《基因工程》-考試重點(diǎn)總結(jié)

?基因工程?考試重點(diǎn)總結(jié)基因工程概述第一節(jié)基因操作與基因工程基因操作〔genemanipulation〕：指對(duì)基因進(jìn)行別離、分析、改造、檢測(cè)、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱(chēng)?；蚬こ獭瞘eneengineering〕：通過(guò)工具酶，在體外將目的基因、基因片段或其它DNA元件進(jìn)行切割，與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行連接和重組，導(dǎo)入相應(yīng)受體細(xì)胞，并使外源基因進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，定向改造受體生物性狀或獲得表達(dá)產(chǎn)物?；虿僮髋c基因工程的關(guān)系：基因操作的核心是基因重組〔generecombination〕技術(shù)，基因工程是基因操作、基因重組的核心內(nèi)容和主要目的?；蚬こ痰倪z傳學(xué)效果：受體生物發(fā)生遺傳信息或遺傳性狀的變化并能穩(wěn)定遺傳給下一代。第二節(jié)基因工程是生物科學(xué)開(kāi)展的必然產(chǎn)物基因是基因重組的物質(zhì)根底遺傳因子、基因：是遺傳信息的根本單位。從物質(zhì)結(jié)構(gòu)上看，基因是染色體組核酸分子?；颉瞘ene〕是作為遺傳物質(zhì)的核酸分子上的一段片段并具有遺傳學(xué)功能，可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色體上，也可存在于染色體之外〔如質(zhì)粒、噬菌體等〕?；蚬こ痰睦碚摳祝孩?明確了遺傳信息的攜帶者—基因的載體是DNA，明確了遺傳的物質(zhì)根底。⑵.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保存復(fù)制模型得以說(shuō)明，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問(wèn)題。⑶.中心法那么、操縱子學(xué)說(shuō)的提出以及遺傳密碼子的破譯，解決了遺傳信息的流向和表達(dá)問(wèn)題。(4).遺傳物質(zhì)根底和中心法那么的通用性決定了基因工程原理和技術(shù)在生物界普遍適用，尤其是可以實(shí)現(xiàn)跨越任何物種界限的遺傳成分轉(zhuǎn)移。自此，從理論上講，基因工程已有可能成為現(xiàn)實(shí)基因工程的技術(shù)根底：⑴.DNA體外切割和連接技術(shù)〔限制性?xún)?nèi)切核酸酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，標(biāo)志著DNA重組時(shí)代的開(kāi)始〕。⑵.克隆載體的開(kāi)展與應(yīng)用。⑶.大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立。⑷.瓊脂糖電泳技術(shù)的應(yīng)用。⑸.DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用。⑹.核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用。從技術(shù)上為基因工程的誕生奠定了根底。四、基因工程的內(nèi)容1、基因操作原理：〔1〕DNA和RNA的操作?！?〕基因克隆與功能研究?！?〕基因組學(xué)與生物信息學(xué)的應(yīng)用。2、基因工程的應(yīng)用：〔1〕生物反響器〔bioreactor〕：大規(guī)模生產(chǎn)生物活性分子如生長(zhǎng)激素、胰島素等?！?〕遺傳改進(jìn)〔geneticimprovement〕、分子育種〔molecularbreeding〕、設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種?！?〕基因治療〔genetherapy〕：人體轉(zhuǎn)基因或基因組編輯。第三節(jié)基因的結(jié)構(gòu)——基因操作的理論根底一、基因的結(jié)構(gòu)組成對(duì)基因操作的影響1、基因及其產(chǎn)物的共線性：一個(gè)基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列一一對(duì)應(yīng)。N個(gè)氨基酸=3N個(gè)編碼堿基。2、基因及其產(chǎn)物的非共線性。間斷基因。內(nèi)含子〔intron〕是指真核基因在RNA加工過(guò)程中從原初轉(zhuǎn)錄本中剪去而不進(jìn)入成熟RNA結(jié)構(gòu)、不具有氨基酸編碼能力的一段序列。外顯子〔exon〕：是真核基因轉(zhuǎn)錄本中剪去內(nèi)含子后所保存的RNA片段，它們拼接并進(jìn)行適當(dāng)修飾后成為成熟RNA并執(zhí)行相應(yīng)功能。3、基因的重疊性與可變性：基因的重疊性：?jiǎn)蝹€(gè)DNA序列可編碼一個(gè)以上的蛋白質(zhì)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上可以具有序列重復(fù)性，也可以是相互完全不同的全新蛋白質(zhì)。原因：可變性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、可變性起始位密碼子、可變性編碼終止位點(diǎn)、可變性剪接。開(kāi)放讀碼框〔openreadingframe，ORF〕：成熟mRNA中從起始密碼子ATG至終止密碼子〔TAA、TAG或TGA之一〕之間形成的一個(gè)連續(xù)的氨基酸編碼區(qū)間。以起始密碼子的第1個(gè)堿基作為+1，其5’方向的第1個(gè)堿基為-1。4、啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子〔promoter〕：基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中控制起始的部位，通常是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’上游的一段DNA區(qū)間，其上有許多順式元件。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)〔transcriptionstartsite〕：起始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基，也是摻入到RNA中的第1個(gè)堿基。在轉(zhuǎn)錄研究中記為+1，其5’方向的第1個(gè)堿基〔已屬于啟動(dòng)子而非轉(zhuǎn)錄區(qū)〕為-1。側(cè)翼序列〔flankingsequence〕：一條核酸單鏈上位于某一特定位置的5’或3’方向的序列。上游〔upstream〕：一條核酸單鏈上位于某一堿基的5’方向。下游〔downstream〕：一條核酸單鏈上位于某一堿基的3’方向。終止子〔terminator〕：位于基因的3’部位、終止基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的一段DNA區(qū)間。有依賴(lài)不依賴(lài)ρ因子兩種。核糖體結(jié)合位點(diǎn)〔ribosomalbindingsite,RBS〕：位于mRNA起始密碼子及其正上游的一段區(qū)間，是核糖體結(jié)合并起始翻譯過(guò)程的位點(diǎn)。原核和真核的RBS顯著不同。轉(zhuǎn)錄單位〔transcriptionunit〕/轉(zhuǎn)錄本〔transcript〕：從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)直至轉(zhuǎn)錄的最后一個(gè)堿基之間被轉(zhuǎn)錄的RNA序列，可以包含一或多個(gè)蛋白編碼框。亞克隆〔subcloning〕：1、將大片段克隆子的DNA重新打斷成小片段，然后分別克隆到新的載體中，供進(jìn)一步研究。初步克隆中的外源片段往往較長(zhǎng)，含有許多目的基因片段以外的DNA片段，在諸如表達(dá)序列分析和突變等操作中不便進(jìn)行，因此必須將目的基因所對(duì)應(yīng)的一小段DNA找出來(lái)，這個(gè)過(guò)程叫“亞克隆〞。2、通指將DNA片段從一個(gè)載體穿梭克隆到另一個(gè)載體的過(guò)程。亞克隆技術(shù)：泛指實(shí)驗(yàn)室中以DNA在大腸桿菌中經(jīng)典克隆操作為核心的根本技術(shù)體系。分子克隆工具酶第一節(jié)限制性?xún)?nèi)切酶一、限制與修飾1、限制與修飾現(xiàn)象：限制(restriction)：指一定類(lèi)型的細(xì)菌可以通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶〔restrictionednonuclease〕的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主范圍受到限制。限制作用實(shí)際就是限制性?xún)?nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過(guò)甲基化酶〔methylase〕的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用宿主細(xì)胞通過(guò)甲基化作用到達(dá)識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。甲基化作用：最主要的堿基修飾，使腺嘌呤A成為N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成為5’-甲基胞嘧啶。限制酶是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸水解酶。限制酶存在于細(xì)菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中沒(méi)有限制酶。3.限制性核酸內(nèi)切酶的種類(lèi)據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類(lèi)。Ⅱ型限制酶用途大，多為同源二聚體，其中切口酶只在單鏈上產(chǎn)生切口，Ⅱs型識(shí)別序列和切割位置特殊。二、限制酶識(shí)別的序列1、限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度(n)：一般為4-8個(gè)堿基對(duì)，最常見(jiàn)為6bp。識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)頻率：4n2、限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)：多數(shù)為回文結(jié)構(gòu)〔palindrome〕即鏡像對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。一些酶可識(shí)別多種結(jié)構(gòu)尤其是允許一些堿基是簡(jiǎn)并的，還有一些酶識(shí)別序列呈間斷對(duì)稱(chēng)，即回文對(duì)稱(chēng)序列之間可以間隔一定長(zhǎng)度的任意堿基。3、限制酶的切割位置：多數(shù)在識(shí)別序列內(nèi)部，也有在外部、兩端、兩側(cè)或單側(cè)的。