cos位點，在某種程度上可提高使用效率。二、粘粒載體的工作原理粘粒載體的主要工作原理類似l噬菌體載體。在外源片段與載體連接時，粘粒載體相當(dāng)于l噬菌體載體的左右臂，cos位點通過粘段退火后，再于外源片段相間連接成多聯(lián)體。當(dāng)多聯(lián)體與l噬菌體包裝的蛋白質(zhì)混合時l噬菌體A基因蛋白的末端酶功能將切割成兩個cos位點，并將兩個同方cos位點之間的片段包裝到l噬菌體顆粒中去。允許插入片段為30-45kb。三、粘?？寺≥d體粘粒pJB8、含雙cos位點的粘粒載體、pcos1EMBL等。四、粘粒載體文庫的擴增和貯存噬菌體顆粒狀的粘粒文庫在含有幾滴氯仿的SM溶液中可以保存幾周?？梢圆捎糜坝〉较跛崂w維素膜上保存、挑取所有菌落混合培養(yǎng)后深冷保存，等。第二節(jié)酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體〔yeastartificialchromosome，YAC〕：就是模擬酵母菌染色體的復(fù)制而構(gòu)建的載體。一、YAC載體的復(fù)制元件YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成成分，騎在酵母中復(fù)制的必須元件包括復(fù)制起點序列即自主復(fù)制序列、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒和兩個端粒。這些元件能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細胞間的別離及保持染色體穩(wěn)定的需要。端粒重復(fù)序列：是定位于染色體末端的一段序列，用于保護線狀DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，已形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒：是有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中。在YAC中起到保證一個細胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。二、YAC載體的工作原理YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別是用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。圖示是pYAC4載體的遺傳結(jié)構(gòu)圖，當(dāng)用BamHⅠ切割成現(xiàn)狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動染色體的復(fù)制和分配，從而決定著個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的DNA片段。允許插入片段大?。簺]有限制，一般為250-1500kb。YAC的缺點：插入片段容易出現(xiàn)缺失和重排現(xiàn)象，YAC與酵母染色體大小相似不容易別離和純化。YAC的優(yōu)點：酵母細胞比大腸桿菌對不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA片段有更強的容忍性，文庫的代表性強，適合作真核染色體片段功能研究。第三節(jié)細菌人工染色體載體細菌人工染色體載體〔bacterialartificialchromosome，BAC〕：就是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷貝質(zhì)粒載體。F質(zhì)粒：是一個約100kb的質(zhì)粒，編碼60多種參與復(fù)制、分配和結(jié)合過程的蛋白質(zhì)。BAC載體及其結(jié)構(gòu)組成BAC載體大小約7.5kb，其本質(zhì)是一個質(zhì)?？寺≥d體。BAC載體與常見克隆載體的核心區(qū)別在于其復(fù)制單元的特殊性。復(fù)制單元來自F質(zhì)粒二、BAC載體工作原理BAC載體的工作原理與常規(guī)的質(zhì)?？寺≥d體相似。不同的是，BAC載體裝載的是大片段DNA，一般在100～300kb。對如此大的DNA片段一般要通過脈沖場凝膠電泳來別離。另外，由于BAC載體的拷貝數(shù)小，制備難度大。為解決這個問題，有的學(xué)者將BAC載體作為外源片段克隆到常規(guī)高拷貝質(zhì)粒載體上，從而在大腸桿菌中以多拷貝的形式復(fù)制，便于載體的制備，使用時將高拷貝質(zhì)粒去掉。第四節(jié)P1噬菌體載體和P1人工染色體載體一、P1噬菌體的分子特征：雙鏈線狀DNA，110kb，末端具有10kb左右冗余序列，感染進入大腸桿菌后冗余序列發(fā)生重組，形成環(huán)狀分子，cⅠ決定進入溶原或裂解狀態(tài)。包裝方式與λ不同。二、P1噬菌體載體元件：復(fù)制元件、環(huán)化和包裝信號、標(biāo)記基因、克隆位點、填充片段。P1噬菌體載體工作原理：與粘粒相似。三、P1人工染色體載體：結(jié)合了P1噬菌體載體和BAC載體的最正確特性，如pCYPAC1，允許外源片段為130-150kb，采用電轉(zhuǎn)化，外源片段的嵌合和重組現(xiàn)象較低，對重組序列的回文結(jié)構(gòu)的忍受性強。第五章表達載體第一節(jié)大腸桿菌表達載體一、大腸桿菌表達載體的結(jié)構(gòu)原核表達載體：適用于在原核細胞中表達外源基因的載體。均是質(zhì)粒載體，首先必然滿足克隆載體的根本要求，然后增加表達元件。1、表達元件(expressionelements)：1〕啟動子(promoter)：三類，即lac啟動子、trp啟動子和它們的雜合啟動子tac或trc，都受IPTG誘導(dǎo)。T7噬菌體啟動子λ噬菌體的PL啟動子。2〕終止子：依賴于ρ因子或不依賴于ρ因子〔遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止〕。3〕核糖體結(jié)合位點(ribosomebindingside,RBS)：Shine-Dalgarno(SD)序列，ATG與RBS之間的距離很重要，一般3-11bp。2、表達形式完整單一蛋白：單一基因的編碼區(qū)表達。融合蛋白(fusionprotein)：多個基因的編碼區(qū)的串聯(lián)體，但構(gòu)成一個整體的單一ORF，如果融合標(biāo)簽蛋白有利于蛋白的定向、純化，如果融合多個目標(biāo)蛋白，那么類似于直接表達了一個多酶復(fù)合體一樣，可減少載體構(gòu)建難度，而且可以偶連兩個或多個相關(guān)基因的表達。3、表達的控制誘導(dǎo)表達系統(tǒng)：IPTG防滲漏表達系統(tǒng)：lacIqPL啟動子受cⅠ的調(diào)控，低溫(30℃)下阻抑轉(zhuǎn)錄，高溫(40-45℃)下解除抑制。