大鼠游泳時(shí)間與皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞內(nèi)脂滴變化的觀察

大鼠游泳時(shí)間與皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞內(nèi)脂滴變化的觀察

冷和冷是一種常見的刺激因素，它給人們的日常生活帶來(lái)了許多不便。尤其是對(duì)人們的作業(yè)能力產(chǎn)生嚴(yán)重影響,過(guò)強(qiáng)和長(zhǎng)期的應(yīng)激還會(huì)給機(jī)體帶來(lái)嚴(yán)重的損害。研究表明維生素、氨基酸、微量元素和中藥等,對(duì)減輕低溫環(huán)境下冷應(yīng)激原對(duì)機(jī)體的損害、延長(zhǎng)存活時(shí)間均有重要的意義。因此,篩選具有提高機(jī)體抗冷應(yīng)激原能力的中藥配方,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究,具有重要的實(shí)際意義。本課題組前期研究工作已經(jīng)篩選出具有抗冷應(yīng)激作用的中藥配方。本研究旨在探討該配方抗冷應(yīng)激作用的時(shí)效關(guān)系,以期為實(shí)際應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2月齡雄性Wistar大鼠,體重200±20g,由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2特效藥復(fù)方中藥制劑(由紅景天18%、人參15%、鹿茸15%等七味中藥組成),由本校動(dòng)物科技系臨床獸醫(yī)教研室韋旭斌教授提供。1.2方法1.2.1處理藥物濫用中藥制劑采用醇和水分步提取法制得,使溶液終濃度為每毫升含生藥1g。1.2.2灌胃給藥后游泳時(shí)間測(cè)定h,自由采食飲水。飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為2組,每組9只,分別為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每日上午8～10時(shí)灌胃給藥,給藥劑量10g·kg-1體重。分別于第1天、第2天和第5天給藥后2h,進(jìn)行冷水(水溫10℃)游泳,記錄游泳時(shí)間。游泳后立即斷頭處死,采集大鼠腎上腺。1.2.3冷游泳在水深70cm,直徑50cm玻璃缸內(nèi)進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn),以大鼠沉底20s作為終止時(shí)間。1.2.4組織片2.5%戊二醛和鋨酸雙固定法,進(jìn)行超薄切片,對(duì)腎上腺皮質(zhì)束狀帶進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。1.2.5處理數(shù)據(jù)測(cè)定的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并做t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1游泳時(shí)間各組大鼠冷水游泳時(shí)間見表1,由表1可見中藥配方組和對(duì)照組大鼠冷水游泳時(shí)間在第5天具有顯著差異(P<0.01)。2.2動(dòng)物的應(yīng)激狀態(tài)透射電鏡觀察表明,正常大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞(見圖1)之間伴隨毛細(xì)血管、細(xì)胞較大,細(xì)胞呈多邊形,細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴,直徑在0.5～3.0μm之間。脂滴的數(shù)量與取標(biāo)本時(shí)動(dòng)物的應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。應(yīng)激反應(yīng)越強(qiáng),脂滴數(shù)量越少,脂滴外常圍繞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),脂滴一般不與線粒體接觸。圖中的線粒體多,呈球形,體積也較大,大部分的嵴呈空泡狀,基質(zhì)較透亮?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)呈空泡或分枝的管狀,大部分圍繞線粒體和脂滴排列。冷水游泳后,實(shí)驗(yàn)組腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞內(nèi)脂滴比正常組細(xì)胞內(nèi)脂滴少,線粒體內(nèi)容物減少,線粒體內(nèi)有結(jié)晶出現(xiàn),嵴斷裂甚至消失,基質(zhì)電子密度變低(圖2);對(duì)照組細(xì)胞基質(zhì)電子密度明顯降低,出現(xiàn)空泡樣變化,此為線粒體功能喪失的早期變化(圖1)。3討論3.1增強(qiáng)抗應(yīng)激能力近年來(lái)中藥的研究表明,人參可以提高冷適應(yīng)能力,加速冷適應(yīng)的建立;紅景天可以調(diào)節(jié)低溫條件下正常人體特異和非特異性免疫功能,增強(qiáng)抗寒能力和加速冷適應(yīng)的建立。人參主要成分包括人參皂甙、人參酸、糖類、揮發(fā)油、維生素B1、維生素B2、膽堿、泛酸等,具有較強(qiáng)的提高機(jī)體的抗應(yīng)激原的作用,增強(qiáng)心臟功能,提高機(jī)體代謝和免疫功能,并有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基等作用。