三、Ⅱ限制酶的功能和產(chǎn)生的末端類(lèi)型Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH，識(shí)別序列一般為4～6個(gè)堿基對(duì)，通常是反向重復(fù)順序，具有180°的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性，即回文結(jié)構(gòu)。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的酶活性〔稱(chēng)為PI-prefix〕。它們識(shí)別序列很長(zhǎng)，核心識(shí)別序列一般為10-12bp，識(shí)別位點(diǎn)極少。四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割效率的影響限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割靶序列時(shí)需要識(shí)別序列兩側(cè)具有一定長(zhǎng)度的DNA，否那么會(huì)降低切割效率。對(duì)側(cè)翼長(zhǎng)度敏感性較低的酶有EcoRⅠ等，只要一個(gè)側(cè)翼堿基即保證90%的效率。對(duì)側(cè)翼長(zhǎng)度敏感性高的酶有AccⅠ、HindⅢ、PstⅠ等，側(cè)翼3個(gè)堿基以上也未必理想。設(shè)計(jì)引物、接頭等時(shí)要考慮適當(dāng)長(zhǎng)度的保護(hù)堿基，載體構(gòu)建時(shí)多克隆位點(diǎn)中的相臨位置的酶的切割序列的選擇也很重要。限制酶的活性單位〔unit〕：1個(gè)單位的酶是指在建議的緩沖液及溫度下，在20μl反響液中反響1h，使1μgDNA〔多用λ〕完全消化所需要的酶的量。五、位點(diǎn)偏愛(ài)某些限制酶對(duì)同一底物中的不同位置的識(shí)別位點(diǎn)的切割效率不同，表現(xiàn)出偏愛(ài)性，這種現(xiàn)象稱(chēng)作位點(diǎn)偏愛(ài)。某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點(diǎn)對(duì)酶的敏感性不同。λ噬菌體DNA為48502bp，兩端為12bp粘性末端。EcoRⅠ酶切割λ噬菌體中的5個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍；EcoRⅠ對(duì)腺病毒2DNA不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。由于位點(diǎn)偏愛(ài)性，λDNA用HindⅢ消化而制備的λHindⅢDNAmarker中4.3kb條帶甚至比2.0kb條帶還弱。原因：切割時(shí)需要同時(shí)與2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用〔如NarⅠ等〕，或識(shí)別和切割時(shí)要求在DNA上有2個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中1個(gè)是另1個(gè)的被切割時(shí)起激活作用的變構(gòu)位點(diǎn)。應(yīng)對(duì)方法：超量用酶、延長(zhǎng)切割時(shí)間。七、限制酶的星活性(staractivity)在極端非標(biāo)準(zhǔn)反響條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列不同但相似的序列，降低酶切反響的特異性，這種改變的特殊性稱(chēng)為限制性核酸內(nèi)切酶的星活性。產(chǎn)生原因：①反響體系中甘油的濃度大于5%。②酶用量過(guò)大，大于100U/μgDNA。③低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有機(jī)劑如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)離子的存在。易發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。方法：對(duì)因改進(jìn)。八、單鏈DNA的切割多數(shù)限制酶很難切割單DNA模板。局部限制酶除切割雙鏈DNA外，還可切割單DNA，但活性一般都不高。切口酶雖然識(shí)別雙鏈，但只在單鏈上切口，名稱(chēng)前要加一個(gè)N。九、酶切位點(diǎn)的引入現(xiàn)代基因工程中通過(guò)引物化學(xué)合成等方式可以很方便進(jìn)向目標(biāo)位置引入設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)。通過(guò)不同酶切末端的連接重組也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，對(duì)具體情況的分析在設(shè)計(jì)中有價(jià)值：5’突出末端補(bǔ)平后重連；同尾末端連接；平末端連接。十、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素①DNA樣品的純度DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性?？刹捎靡韵路椒ǎ岣呙富钚裕杭哟竺傅挠昧?，1μgDNA用10U酶加大反響總體積延長(zhǎng)反響時(shí)間②DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、Mbol等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影響。采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來(lái)制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。十一、基因組中酶切位點(diǎn)分布的不均一性在基因組中酶切位點(diǎn)的分布并不是均一的。大腸桿菌中六堿基識(shí)別的酶SpeⅠ平均60kb才出現(xiàn)1次。酵母中重復(fù)序列以外富含GC的識(shí)別序列較少。哺乳動(dòng)物基因組中CG序列只有隨機(jī)概率值的1/5，且多數(shù)發(fā)生胞嘧啶甲基化，SmaⅠ位平均約65kb才出現(xiàn)1次。果蠅和線蟲(chóng)中CG基序雖然少，但不發(fā)生甲基化。限制性核酸內(nèi)切酶操作的考前須知①商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶，參加酶的體積應(yīng)不超過(guò)總體積的10%，否那么酶液中的甘油濃度超過(guò)5%時(shí)將會(huì)抑制酶的活性。②整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在參加其它試劑之后，最后參加酶。③當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長(zhǎng)反響時(shí)間，減少酶的用量。④當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液，假設(shè)沒(méi)有通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反響。⑤正確保存、分裝和取用限制酶，抽提高質(zhì)量的DNA。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途①在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構(gòu)建基因文庫(kù)。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。第二節(jié)甲基化酶一、甲基化酶的種類(lèi)原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶〔methylase〕，又稱(chēng)甲基轉(zhuǎn)移酶〔methyltransferase〕，大腸桿菌中有3種。三、甲基化對(duì)限制酶切的影響1、修飾酶切位點(diǎn)：敏感的酶不能切開(kāi)。2、產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)：為依賴(lài)于甲基化的限制酶創(chuàng)造切點(diǎn)。3、對(duì)基因組作圖的影響：哺乳動(dòng)物具有較多的m5CG序列具有組織細(xì)胞特異性，而且一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的m5CG甲基化不徹底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶作圖時(shí)具有可變性，對(duì)圖的穩(wěn)定性帶來(lái)影響。植物的基因組DNA的甲基化程度高，作圖時(shí)也要求選用對(duì)m5CG甲基化不敏感的限制酶。第三節(jié)DNA聚合酶DNA聚合酶〔DNApolymerase〕的主要活性是催化DNA的合成〔在具備模板、引物、dNTPs等情況下〕及其相輔的活性。真核生物有4種DNA聚合酶：α、β、γ、線粒體型。原核生物有3種DNA聚合酶：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。二、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)〔1〕Klenow酶的根本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’核酸外切酶活性。〔2〕Klenow酶的根本用途〔可被T4DNA聚合酶代替〕：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3′粘性凹陷末端抹平DNA的3′粘性凸出末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列三、T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)〔1〕T4DNA酶的根本特性：有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3的DNA聚合酶活性。在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3’-OH端外切－在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸。－在四種dNTPs均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。四、T7噬菌體DNA聚合酶(T7phageDNApolymerase)持續(xù)合成能力最強(qiáng)有3’→5’外切酶活性是Klenow酶的1000。可代替T7噬菌體DNA聚合酶的用途。五、耐熱性的DNA聚合酶〔第八章詳講〕來(lái)自噬高溫細(xì)菌，如Taq、Pfu等。高溫下具有5’→3’DNA聚合酶活性，一般在72℃最理想。有5’→3’外切酶活性。具3’→5’外切酶活性者具校正〔proofreading〕功能，如Pfu。否那么無(wú)校正功能，如Taq。用于PCR擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄酶：是依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶，以RNA為模板聚合cDNA鏈，具有5′→3′的DNA聚合酶活性、5′→3′的RNA外切核酸酶活性和RNaseH活性，但缺乏3′→5′RNA外切核酸酶活性，所以反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中無(wú)校正功能。末端轉(zhuǎn)移酶：是不依賴(lài)于模板的DNA聚合酶，催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端?？