4、分泌表達載體：產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙，可防止受細胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使其正確折疊，或去除N-端甲硫氨酸，以維護活性。信號肽(signalpeptide)有堿性磷酸酶信號肽、蛋白質(zhì)A信號肽〔如Amersham公司的pEZZ18系統(tǒng)〕。四、表達產(chǎn)物的純化1、包涵體(inclusionbody)的純化：許多情況下表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)形成不溶的顆粒狀包涵體，可通過機械法、凍融法、超聲波處理等破碎細胞，離心收集包涵體，洗滌去除雜蛋白，用鹽酸胍、尿素和SDS溶解包涵體，再通過一定的法使蛋白質(zhì)折疊。有的經(jīng)上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵體后就沒有活性了，但可作為抗原。2、可溶性蛋白的純化：表達的蛋白可以細胞內(nèi)呈可溶狀態(tài)，也有少量進入細胞周質(zhì)區(qū)。將細胞裂解物的上清局部用于純化目標(biāo)蛋白，甚至可直接作為粗酶液進行生化反響。第二節(jié)穿梭載體**穿梭載體(shuttlevector)：能夠在兩類不同的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，主要是質(zhì)粒，它們至少有兩套復(fù)制單元和兩套選擇標(biāo)記，相當(dāng)于兩個載體的聯(lián)合。只要涉及大腸桿菌以外的細胞，絕大多數(shù)載體都裝有大腸桿菌質(zhì)粒載體的根本元件，都可看作穿梭載體。一、大腸桿菌/革蘭氏陽性菌穿梭載體：如向枯草芽孢桿菌的穿梭。二、大腸桿菌/酵母菌穿梭載體：主要用于遺傳學(xué)和真核表達研究，尤其是當(dāng)?shù)鞍仔枰M行真核修飾時，如磷酸化、糖基化等。三、其它穿梭載體：如動物病毒載體、植物轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒、昆蟲桿狀病毒等，更為復(fù)雜一些。第三節(jié)整合載體整合載體(integrationvector)：用于將某個基因或某些基因插入到宿主的染色體中去工作，按整合方式可分為定點整合和隨機整合兩類，按作用可分為目的基因的插入/敲除或隨機突變體庫的構(gòu)建。一、基因插入/基因敲除同源重組整合載體最為常用，不僅含有大腸桿菌克隆載體的骨架，還有一段便于同源重組的重組DNA片段。二、隨機插入突變載體用于功能基因組研究中基因突變材料的創(chuàng)造。隨機突變體庫是指標(biāo)記基因在載體的攜帶下通過DNA重組事件隨機插入到基因組中而形成的眾多基因突變體的集合。1、微生物插入突變體庫：如pEG922，需要借助轉(zhuǎn)座子。2、構(gòu)建植物突變體庫所用的載體：根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的T-DNA插入或植物轉(zhuǎn)座子(transposon)標(biāo)簽是植物基因功能研究中常用的產(chǎn)生突變體的方法1〕T-DNA插入突變體：植物轉(zhuǎn)基因過程中T-DNA區(qū)段如果插入到一個功能基因中，會導(dǎo)致該基因插入失活而產(chǎn)生性狀變化，形成突變體。還可以在T-DNA區(qū)段構(gòu)建基因激活標(biāo)簽、基因陷阱(genetrap)、啟動子陷阱(promotertrap)或增強子陷阱(enhancertrap)，用于直接克隆靶基因編碼區(qū)、啟動子、增強子等。對于突變基因，只需要采用反向PCR或錨定PCR擴增或通過篩選文庫，就可以直接克隆得到其序列。2〕植物Ac-Ds轉(zhuǎn)座子雙因子插入突變：玉米Ac(activator)因子是一個轉(zhuǎn)座子，含有完整的轉(zhuǎn)座酶，Ds(dissociation)是Ac缺失轉(zhuǎn)座酶基因的缺失體，但具兩端的反向重復(fù)序列。分別構(gòu)建含Ac和Ds的質(zhì)粒載體載體并分別轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株雜交(Ac×Ds)后代中會發(fā)生轉(zhuǎn)座事件而產(chǎn)生突變體。利用Ac-Ds序列作探針或引物克隆目標(biāo)基因3〕構(gòu)建動物隨機突變體庫常用載體：用基因陷阱?；蛳葳宓母驹硎峭ㄟ^攜帶有報告基因的載體隨機整合到動物或其它生物染色體，干擾內(nèi)源基因的功能，并標(biāo)記被插入的基因，然后克隆之，方法同前面的植物的方法一樣。動物的轉(zhuǎn)化方法與植物不同，一般采用電轉(zhuǎn)化、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染、注射法等。第六章基因操作中大分子的別離和分析DNA的別離、檢測和純化**天然DNA來源:①染色體DNA。②病毒和噬菌體DNA。③質(zhì)粒DNA。④線粒體和葉綠體DNA。大腸桿菌質(zhì)粒DNA的別離和純化別離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其依據(jù)是利用分子大小不同、堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點來進行別離。目前常用的有堿裂解法、煮沸法、去污劑(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。1堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理堿裂解法由Birnboim和Doly設(shè)計并于1979年發(fā)表，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而到達別離目的。◆在pH高達12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大局部氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全別離。◆當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。◆通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。**堿抽提法所用試劑的作用提取過程中所用的材料有LB培養(yǎng)基、TE緩沖液、溶菌酶液、溶液Ⅰ即葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、溶液Ⅱ即NaOH-SDS溶液、溶液Ⅲ即3mol/L乙酸鉀溶液、酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇、異丙醇、100%乙醇、70%乙醇等。