以強(qiáng)制性冷水游泳應(yīng)激模型來(lái)模擬冷環(huán)境慢性疲勞,通過(guò)注射人參皂甙提取液能提高正常小鼠和應(yīng)激大鼠神經(jīng)系統(tǒng)興奮性,增強(qiáng)其自發(fā)活動(dòng),延長(zhǎng)游泳時(shí)間,提高體力,并能部分或全部逆轉(zhuǎn)強(qiáng)制性冷水游泳應(yīng)激所致的血清單胺類遞質(zhì)和腎上腺素含量的變化。研究表明腹腔注射人參莖、葉皂甙可明顯降低小鼠在低溫(-9℃)條件下的死亡率。另外,人參皂甙可保護(hù)腦、肝臟組織中過(guò)氧化酶的活性,明顯延長(zhǎng)低壓缺氧以及常壓缺氧條件下小鼠存活時(shí)間,提高存活率。楊義軍等(1994)報(bào)道,人參多糖使小鼠微循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生較明顯的變化,全血粘度降低,微循環(huán)半更新時(shí)間縮短,心肌耗氧指數(shù)增大,外周阻力變小,表明其能夠改變血液循環(huán)功能,間接提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力,但對(duì)局部作用不夠明顯。人參能使體內(nèi)的兒茶酚胺水平增加,從而提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力、免疫功能。紅景天主要成分包括紅景天甙、甙元酪醇、氨基酸、維生素、微量元素和揮發(fā)油等。在低溫條件下紅景天對(duì)機(jī)體的非特異性免疫功能有調(diào)節(jié)作用。尹旭輝等報(bào)道,紅景天是冷環(huán)境的適應(yīng)藥物,可刺激機(jī)體白細(xì)胞介素Ⅱ(IL-2)產(chǎn)生能力,提高NK細(xì)胞的活性和膜白細(xì)胞介素Ⅱ受體(mIL-2R)的表達(dá)水平,使低溫下的免疫功能迅速恢復(fù)正常,增強(qiáng)機(jī)體的抗寒能力。紅景天還可以增強(qiáng)血清LDH活力,降低血液乳酸含量,增加肝糖原、肌糖原的儲(chǔ)備,具有明顯增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力和解除疲勞的作用。高山紅景天醇提物(RSAE)具有明顯的抗缺氧作用。楊義軍等研究表明,高山紅景天能顯著增高冷適應(yīng)過(guò)程中紅細(xì)胞膜中超氧化物歧化酶(SOD)活性以及cAMP和cGMP含量,從而抑制紅細(xì)胞膜丙二醛(MDA)含量的增加,其效果強(qiáng)于刺五加復(fù)方口服液。本研究中的中藥配方以人參、紅景天為主藥,能顯著提高大鼠抗冷應(yīng)激能力。從藥物作用的時(shí)間上看,在用藥后第5天出現(xiàn)明顯作用,優(yōu)于復(fù)合維生素的作用。3.2腎上腺素皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化膽固醇是合成腎上腺皮質(zhì)類固醇的原料,腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的脂滴是貯存膽固醇及酯類的場(chǎng)所。膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)樵邢┐纪悄懝檀技に睾铣傻牡谝徊?此反應(yīng)所需的酶系存在于腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的線粒體膜中,與孕烯醇酮轉(zhuǎn)變?yōu)樵型约霸型D(zhuǎn)變?yōu)樘瞧べ|(zhì)類固醇相關(guān)的酶,存在于束狀帶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜中。冷水游泳后各組腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞內(nèi)脂滴比正常細(xì)胞內(nèi)脂滴較少,說(shuō)明皮質(zhì)酮在冷應(yīng)激時(shí)合成增加。線粒體內(nèi)出現(xiàn)結(jié)晶體,結(jié)晶體可能是糖皮質(zhì)激素合成的有關(guān)酶類,空白對(duì)照組細(xì)胞基質(zhì)電子密度明顯降低,出現(xiàn)空泡樣變化,此為線粒體功能喪失的早期變化。說(shuō)明本中藥配方和維生素復(fù)方均對(duì)腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞線粒體具有保護(hù)作用。3.3對(duì)機(jī)體的作用本實(shí)驗(yàn)前期工作已證實(shí),實(shí)驗(yàn)所選用的中藥中含有多種有效成分,其作用包括:(1)對(duì)垂體—腎上腺功能有刺激作用,刺激腎上腺皮質(zhì)增加分泌皮質(zhì)激素,而不是通過(guò)腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)興奮,其刺激的初始部位可能是垂體前葉。(2)有效成分還能增加肝臟線粒體的氧化磷酸化效率,使機(jī)體充分利用能量物質(zhì),既不過(guò)多消耗機(jī)體的能量物質(zhì),又能保證機(jī)體對(duì)能量物質(zhì)的需求,從而提高機(jī)體的抗寒能力。(3)在冷應(yīng)激時(shí),耗氧量最大,脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng),自由基產(chǎn)生增多,可對(duì)細(xì)胞膜和DNA造成損傷。中藥中含有機(jī)酚酸類化合物,能夠消除自由基,減輕脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體的損傷。(4)中藥對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用,