僧a(chǎn)生同源多聚尾用于連接、引物退火，也可用于末端標(biāo)記。第四節(jié)其它分子克隆工具酶一、依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶ATP〔DNAdependentRNApolymerase〕包括SP6噬菌體和T4噬菌體RNA聚合酶?；钚裕恨D(zhuǎn)錄活性，無(wú)需引物，但識(shí)別特異啟動(dòng)子序列。用途：體外合成RNA分子作探針等。用于表達(dá)外源基因的mRNA，然后用于翻譯蛋白。二、DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸根和3′-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反響需要供應(yīng)能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶那么以ATP作為能量來(lái)源。1、T4DNA連接酶的作用機(jī)制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3′羥基形成3’,5’-磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。3、平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接那么屬于分子間的連接，因此后者反響速度要慢的多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量〔10倍大于粘性末端的連接〕。加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞時(shí)機(jī)。參加10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用。參加單價(jià)陽(yáng)離子〔NaCl〕,最終濃度150-200mmol/L。基因工程載體一、根本概念利用重組DNA技術(shù)別離目的基因，稱(chēng)之為基因克隆(genecloning)。克隆(clone)：作物動(dòng)詞時(shí)是指從單一祖先產(chǎn)生同一的DNA分子群體或細(xì)胞群體的過(guò)程，作名詞時(shí)指從一個(gè)共同祖先無(wú)性繁殖下來(lái)的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊群體?；蛭膸?kù)(genelibrary)：由大量的含有基因組DNA的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體。載體(vector)：在基因工程中，攜帶著目的基因或DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具DNA分子。分類(lèi)按載體功能分：克隆載體、表達(dá)載體按載體性質(zhì)分：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、人工染色體表達(dá)體系 載體 宿主原核生物表達(dá)體系 質(zhì)粒、噬菌體 細(xì)菌酵母表達(dá)體系 大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒 酵母轉(zhuǎn)基因植物體系 大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭載體〔Ti質(zhì)?！场⒉《镜?植株哺乳細(xì)胞表達(dá)體系 大腸桿菌-病毒穿梭載體、脂質(zhì)體等 培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞基因直接導(dǎo)入 DNA本身〔基因槍微粒轟擊法、注射法等〕 生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個(gè)體三、基因工程載體必須具備的條件：※〔1〕有復(fù)制起點(diǎn)※〔2〕具有假設(shè)干個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)※〔3〕具備適宜的篩選標(biāo)記※〔4〕具備適宜的拷貝數(shù)目〔5〕分子量要相對(duì)較小〔6〕在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高〔7〕易別離純化※表示載體必須具備的條件第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒(plasmid)的根本特性Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。質(zhì)粒DNA多呈超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)，大小為1-200kb，可以持續(xù)穩(wěn)定地處于游離狀態(tài)，但一定條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此應(yīng)用廣泛。1、質(zhì)粒的復(fù)制：由復(fù)制子(ori，復(fù)制起始區(qū)及與此相關(guān)的順式作用元件)決定。質(zhì)粒復(fù)制的機(jī)理請(qǐng)見(jiàn)教材。2、質(zhì)粒的拷貝數(shù)：根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒〔拷貝數(shù)少，為1-5個(gè)〕與松弛型復(fù)制質(zhì)?！部截悢?shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝〕。作為載體的質(zhì)粒一般應(yīng)該是松弛型的。拷貝數(shù)是由復(fù)制起始點(diǎn)的類(lèi)型決定的，如pMB1或ColE1。pUC系列載體中的突變型pMB1復(fù)制子可達(dá)500-700個(gè)拷貝。3、質(zhì)粒的不親和性(incompatibility)：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。涉及細(xì)胞分裂過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)性選擇。不相容群。4、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：自然條件下質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)細(xì)菌的接合(conjugation)的作用而轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞中。三親雜交法。質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件：1有特定的復(fù)制起始子。2有多種限制性?xún)?nèi)切酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個(gè)；2有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗(yàn)；3有一定容量；4有相當(dāng)?shù)目截悢?shù)，即每個(gè)宿主菌可能容納的最多數(shù)。二、標(biāo)記基因1、轉(zhuǎn)化子標(biāo)記基因：用于鑒別目的DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)。Ampr〔氨芐青霉素抗性基因〕：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)。Tetr〔四環(huán)素抗性基因〕：阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。Cmr〔氯霉素抗性基因〕：編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Kanr〔卡那霉素抗性基因〕：編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶。supF〔琥珀突變抑制基因〕：編碼細(xì)菌抑制性tRNA，可翻譯UAG為酪氨酸。赭石突變〔UAA〕，乳白突變〔UGA〕。正向選擇標(biāo)記：蔗糖致死基因sacB。2、重組子標(biāo)記基因：用于將重組子與非重子區(qū)別開(kāi)來(lái)。α-互補(bǔ)(αcomplementation)：人工突變使大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而載體那么攜帶有LacZ基因的N-端140個(gè)氨基酸和編碼區(qū)段(lacZ’)，二者單獨(dú)存在時(shí)均無(wú)功能，但共存于一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞時(shí)那么發(fā)生功能互補(bǔ)，形成具有完全活性的LacZ酶。多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite，MCS)：載體上的一段人工設(shè)計(jì)和人工合成的DNA序列，含有多個(gè)在該載體唯一的限制性?xún)?nèi)切酶的切點(diǎn)，以方便載體與外源片段的重組。插入失活(insretionalinactivation)：當(dāng)一段足夠長(zhǎng)的外源DNA片段插入到一個(gè)功能基因的編碼區(qū)后，導(dǎo)致ORF移碼或提前終止，嚴(yán)重破壞原基因的編碼能力而使該基因失活。藍(lán)白斑篩選(white-bluescreening)：空載體轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，由于α-互補(bǔ)而形成的功能性的LacZ蛋白，能夠轉(zhuǎn)化無(wú)色底物X-gal而形成深藍(lán)色的產(chǎn)物，使菌落或噬菌斑顯藍(lán)色(藍(lán)斑)；重組載體的轉(zhuǎn)化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互補(bǔ)，在IPTG+X-gal條件下菌落或噬菌斑不顯藍(lán)色(白斑)；通過(guò)菌落或噬菌斑的藍(lán)/白色差異而到達(dá)篩選鑒定出重組子與非重組子的目的。三、質(zhì)粒載體的種類(lèi)質(zhì)粒的開(kāi)展階段第一階段〔1977年前〕：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量〔降低載體長(zhǎng)度〕，建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3、T7、SP6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的根底上改建而成含LacZ基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker。pUC18與pUC19只是多克隆位點(diǎn)的排列方向相反，其余一致。表達(dá)載體：一般是在克隆的載體上添加和完善了用于外源基因表達(dá)的一些根本元件，如強(qiáng)啟動(dòng)子、蛋白純化標(biāo)簽、信號(hào)肽、誘導(dǎo)表達(dá)元件等。如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。