①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用,同時有利于溶菌酶的作用。②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型外表活性劑，它可以溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細胞膜、解聚細胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。③KAc:pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因為中和了核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。④無水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反響，對DNA很平安。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)參加乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相別離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保存在最下層。⑥異戊醇:異戊醇能降低分子外表張力，能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。2通過試劑盒別離純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA基因組DNA的別離1、CTAB法CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中〔>0.7mol/LNaCl〕，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，但不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后，參加乙醇或異丙醇進行沉淀，即可使核酸別離出來。該法的優(yōu)點是適應(yīng)面廣，對任何生物的基因組DNA提取均有效，產(chǎn)量高，缺點是DNA沉淀如果乙醇漂洗不充分，污染在DNA產(chǎn)物中的CTAB對后續(xù)實驗有明顯的抑制作用。2、SDS法以含EDTA、SDS、RNA酶的裂解液裂解細胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，通過乙醇沉淀，獲得DNA。該法的優(yōu)點是簡便，適應(yīng)面也較強，效果也不錯，缺點是DNA產(chǎn)量稍低，且DNA稍易氧化變黃。DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的根本原理一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說，電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之那么較慢。電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。2、影響電泳遷移速率的因素：1〕分子篩效應(yīng)DNA分子在凝膠介質(zhì)中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖一磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。2〕相對分子質(zhì)量具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行別離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。DNA樣品與相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進行電泳對照，觀察其遷移距離，就可獲知該樣品的相對分子質(zhì)量大小。凝膠電泳不僅可以別離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以鑒別相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。3〕構(gòu)型在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋(SC)的共價閉合環(huán)狀(CCC)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(OC)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀(L)分子。這3種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環(huán)狀分子。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA時，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1〕DNA的顯示原理：制備瓊脂糖凝膠時參加溴化乙錠指示劑，溴化乙錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)射桔紅色的熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強幾十倍。熒光的強度正比于DNA的含量，如將濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作瓊脂糖凝膠電泳對照，就可比擬出待測樣品的濃度。假設(shè)用薄層分析掃描儀檢測，只需要5～lOngDNA，就可以從照片上比擬鑒別。如用肉眼觀察，可檢測到0.01～0.1μg的DNA。2〕影響電泳遷移的主要因素：◆DNA的大小◆DNA的構(gòu)象◆瓊脂糖濃度◆緩沖液：乙酸鹽緩沖液(TAE)、硼酸鹽緩沖液(TBE)、磷酸鹽緩沖液(TPE)。**別離不同大小DNA片段的適宜瓊脂糖凝膠濃度3〕瓊脂糖凝膠電泳的操作過程A、緩沖液制備B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存C、將點樣梳洗凈枯燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：稱量參加三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度參加適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中融化。融化好后冷卻到60℃左右，參加EB溶液，至最終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好的點樣梳的膠板中，排走氣泡。室溫放置30-45min。E、加樣和電泳：將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面1-2mm，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍參加DNA樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時間?？筛鶕?jù)溴酚蘭的位置結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機焦距拍照四、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點：分辨率高適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp載樣量大回收DNA純度高五、脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。六、紫外吸收法檢測DNA的濃度和純度紫外光譜分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。分子形狀、雙鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來校正。特點是準(zhǔn)確、簡便。衡量所提取DNA的純度可用OD260與OD280的比值,OD260/OD280對DNA而言其值大約為1.8。當(dāng)OD260/OD280大于1.8那么可能有RNA污染。當(dāng)OD260/OD280小于1.8時那么有蛋白質(zhì)污染。雙鏈DNA的OD260為1時相當(dāng)于濃度為50μg/mL。單鏈DNA的OD260為1時相當(dāng)于濃度為40μg/mL。寡核酸的OD260為1時相當(dāng)于濃度為20-40μg/Ml七、DNA片段的純化根據(jù)實驗要求不同，有時需要高純度的DNA，對提取的DNA樣品須進一步純化并除去溴化乙錠(EB)。先后出現(xiàn)的DNA純化方法有：低熔點瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法、氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、離子交換層析法、“基因純〞試劑純化、GlassMilk〔bead〕結(jié)合法、Qiagen柱純化等，目前以后兩種方法的試劑盒法最常用，簡單且效果好。**透析袋電洗脫法適用于小劑量DNA純化和酶切DNA片段回收。DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳分帶。切取含待純化DNA帶的瓊脂糖凝膠塊，裝入透析袋，進行電泳1-2h后，再反向電泳1-2min。吸取透析袋中的洗脫液于離心管中離心。轉(zhuǎn)移上清液到另一離心管中，參加2倍體積無水乙醇混勻，于-20℃放置過夜沉淀后，離心后上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?*DNA的濃縮當(dāng)提取的DNA溶液的濃度達不到實驗要求時，必須進行DNA溶液的濃縮。實驗室常用的方法有：乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等RNA的別離、檢測和純化細胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。一個典型哺乳動物細胞約含10-5μgRNA。－80%～85%rRNA(28S、18S、5SrRNA)。－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等〕。－1%～5%mRNA，一般按2%計算。**實驗成敗關(guān)鍵：創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂)抑制內(nèi)源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白〔RＮasin，非競爭性抑制劑〕氧銅核糖核苷復(fù)合物硅藻土**RNA的抽提與純化總RNA的制備1、酚-異硫氰酸胍抽提法〔TRIZOL法〕Invitrogen公司產(chǎn)品，核心是利用胍鹽使蛋白質(zhì)迅速變性，RNA酶也迅速失活，因此RNA降解風(fēng)險小，完整性好。由于是酸性溶液，DNA隨雜質(zhì)一起沉淀，而RNA那么溶液在溶解在溶液中，通過離心去渣、上清乙醇沉淀、再離心后，得到RNA沉淀，稍事漂洗和枯燥后，溶解即可。2、硅膠膜純化法以Qiagen公司的Rneasy試劑盒為代表，將生物材料的異硫氰酸胍裂解液上到離心柱上，柱芯中的硅膠膜選擇性地吸附RNA，而其它雜質(zhì)那么在隨后的步驟中洗去，最后將RNA洗脫下來。真核生物mRNA的純從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱〔或磁珠〕別離mRNA?？蓱?yīng)用PromegaPolyATtractmRNA別離系統(tǒng)別離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細胞總RNA共溫育，參加與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA**RNA的電泳檢測RNA的濃度和純度可通過測試其OD260來判斷，OD260為1時相當(dāng)于濃度為40μg/mL。檢測：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。分子雜交分子雜交(moleculehybridization)分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對分子量大小。根據(jù)其檢測對象的不同可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，及由此簡化的斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進行。核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過程中兩個不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。四菌落原位等其它雜交