λ噬菌體載體一、λ噬菌體的分子生物學(xué)λ噬菌體的組成結(jié)構(gòu)和用途噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲(chóng)〞。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。λ噬菌體為線性雙鏈DNA的細(xì)菌病毒，具有互補(bǔ)的12bp粘性末端，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長(zhǎng)48531bp，含50多個(gè)基因。λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：結(jié)構(gòu)區(qū)：A～J19個(gè)基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū)。組區(qū)att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和N、CI基因。裂解區(qū)：Q-R。λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長(zhǎng)達(dá)20kb的λDNA，換入相應(yīng)長(zhǎng)度的目的基因?；蛭膸?kù)構(gòu)建常使用λ載體。不少先進(jìn)的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進(jìn)行構(gòu)建。四、λ載體的克隆原理和步驟1、通過(guò)裂解過(guò)程增殖λ載體。2、載體與外源DNA的酶切。載體一般要純化左路、右臂，并進(jìn)行去磷酸化處理。3、外源DNA與載體的連接，形成的是多聯(lián)體。4、重組噬菌體的體外包裝，需要單獨(dú)制備衣殼蛋白，包裝過(guò)程對(duì)DNA大小有選擇性。5、包裝后的噬菌體顆粒感染大腸桿菌，經(jīng)過(guò)λ的復(fù)制、包裝和裂解過(guò)程，重組載體得到擴(kuò)增，一個(gè)λ的感染和擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致它周?chē)蝗Ψ秶鷥?nèi)的大腸桿菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。6、篩選。每個(gè)噬菌斑代表了一個(gè)重組λ，所有噬菌斑的集合就為一個(gè)文庫(kù)。pfu:plaqueformingunit，噬菌斑形成單位，指每微克包裝λDNA感染大腸桿菌后形成的噬菌斑數(shù)，要求100萬(wàn)以上。第四章人工染色體載體第一節(jié)粘粒載體一、粘粒的結(jié)構(gòu)特征和用途粘粒實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。cos序列是l噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)、抗性標(biāo)記、cos位點(diǎn)，因而能像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般5-7kb左右，用來(lái)克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可達(dá)45kb。有的粘粒載體含有兩個(gè)cos位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。二、粘粒載體的工作原理粘粒載體的主要工作原理類(lèi)似l噬菌體載體。在外源片段與載體連接時(shí)，粘粒載體相當(dāng)于l噬菌體載體的左右臂，cos位點(diǎn)通過(guò)粘段退火后，再于外源片段相間連接成多聯(lián)體。當(dāng)多聯(lián)體與l噬菌體包裝的蛋白質(zhì)混合時(shí)l噬菌體A基因蛋白的末端酶功能將切割成兩個(gè)cos位點(diǎn)，并將兩個(gè)同方cos位點(diǎn)之間的片段包裝到l噬菌體顆粒中去。允許插入片段為30-45kb。三、粘?？寺≥d體粘粒pJB8、含雙cos位點(diǎn)的粘粒載體、pcos1EMBL等。四、粘粒載體文庫(kù)的擴(kuò)增和貯存噬菌體顆粒狀的粘粒文庫(kù)在含有幾滴氯仿的SM溶液中可以保存幾周?？梢圆捎糜坝〉较跛崂w維素膜上保存、挑取所有菌落混合培養(yǎng)后深冷保存，等。第二節(jié)酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體〔yeastartificialchromosome，YAC〕：就是模擬酵母菌染色體的復(fù)制而構(gòu)建的載體。一、YAC載體的復(fù)制元件YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成成分，騎在酵母中復(fù)制的必須元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列即自主復(fù)制序列、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒和兩個(gè)端粒。這些元件能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的別離及保持染色體穩(wěn)定的需要。端粒重復(fù)序列：是定位于染色體末端的一段序列，用于保護(hù)線狀DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，已形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒：是有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。二、YAC載體的工作原理YAC載體主要是用來(lái)構(gòu)建大片段DNA文庫(kù)，特別是用來(lái)構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)，并不用作常規(guī)的基因克隆。圖示是pYAC4載體的遺傳結(jié)構(gòu)圖，當(dāng)用BamHⅠ切割成現(xiàn)狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動(dòng)染色體的復(fù)制和分配，從而決定著個(gè)微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的DNA片段。允許插入片段大小：沒(méi)有限制，一般為250-1500kb。YAC的缺點(diǎn)：插入片段容易出現(xiàn)缺失和重排現(xiàn)象，YAC與酵母染色體大小相似不容易別離和純化。YAC的優(yōu)點(diǎn)：酵母細(xì)胞比大腸桿菌對(duì)不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA片段有更強(qiáng)的容忍性，文庫(kù)的代表性強(qiáng)，適合作真核染色體片段功能研究。第三節(jié)細(xì)菌人工染色體載體細(xì)菌人工染色體載體〔bacterialartificialchromosome，BAC〕：就是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷貝質(zhì)粒載體。F質(zhì)粒：是一個(gè)約100kb的質(zhì)粒，編碼60多種參與復(fù)制、分配和結(jié)合過(guò)程的蛋白質(zhì)。BAC載體及其結(jié)構(gòu)組成BAC載體大小約7.5kb，其本質(zhì)是一個(gè)質(zhì)?？寺≥d體。BAC載體與常見(jiàn)克隆載體的核心區(qū)別在于其復(fù)制單元的特殊性。復(fù)制單元來(lái)自F質(zhì)粒二、BAC載體工作原理BAC載體的工作原理與常規(guī)的質(zhì)?？寺≥d體相似。不同的是，BAC載體裝載的是大片段DNA，一般在100～300kb。對(duì)如此大的DNA片段一般要通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳來(lái)別離。另外，由于BAC載體的拷貝數(shù)小，制備難度大。為解決這個(gè)問(wèn)題，有的學(xué)者將BAC載體作為外源片段克隆到常規(guī)高拷貝質(zhì)粒載體上，從而在大腸桿菌中以多拷貝的形式復(fù)制，便于載體的制備，使用時(shí)將高拷貝質(zhì)粒去掉。第四節(jié)P1噬菌體載體和P1人工染色體載體一、P1噬菌體的分子特征：雙鏈線狀DNA，110kb，末端具有10kb左右冗余序列，感染進(jìn)入大腸桿菌后冗余序列發(fā)生重組，形成環(huán)狀分子，cⅠ決定進(jìn)入溶原或裂解狀態(tài)。包裝方式與λ不同。二、P1噬菌體載體元件：復(fù)制元件、環(huán)化和包裝信號(hào)、標(biāo)記基因、克隆位點(diǎn)、填充片段。P1噬菌體載體工作原理：與粘粒相似。三、P1人工染色體載體：結(jié)合了P1噬菌體載體和BAC載體的最正確特性，如pCYPAC1，允許外源片段為130-150kb，采用電轉(zhuǎn)化，外源片段的嵌合和重組現(xiàn)象較低，對(duì)重組序列的回文結(jié)構(gòu)的忍受性強(qiáng)。第五章表達(dá)載體第一節(jié)大腸桿菌表達(dá)載體一、大腸桿菌表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)原核表達(dá)載體：適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。均是質(zhì)粒載體，首先必然滿足克隆載體的根本要求，然后增加表達(dá)元件。1、表達(dá)元件(expressionelements)：1〕啟動(dòng)子(promoter)：三類(lèi)，即lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和它們的雜合啟動(dòng)子tac或trc，都受IPTG誘導(dǎo)。T7噬菌體啟動(dòng)子λ噬菌體的PL啟動(dòng)子。2〕終止子：依賴(lài)于ρ因子或不依賴(lài)于ρ因子〔遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止〕。3〕核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomebindingside,RBS)：Shine-Dalgarno(SD)序列，ATG與RBS之間的距離很重要，一般3-11bp。2、表達(dá)形式完整單一蛋白：?jiǎn)我换虻木幋a區(qū)表達(dá)。融合蛋白(fusionprotein)：多個(gè)基因的編碼區(qū)的串聯(lián)體，但構(gòu)成一個(gè)整體的單一ORF，如果融合標(biāo)簽蛋白有利于蛋白的定向、純化，如果融合多個(gè)目標(biāo)蛋白，那么類(lèi)似于直接表達(dá)了一個(gè)多酶復(fù)合體一樣，可減少載體構(gòu)建難度，而且可以偶連兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)。3、表達(dá)的控制誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：IPTG防滲漏表達(dá)系統(tǒng)：lacIqPL啟動(dòng)子受cⅠ的調(diào)控，低溫(30℃)下阻抑轉(zhuǎn)錄，高溫(40-45℃)下解除抑制。4、分泌表達(dá)載體：產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙，可防止受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使其正確折疊，或去除N-端甲硫氨酸，以維護(hù)活性。