〔colonyinsituhybridization〕1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理,對Southern印跡技術(shù)作了一些修改,提出了菌落原位雜交技術(shù)。該項技術(shù)是直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合,再與特異性DNA探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落。**菌落原位雜交的操作步驟五DNA微陣列分析〔DNAmicroarry〕●又稱基因芯片技術(shù)，是一種高通量的斑點雜交技術(shù)。將大量的DNA分子〔一般為50-70nt的寡核苷酸〕固定在支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，然后通過自動化儀器檢測雜交信號的強度來判斷樣品中靶分子的數(shù)量。常采用Cy3和Cy5花菁類染料對樣品進行熒光標(biāo)記，它們的激發(fā)光為橙色和紅色，為便于識別，在檢測和分析過程中常將它們分別標(biāo)記為綠色和紅色，當(dāng)二者等量重疊時為黃色?！駪?yīng)用：1、檢測mRNA的表達水平或轉(zhuǎn)錄組，特別是檢測兩個樣品間的差異表達譜。2、比擬基因組雜交研究，檢測基因組中DNA拷貝數(shù)變化。3、檢測mRNA結(jié)構(gòu)如剪接位點、轉(zhuǎn)錄起始位點、轉(zhuǎn)錄終止點等。4、基因組重測序及單核苷酸多態(tài)性〔singlenucleotidepolymorphism,SNP〕分析。**探針標(biāo)記方法：1〕PCR標(biāo)記：采用PCR擴增的方法將放射性或非放射性標(biāo)記的dNTP整合進入雙鏈PCR產(chǎn)物中。2〕隨機引物標(biāo)記：采用短鏈隨機引物指導(dǎo)探針DNA的合成，并完成標(biāo)記的摻入。3〕缺口平移標(biāo)記：采用DNase和DNA聚合酶進行探針合成，完成標(biāo)記的摻入。4〕末端標(biāo)記：采用末端轉(zhuǎn)移酶〔TdT〕或多核苷酸激酶向DNA末端添加標(biāo)記性的核苷酸，完成標(biāo)記的摻入。5〕化學(xué)合成法標(biāo)記：采用化學(xué)合成法合成探針的同時完成標(biāo)記的摻入，常用在寡核苷酸探針的合成上。6〕體內(nèi)合成標(biāo)記：將探針模板克隆到M13噬菌體或其它載體上，在大腸桿菌體內(nèi)合成標(biāo)記性的RNA或DNA探針。注：所有雙鏈探針在雜交之間必須變性成單鏈后才能使用。重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程?！褶D(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細胞。轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細菌中的過程?！褶D(zhuǎn)染(transfection):指病毒及其重組子導(dǎo)入受體細胞的過程?！褶D(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌體及其重組子導(dǎo)入受體細胞的過程。一選擇受體細胞的根本原那么1、便于重組DNA分子的導(dǎo)入。2、便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進行篩選。3、遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大培養(yǎng)或易于進行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應(yīng)性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。4、受體細胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累，可促進外源基因高效分泌表達。5、平安性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細胞或營養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞6、能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。從受體細胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑?，如選用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細胞就可以防止其對重組DNA分子的降解破壞作用。7、受體細胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性。8、具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制等，便于真核目的基因的高效表達。9、在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。二重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌〔一〕氯化鈣法●1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細胞也能攝取質(zhì)粒DNA?！裨硎牵杭毦幱?℃和低滲氯化鈣溶液中，菌細胞壁和膜通透性增加,菌體膨脹成球形，此時轉(zhuǎn)化混合物中DNA形成抗DNase羥基-磷酸鈣復(fù)合物粘附于細胞外表，經(jīng)短暫熱休克(42℃)后，細胞膜形成許多間隙，DNA進入細胞內(nèi)?！袢绻惺軕B(tài)細胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個轉(zhuǎn)化子。**獲得合格的感受態(tài)細胞，要注意以下幾點：1、用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在A600為0.5左右為好。2、制備受體細胞的整個過程在0～4℃進行,盡量防止污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對照受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長。3、為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液，如FSB溶液。二〕電穿孔法電穿孔法(electroporation):是指在一個較大的電脈沖短暫破壞細胞膜的脂質(zhì)雙層，從而允許DNA等分子通過細胞膜進入細胞，而后細胞膜快速復(fù)原，保持細胞的完整。這種方法稱為電穿孔法。最早用于將DNA導(dǎo)入真核細胞，1988年，Dower等人成功應(yīng)用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。其根本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA可以得到109～1012轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉(zhuǎn)化效率將會有所提高，但同時導(dǎo)致受體細胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。研究說明，當(dāng)電場強度和脈沖時間的組合方式導(dǎo)致50%～70%細菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平到達最高。第七章基因操作中的核酸分析技術(shù)第一節(jié)DNA和蛋白質(zhì)相互作用分析1、一、凝膠阻滯實驗〔Gelretardationassay〕又叫DNA遷移率變動實驗〔DNAelectrophoresismobilityshiftassay,EMSA〕，是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)間相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當(dāng)前被作為鑒定或別離純化與特定DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種典型的實驗方法。2、二、DNaseⅠ足跡實驗〔footprintingassay〕是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術(shù)。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以參加非標(biāo)記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡〞，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。3、甲基化干擾實驗和體內(nèi)足跡實驗三甲基化干擾實驗、根據(jù)DMS〔硫酸二甲酯〕能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術(shù)可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會有什么效應(yīng)，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性時，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。四酵母單雜交技術(shù)酵母單雜交技術(shù)最早是1993年由Li等從酵母雙雜交技術(shù)開展而來，通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控。由于酵母單雜交方法檢測特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交(Yeastone-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報道基因表達的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論根底是：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由物理和功能上獨立的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-bindingdomainBD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(ActivationdomainAD)組成，因此可構(gòu)建各種基因與AD的融合表達載體，在酵母中表達為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。缺點：由于插入的靶元件與酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活因子可能發(fā)生相互作用，或插入的靶元件不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，因此往往產(chǎn)生假陽性結(jié)果。如果酵母表達的AD融合蛋白對細胞有毒性，或融合蛋白在宿主細胞內(nèi)不能穩(wěn)定地表達，或融合蛋白發(fā)生錯誤折疊，或者不能定位于酵母細胞核內(nèi)，以及融合的Gal4AD封閉了蛋白質(zhì)上與DNA相互作用的位點，那么都可能干擾AD融合蛋白結(jié)合于靶元件的能力，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。五染色質(zhì)免疫沉淀法〔Chromatinimmunoprecitation，ChIP〕是基于體內(nèi)分析開展起來的。根本原理是：在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。它能真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。由此可見，隨著ChIP的進一步完善，它必將會在基因表達調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。六DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)的新進展1、SELEX與核酸適體技術(shù)：核酸適體〔aptamer，源于拉丁語〕指經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。它是一系列單鏈核酸分子，與特異靶分子相結(jié)合，特異性如同抗體一樣，對可結(jié)合的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力。核酸適體在生物傳感器、新藥開發(fā)以及納米技術(shù)等方面有著廣泛的用途。而體外篩選技術(shù)SELEX是指對隨機寡核苷酸文庫施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo))，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程。