信號(hào)肽(signalpeptide)有堿性磷酸酶信號(hào)肽、蛋白質(zhì)A信號(hào)肽〔如Amersham公司的pEZZ18系統(tǒng)〕。四、表達(dá)產(chǎn)物的純化1、包涵體(inclusionbody)的純化：許多情況下表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)形成不溶的顆粒狀包涵體，可通過(guò)機(jī)械法、凍融法、超聲波處理等破碎細(xì)胞，離心收集包涵體，洗滌去除雜蛋白，用鹽酸胍、尿素和SDS溶解包涵體，再通過(guò)一定的法使蛋白質(zhì)折疊。有的經(jīng)上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵體后就沒(méi)有活性了，但可作為抗原。2、可溶性蛋白的純化：表達(dá)的蛋白可以細(xì)胞內(nèi)呈可溶狀態(tài)，也有少量進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)區(qū)。將細(xì)胞裂解物的上清局部用于純化目標(biāo)蛋白，甚至可直接作為粗酶液進(jìn)行生化反響。第二節(jié)穿梭載體**穿梭載體(shuttlevector)：能夠在兩類(lèi)不同的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，主要是質(zhì)粒，它們至少有兩套復(fù)制單元和兩套選擇標(biāo)記，相當(dāng)于兩個(gè)載體的聯(lián)合。只要涉及大腸桿菌以外的細(xì)胞，絕大多數(shù)載體都裝有大腸桿菌質(zhì)粒載體的根本元件，都可看作穿梭載體。一、大腸桿菌/革蘭氏陽(yáng)性菌穿梭載體：如向枯草芽孢桿菌的穿梭。二、大腸桿菌/酵母菌穿梭載體：主要用于遺傳學(xué)和真核表達(dá)研究，尤其是當(dāng)?shù)鞍仔枰M(jìn)行真核修飾時(shí)，如磷酸化、糖基化等。三、其它穿梭載體：如動(dòng)物病毒載體、植物轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒、昆蟲(chóng)桿狀病毒等，更為復(fù)雜一些。第三節(jié)整合載體整合載體(integrationvector)：用于將某個(gè)基因或某些基因插入到宿主的染色體中去工作，按整合方式可分為定點(diǎn)整合和隨機(jī)整合兩類(lèi)，按作用可分為目的基因的插入/敲除或隨機(jī)突變體庫(kù)的構(gòu)建。一、基因插入/基因敲除同源重組整合載體最為常用，不僅含有大腸桿菌克隆載體的骨架，還有一段便于同源重組的重組DNA片段。二、隨機(jī)插入突變載體用于功能基因組研究中基因突變材料的創(chuàng)造。隨機(jī)突變體庫(kù)是指標(biāo)記基因在載體的攜帶下通過(guò)DNA重組事件隨機(jī)插入到基因組中而形成的眾多基因突變體的集合。1、微生物插入突變體庫(kù)：如pEG922，需要借助轉(zhuǎn)座子。2、構(gòu)建植物突變體庫(kù)所用的載體：根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的T-DNA插入或植物轉(zhuǎn)座子(transposon)標(biāo)簽是植物基因功能研究中常用的產(chǎn)生突變體的方法1〕T-DNA插入突變體：植物轉(zhuǎn)基因過(guò)程中T-DNA區(qū)段如果插入到一個(gè)功能基因中，會(huì)導(dǎo)致該基因插入失活而產(chǎn)生性狀變化，形成突變體。還可以在T-DNA區(qū)段構(gòu)建基因激活標(biāo)簽、基因陷阱(genetrap)、啟動(dòng)子陷阱(promotertrap)或增強(qiáng)子陷阱(enhancertrap)，用于直接克隆靶基因編碼區(qū)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等。對(duì)于突變基因，只需要采用反向PCR或錨定PCR擴(kuò)增或通過(guò)篩選文庫(kù)，就可以直接克隆得到其序列。2〕植物Ac-Ds轉(zhuǎn)座子雙因子插入突變：玉米Ac(activator)因子是一個(gè)轉(zhuǎn)座子，含有完整的轉(zhuǎn)座酶，Ds(dissociation)是Ac缺失轉(zhuǎn)座酶基因的缺失體，但具兩端的反向重復(fù)序列。分別構(gòu)建含Ac和Ds的質(zhì)粒載體載體并分別轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株雜交(Ac×Ds)后代中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)座事件而產(chǎn)生突變體。利用Ac-Ds序列作探針或引物克隆目標(biāo)基因3〕構(gòu)建動(dòng)物隨機(jī)突變體庫(kù)常用載體：用基因陷阱。基因陷阱的根本原理是通過(guò)攜帶有報(bào)告基因的載體隨機(jī)整合到動(dòng)物或其它生物染色體，干擾內(nèi)源基因的功能，并標(biāo)記被插入的基因，然后克隆之，方法同前面的植物的方法一樣。動(dòng)物的轉(zhuǎn)化方法與植物不同，一般采用電轉(zhuǎn)化、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染、注射法等。第六章基因操作中大分子的別離和分析DNA的別離、檢測(cè)和純化**天然DNA來(lái)源:①染色體DNA。②病毒和噬菌體DNA。③質(zhì)粒DNA。④線粒體和葉綠體DNA。大腸桿菌質(zhì)粒DNA的別離和純化別離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其依據(jù)是利用分子大小不同、堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行別離。目前常用的有堿裂解法、煮沸法、去污劑(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。1堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理堿裂解法由Birnboim和Doly設(shè)計(jì)并于1979年發(fā)表，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而到達(dá)別離目的?！粼趐H高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性，質(zhì)粒DNA的大局部氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全別離。◆當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。**堿抽提法所用試劑的作用提取過(guò)程中所用的材料有LB培養(yǎng)基、TE緩沖液、溶菌酶液、溶液Ⅰ即葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、溶液Ⅱ即NaOH-SDS溶液、溶液Ⅲ即3mol/L乙酸鉀溶液、酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇、異丙醇、100%乙醇、70%乙醇等。①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用,同時(shí)有利于溶菌酶的作用。②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型外表活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來(lái)。③KAc:pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因?yàn)橹泻土撕怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。④無(wú)水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反響，對(duì)DNA很平安。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)參加乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，使DNA失水而易于聚合。⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相別離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保存在最下層。⑥異戊醇:異戊醇能降低分子外表張力，能減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。2通過(guò)試劑盒別離純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA基因組DNA的別離1、CTAB法CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中〔>0.7mol/LNaCl〕，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，但不能沉淀核酸。通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后，參加乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀，即可使核酸別離出來(lái)。該法的優(yōu)點(diǎn)是適應(yīng)面廣，對(duì)任何生物的基因組DNA提取均有效，產(chǎn)量高，缺點(diǎn)是DNA沉淀如果乙醇漂洗不充分，污染在DNA產(chǎn)物中的CTAB對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有明顯的抑制作用。2、SDS法以含EDTA、SDS、RNA酶的裂解液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，通過(guò)乙醇沉淀，獲得DNA。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，適應(yīng)面也較強(qiáng)，效果也不錯(cuò)，缺點(diǎn)是DNA產(chǎn)量稍低，且DNA稍易氧化變黃。DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的根本原理一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說(shuō)，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之那么較慢。電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。2、影響電泳遷移速率的因素：1〕分子篩效應(yīng)DNA分子在凝膠介質(zhì)中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖一磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。2〕相對(duì)分子質(zhì)量具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行別離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。DNA樣品與相對(duì)分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對(duì)照，觀察其遷移距離，就可獲知該樣品的相對(duì)分子質(zhì)量大小。