2、熒光標(biāo)記技術(shù)3、掃描探針顯微鏡技術(shù)4、外表等離子共振技術(shù)第三節(jié)RNA干擾技術(shù)RNAi〔RNAinterference，RNA干擾〕技術(shù)：利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷靶基因的表達，使細胞胞出現(xiàn)靶基因缺失、類似突變體的表型。dsRNA：雙鏈RNA；siRNA：shortinterferingRNA，小分子干擾RNA。第八章4、PCR的根本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反響混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-退火-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在適宜條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。5、PCR過程：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反響原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。6、PCR反響體系〔1、緩沖液Mg2+是DNA聚合酶的激活劑〔2、脫氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。廠商一般提供為10mmol/L或4mmol/L的貯存液，使用濃度為0.2mmol/L左右?！?、引物PCR引物的設(shè)計一般原那么〔1.〕引物長度一般以18～30bp為宜，過短那么降低特異性，過長那么會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的本錢?！?.〕解鏈溫度(Tm值)很重要，直接決定了擴增中可使用的退火溫度(Ta值)的上下，較高時特異性增加，但退火效率下降，過低時退火效率較高，但特異性下降。兩條引物間的Tm值越接近越好。計算Tm值的方法很多，簡易公式為Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，適于短于20nt的引物。長引物的Tm值計算公式見書，但比實際值往往偏低〔3.〕防止引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，防止序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)?！?.〕要防止兩個引物間特別是3’末端堿基序列互補以及同一引物自身3’末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)?！?.〕G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布，防止出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列?！?.〕引物3’末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴格配對，并且3’末端為G、C或T時引發(fā)效率較高，但3’要防止較密的C+C或G+C連排?！?.〕引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求?！?.〕引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性?！?、模板〔5、耐熱性的DNA聚合酶(1〕TaqDNA聚合酶：最常用(2〕TthDNA聚合酶(3〕VentDNA聚合酶4〕PwoDNA聚合酶5〕PfuDNA聚合酶6〕混合DNA聚合酶7、三、PCR反響程序〔1、常規(guī)程序：94℃左右預(yù)變性幾十秒至幾分鐘；94℃左右變性10秒至1分鐘；50-65℃左右退火30秒至1分鐘；20-35個循環(huán)72℃左右延伸30秒至幾分鐘；72℃左右最后延伸和加尾3-10分鐘；4-25℃保持3分鐘或更長。(2、退火和延伸溫度：退火溫度Ta值由Tm值決定，多數(shù)情況下Ta采用Tm減去3-5℃，較高時特異性強但退火效率低，較低時退火效率增加而非特異擴增增加，可根據(jù)實際研究目的采用高特異性或低特異性退火。當(dāng)退火溫度高到與延伸溫度接近時，可以將退火和延伸溫度合為一個，這時PCR就由三步法變成了兩步法。PCR中其它注意的事項1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作2.設(shè)立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板、無模板試劑對照：除模板外的所有組分第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點在PCR引物的5’加上根據(jù)需要而設(shè)計的酶切位點，PCR產(chǎn)物內(nèi)部沒有該切點。二、TA克隆這是目前最通行的PCR產(chǎn)物克隆方法，根本思路是先將PCR產(chǎn)物與特制的T載體進行連接重組，測序證明正確無誤后，再從T載體上亞克隆到表達載體上進行功能研究四、長片段DNA的PCR擴增長片段DNA的PCR擴增效率較低，因為有許多降低PCR效率的因素。策略有：一是改進PCR緩沖液體系。二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴增40kb左右的片段。10、PCR擴增位置片段反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接DNA片段的序列；用于僅知局部序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶擴增出來的PCR產(chǎn)物均為平末端，有兩種克隆思路：一是在PCR完成后參加適量的Taq酶并在72℃保溫20-30分鐘，使PCR產(chǎn)物每條鏈的3’末端加上一個突出的A后進行TA克隆。二是將平末端PCR產(chǎn)物與平末端進行載體連接克?。豪媒宇^的PCR/錨定PCR(anchoredPCR將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與序列中的基因特異引物(gene-specificprimer,GSP)組合后，用于目標(biāo)基因側(cè)翼序列的擴增。熱不對稱交錯PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)不對稱PCR目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最正確比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR11、cDNA末端快速擴增(rapidamplificationofcDNAend