凝膠電泳不僅可以別離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以鑒別相對(duì)分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。3〕構(gòu)型在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種因素的影響，使超螺旋(SC)的共價(jià)閉合環(huán)狀(CCC)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的一條鏈斷裂，變成開(kāi)環(huán)狀(OC)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀(L)分子。這3種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開(kāi)環(huán)狀分子。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA時(shí)，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1〕DNA的顯示原理：制備瓊脂糖凝膠時(shí)參加溴化乙錠指示劑，溴化乙錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)射桔紅色的熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作瓊脂糖凝膠電泳對(duì)照，就可比擬出待測(cè)樣品的濃度。假設(shè)用薄層分析掃描儀檢測(cè)，只需要5～lOngDNA，就可以從照片上比擬鑒別。如用肉眼觀察，可檢測(cè)到0.01～0.1μg的DNA。2〕影響電泳遷移的主要因素：◆DNA的大小◆DNA的構(gòu)象◆瓊脂糖濃度◆緩沖液：乙酸鹽緩沖液(TAE)、硼酸鹽緩沖液(TBE)、磷酸鹽緩沖液(TPE)。**別離不同大小DNA片段的適宜瓊脂糖凝膠濃度3〕瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程A、緩沖液制備B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存C、將點(diǎn)樣梳洗凈枯燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：稱(chēng)量參加三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度參加適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中融化。融化好后冷卻到60℃左右，參加EB溶液，至最終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好的點(diǎn)樣梳的膠板中，排走氣泡。室溫放置30-45min。E、加樣和電泳：將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面1-2mm，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍參加DNA樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時(shí)間。可根據(jù)溴酚蘭的位置結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機(jī)焦距拍照四、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)：分辨率高適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp載樣量大回收DNA純度高五、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)與常規(guī)的直流單向電場(chǎng)凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱(chēng)之為脈沖式交變電場(chǎng)。六、紫外吸收法檢測(cè)DNA的濃度和純度紫外光譜分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。分子形狀、雙鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會(huì)導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來(lái)校正。特點(diǎn)是準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便。衡量所提取DNA的純度可用OD260與OD280的比值,OD260/OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8。當(dāng)OD260/OD280大于1.8那么可能有RNA污染。當(dāng)OD260/OD280小于1.8時(shí)那么有蛋白質(zhì)污染。雙鏈DNA的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為50μg/mL。單鏈DNA的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/mL。寡核酸的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為20-40μg/Ml七、DNA片段的純化根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求不同，有時(shí)需要高純度的DNA，對(duì)提取的DNA樣品須進(jìn)一步純化并除去溴化乙錠(EB)。先后出現(xiàn)的DNA純化方法有：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法、氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、離子交換層析法、“基因純〞試劑純化、GlassMilk〔bead〕結(jié)合法、Qiagen柱純化等，目前以后兩種方法的試劑盒法最常用，簡(jiǎn)單且效果好。**透析袋電洗脫法適用于小劑量DNA純化和酶切DNA片段回收。DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳分帶。切取含待純化DNA帶的瓊脂糖凝膠塊，裝入透析袋，進(jìn)行電泳1-2h后，再反向電泳1-2min。吸取透析袋中的洗脫液于離心管中離心。轉(zhuǎn)移上清液到另一離心管中，參加2倍體積無(wú)水乙醇混勻，于-20℃放置過(guò)夜沉淀后，離心后上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?*DNA的濃縮當(dāng)提取的DNA溶液的濃度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，必須進(jìn)行DNA溶液的濃縮。實(shí)驗(yàn)室常用的方法有：乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等RNA的別離、檢測(cè)和純化細(xì)胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。一個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA。－80%～85%rRNA(28S、18S、5SrRNA)。－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等〕。－1%～5%mRNA，一般按2%計(jì)算。**實(shí)驗(yàn)成敗關(guān)鍵：創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase的環(huán)境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂)抑制內(nèi)源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白〔RＮasin，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑〕氧銅核糖核苷復(fù)合物硅藻土**RNA的抽提與純化總RNA的制備1、酚-異硫氰酸胍抽提法〔TRIZOL法〕Invitrogen公司產(chǎn)品，核心是利用胍鹽使蛋白質(zhì)迅速變性，RNA酶也迅速失活，因此RNA降解風(fēng)險(xiǎn)小，完整性好。由于是酸性溶液，DNA隨雜質(zhì)一起沉淀，而RNA那么溶液在溶解在溶液中，通過(guò)離心去渣、上清乙醇沉淀、再離心后，得到RNA沉淀，稍事漂洗和枯燥后，溶解即可。2、硅膠膜純化法以Qiagen公司的Rneasy試劑盒為代表，將生物材料的異硫氰酸胍裂解液上到離心柱上，柱芯中的硅膠膜選擇性地吸附RNA，而其它雜質(zhì)那么在隨后的步驟中洗去，最后將RNA洗脫下來(lái)。真核生物mRNA的純從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱〔或磁珠〕別離mRNA。可應(yīng)用PromegaPolyATtractmRNA別離系統(tǒng)別離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，參加與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場(chǎng)吸附通過(guò)寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA**RNA的電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度可通過(guò)測(cè)試其OD260來(lái)判斷，OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/mL。檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。分子雜交分子雜交(moleculehybridization)分子雜交是指在分子克隆中的一類(lèi)核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對(duì)分子量大小。根據(jù)其檢測(cè)對(duì)象的不同可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，及由此簡(jiǎn)化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過(guò)程中兩個(gè)不同來(lái)源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過(guò)程。通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。四菌落原位等其它雜交

〔colonyinsituhybridization〕1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測(cè)重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理,對(duì)Southern印跡技術(shù)作了一些修改,提出了菌落原位雜交技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)是直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合,再與特異性DNA探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落。**菌落原位雜交的操作步驟五DNA微陣列分析〔DNAmicroarry〕●又稱(chēng)基因芯片技術(shù)，是一種高通量的斑點(diǎn)雜交技術(shù)。將大量的DNA分子〔一般為50-70nt的寡核苷酸〕固定在支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，然后通過(guò)自動(dòng)化儀器檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)判斷樣品中靶分子的數(shù)量。常采用Cy3和Cy5花菁類(lèi)染料對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，它們的激發(fā)光為橙色和紅色，為便于識(shí)別，在檢測(cè)和分析過(guò)程中常將它們分別標(biāo)記為綠色和紅色，當(dāng)二者等量重疊時(shí)為黃色?！駪?yīng)用：1、檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平或轉(zhuǎn)錄組，特別是檢測(cè)兩個(gè)樣品間的差異表達(dá)譜。2、比擬基因組雜交研究，檢測(cè)基因組中DNA拷貝數(shù)變化。3、檢測(cè)mRNA結(jié)構(gòu)如剪接位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)等。4、基因組重測(cè)序及單核苷酸多態(tài)性〔singlenucleotidepolymorphism,SNP〕分析。**探針標(biāo)記方法：1〕PCR標(biāo)記：采用PCR擴(kuò)增的方法將放射性或非放射性標(biāo)記的dNTP整合進(jìn)入雙鏈PCR產(chǎn)物中。2〕隨機(jī)引物標(biāo)記：采用短鏈隨機(jī)引物指導(dǎo)探針DNA的合成，并完成標(biāo)記的摻入。3〕缺口平移標(biāo)記：采用DNase和DNA聚合酶進(jìn)行探針合成，完成標(biāo)記的摻入。4〕末端標(biāo)記：采用末端轉(zhuǎn)移酶〔TdT〕或多核苷酸激酶向DNA末端添加標(biāo)記性的核苷酸，完成標(biāo)記的摻入。5〕化學(xué)合成法標(biāo)記：采用化學(xué)合成法合成探針的同時(shí)完成標(biāo)記的摻入，常用在寡核苷酸探針的合成上。6〕體內(nèi)合成標(biāo)記：將探針模板克隆到M13噬菌體或其它載體上，在大腸桿菌體內(nèi)合成標(biāo)記性的RNA或DNA探針。注：所有雙鏈探針在雜交之間必須變性成單鏈后才能使用。重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程?！褶D(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過(guò)程?！褶D(zhuǎn)染(transfection):指病毒及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程?！褶D(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌體及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。一選擇受體細(xì)胞的根本原那么1、便于重組DNA分子的導(dǎo)入。2、便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對(duì)重組體進(jìn)行篩選。3、遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對(duì)培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。4、受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。5、平安性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞6、能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對(duì)其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤邕x用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可以防止其對(duì)重組DNA分子的降解破壞作用。7、受體細(xì)胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性。8、具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制等，便于真核目的基因的高效表達(dá)。9、在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。二重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌〔一〕氯化鈣法●1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過(guò)氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國(guó)斯坦福大學(xué)S.Cohen報(bào)道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNA?！裨硎牵杭?xì)菌處于0℃和低滲氯化鈣溶液中，菌細(xì)胞壁和膜通透性增加,菌體膨脹成球形，此時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中DNA形成抗DNase羥基-磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞外表，經(jīng)短暫熱休克(42℃)后，細(xì)胞膜形成許多間隙，DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。●如果感受態(tài)細(xì)胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個(gè)轉(zhuǎn)化子。**獲得合格的感受態(tài)細(xì)胞，要注意以下幾點(diǎn)：1、用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要掌握好細(xì)胞密度，一般在A600為0.5左右為好。2、制備受體細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程在0～4℃進(jìn)行,盡量防止污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對(duì)照受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。3、為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液，如FSB溶液。二〕電穿孔法電穿孔法(electroporation):是指在一個(gè)較大的電脈沖短暫破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層，從而允許DNA等分子通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而后細(xì)胞膜快速?gòu)?fù)原，保持細(xì)胞的完整。這種方法稱(chēng)為電穿孔法。最早用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，1988年，Dower等人成功應(yīng)用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。其根本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過(guò)優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA可以得到109～1012轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化效率將會(huì)有所提高，但同時(shí)導(dǎo)致受體細(xì)胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。研究說(shuō)明，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的組合方式導(dǎo)致50%～70%細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化水平到達(dá)最高。第七章基因操作中的核酸分析技術(shù)第一節(jié)DNA和蛋白質(zhì)相互作用分析1、一、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)〔Gelretardationassay〕又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)〔DNAelectrophoresismobilityshiftassay,EMSA〕，是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)間相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被作為鑒定或別離純化與特定DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。2、二、DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)〔footprintingassay〕是一類(lèi)用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過(guò)足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)一樣，我們也可以參加非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA序列，來(lái)消除特定的“足跡〞，并據(jù)此測(cè)定其核苷酸序列的特異性。3、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)三甲基化干擾實(shí)驗(yàn)、根據(jù)DMS〔硫酸二甲酯〕能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性時(shí)，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。具體操作如下頁(yè)圖所示。四酵母單雜交技術(shù)酵母單雜交技術(shù)最早是1993年由Li等從酵母雙雜交技術(shù)開(kāi)展而來(lái)，通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型檢測(cè)，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。由于酵母單雜交方法檢測(cè)特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件專(zhuān)一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細(xì)胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交(Yeastone-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)道基因表達(dá)的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論根底是：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由物理和功能上獨(dú)立的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-bindingdomainBD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(ActivationdomainAD)組成，因此可構(gòu)建各種基因與AD的融合表達(dá)載體，在酵母中表達(dá)為融合蛋白時(shí)，根據(jù)報(bào)道基因的表達(dá)情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測(cè)中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。缺點(diǎn)：由于插入的靶元件與酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活因子可能發(fā)生相互作用，或插入的靶元件不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，因此往往產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。如果酵母表達(dá)的AD融合蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性，或融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定地表達(dá)，或融合蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊，或者不能定位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，以及融合的Gal4AD封閉了蛋白質(zhì)上與DNA相互作用的位點(diǎn)，那么都可能干擾AD融合蛋白結(jié)合于靶元件的能力，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。五染色質(zhì)免疫沉淀法〔Chromatinimmunoprecitation，ChIP〕是基于體內(nèi)分析開(kāi)展起來(lái)的。根本原理是：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見(jiàn)，隨著ChIP的進(jìn)一步完善，它必將會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。六DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)的新進(jìn)展1、SELEX與核酸適體技術(shù)：核酸適體〔aptamer，源于拉丁語(yǔ)〕指經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。它是一系列單鏈核酸分子，與特異靶分子相結(jié)合，特異性如同抗體一樣，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。核酸適體在生物傳感器、新藥開(kāi)發(fā)以及納米技術(shù)等方面有著廣泛的用途。而體外篩選技術(shù)SELEX是指對(duì)隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo))，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過(guò)程。2、熒光標(biāo)記技術(shù)3、掃描探針顯微鏡技術(shù)4、外表等離子共振技術(shù)第三節(jié)RNA干擾技術(shù)RNAi〔RNAinterference，RNA干擾〕技術(shù)：利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷靶基因的表達(dá)，使細(xì)胞胞出現(xiàn)靶基因缺失、類(lèi)似突變體的表型。dsRNA：雙鏈RNA；siRNA：shortinterferingRNA，小分子干擾RNA。第八章4、PCR的根本原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反響混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-退火-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在適宜條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。5、PCR過(guò)程：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反響原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。6、PCR反響體系〔1、緩沖液Mg2+是DNA聚合酶的激活劑〔2、脫氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。廠商一般提供為10mmol/L或4mmol/L的貯存液，使用濃度為0.2mmol/L左右。〔3、引物PCR引物的設(shè)計(jì)一般原那么〔1.〕引物長(zhǎng)度一般以18～30bp為宜，過(guò)短那么降低特異性，過(guò)長(zhǎng)那么會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的本錢(qián)。〔2.〕解鏈溫度(Tm值)很重要，直接決定了擴(kuò)增中可使用的退火溫度(Ta值)的上下，較高時(shí)特異性增加，但退火效率下降，過(guò)低時(shí)退火效率較高，但特異性下降。兩條引物間的Tm值越接近越好。計(jì)算Tm值的方法很多，簡(jiǎn)易公式為T(mén)m=4×(G+C)+2×(A+T)，適于短于20nt的引物。長(zhǎng)引物的Tm值計(jì)算公式見(jiàn)書(shū)，但比實(shí)際值往往偏低〔3.〕防止引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，防止序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)?！?.〕要防止兩個(gè)引物間特別是3’末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3’末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)?！?.〕G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，防止出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。〔6.〕引物3’末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3’末端為G、C或T時(shí)引發(fā)效率較高，但3’要防止較密的C+C或G+C連排?！?.〕引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求?！?.〕引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性?！?、模板〔5、耐熱性的DNA聚合酶(1〕TaqDNA聚合酶：最常用(2〕TthDNA聚合酶(3〕VentDNA聚合酶4〕PwoDNA聚合酶5〕PfuDNA聚合酶6〕混合DNA聚合酶7、三、PCR反響程序〔1、常規(guī)程序：94℃左右預(yù)變性幾十秒至幾分鐘；94℃左右變性10秒至1分鐘；50-65℃左右退火30秒至1分鐘；20-35個(gè)循環(huán)72℃左右延伸30秒至幾分鐘；72℃左右最后延伸和加尾3-10分鐘；4-25℃保持3分鐘或更長(zhǎng)。(2、退火和延伸溫度：退火溫度Ta值由Tm值決定，多數(shù)情況下Ta采用Tm減去3-5℃，較高時(shí)特異性強(qiáng)但退火效率低，較低時(shí)退火效率增加而非特異擴(kuò)增增加，可根據(jù)實(shí)際研究目的采用高特異性或低特異性退火。當(dāng)退火溫度高到與延伸溫度接近時(shí)，可以將退火和延伸溫度合為一個(gè)，這時(shí)PCR就由三步法變成了兩步法。PCR中其它注意的事項(xiàng)1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開(kāi)，無(wú)菌操作2.設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板、無(wú)模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn)在PCR引物的5’加上根據(jù)需要而設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物內(nèi)部沒(méi)有該切點(diǎn)。二、TA克隆這是目前最通行的PCR產(chǎn)物克隆方法，根本思路是先將PCR產(chǎn)物與特制的T載體進(jìn)行連接重組，測(cè)序證明正確無(wú)誤后，再?gòu)腡載體上亞克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行功能研究四、長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增效率較低，因?yàn)橛性S多降低PCR效率的因素。策略有：一是改進(jìn)PCR緩沖液體系。二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴(kuò)增40kb左右的片段。10、PCR擴(kuò)增位置片段反向PCR(reversePCR)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接DNA片段的序列；用于僅知局部序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物均為平末端，有兩種克隆思路：一是在PCR完成后參加適量的Taq酶并在72℃保溫20-30分鐘，使PCR產(chǎn)物每條鏈的3’末端加上一個(gè)突出的A后進(jìn)行TA克隆。二是將平末端PCR產(chǎn)物與平末端進(jìn)行載體連接克隆：利用接頭的PCR/錨定PCR(anchoredPCR將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與序列中的基因特異引物(gene-specificprimer,GSP)組合后，用于目標(biāo)基因側(cè)翼序列的擴(kuò)增。熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)不對(duì)稱(chēng)PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱(chēng)為限制性引物和非限制性引物,其最正確比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR11、cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAend