豬繁殖與呼吸綜合征病毒與細(xì)胞免疫

豬繁殖與呼吸綜合征病毒與細(xì)胞免疫

1987年，豬繁殖和呼吸綜合征（prrs）首次在美國爆發(fā)，并迅速擴(kuò)散到世界各地。該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),1991年在荷蘭首次分離到,以后在美國、加拿大、歐洲國家、中國以及日本陸續(xù)分離到。根據(jù)形態(tài)學(xué)及生化特性將其歸入動(dòng)脈炎病毒科,該病毒為有囊膜的單股正鏈RNA病毒,含有8個(gè)讀碼框。PRRSV感染豬的免疫系統(tǒng)是一把雙刃之劍,一方面,PRRSV嗜好在肺巨噬細(xì)胞中大量復(fù)制,因此它與宿主疾病的進(jìn)程及免疫系統(tǒng)的變化密切聯(lián)系在一起,復(fù)制的直接結(jié)果是導(dǎo)致宿主發(fā)生免疫調(diào)節(jié)紊亂,引起繼發(fā)感染或加速其它疾病進(jìn)程,另一方面,該病毒又刺激宿主在感染后產(chǎn)生保護(hù)性免疫,使動(dòng)物免受再次感染。因此,宿主的免疫系統(tǒng)在疾病發(fā)展和防御方面起到雙重的作用。在這種雙重作用中,既存在著細(xì)胞免疫因素,又存在體液免疫因素,本文就PRRSV與其引起的細(xì)胞免疫之間的相互作用進(jìn)行綜述。1細(xì)胞免疫的分子基礎(chǔ)1.1t細(xì)胞抗原受體T細(xì)胞是一類不均一的細(xì)胞群體,主要包括輔助性T細(xì)胞(Th)、抑制性T細(xì)胞(Ts)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)T細(xì)胞(Td),前兩者主要擔(dān)負(fù)著細(xì)胞免疫功能,后兩者是免疫效應(yīng)細(xì)胞。Th細(xì)胞又分為Th1和Th2兩個(gè)亞類。T細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生的保護(hù)性免疫過程為:T細(xì)胞首先對表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞(APC)表面MHC分子上的抗原肽段進(jìn)行識(shí)別,然后T細(xì)胞增生,通過APC產(chǎn)生效應(yīng)功能。這些作用是通過T細(xì)胞與其受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。T細(xì)胞抗原受體(TCR)是一種異二聚體表面糖蛋白,它們有兩類:TCRαβ和TCRγδ,后者僅存在于一少部分T細(xì)胞亞類中。T細(xì)胞通過受體識(shí)別與MHCⅠ類或MHCⅡ類分子相關(guān)的抗原,識(shí)別后分別表達(dá)CD4和CD8。豬外周血液中具有CD4和(或)CD8表面抗原標(biāo)志的TCR為分子量為46～48ku的異二聚體,即TCRαβ,它的恒定區(qū)有1個(gè)α鏈,2個(gè)β鏈,TCRγδ至少有3個(gè)γ鏈和1個(gè)δ鏈。1.2cd8分子的功能早在1881年,Chievitz就指出,豬具有倒轉(zhuǎn)的淋巴結(jié)結(jié)構(gòu),髓質(zhì)位于皮質(zhì)的外面。這種特殊的淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)決定它有一些特殊的CD4、CD8T細(xì)胞亞群。豬與其它動(dòng)物的外周血液中T淋巴細(xì)胞成分存在著明顯的差異,同時(shí)也是所有動(dòng)物中T細(xì)胞亞群最復(fù)雜的動(dòng)物。在豬的外周血T淋巴細(xì)胞中,除了CD4-CD8+的Tc和CD4+CD8-的Th外,CD4-CD8-和CD4+CD8+T細(xì)胞也占有相當(dāng)?shù)谋壤?CD4+和CD8+表達(dá)細(xì)胞(CD4SP+CD8SP+CD4CD8DP)可以達(dá)到68%,其中,CD4+細(xì)胞占23±2%,CD8+細(xì)胞占35±4%,CD4+CD8+細(xì)胞占6±2%。所有CD4+T淋巴細(xì)胞有很高的CD5抗原多樣性,CD4-CD8-T細(xì)胞亞群包括大多數(shù)含有T淋巴細(xì)胞受體(TCRγδ)的T淋巴細(xì)胞,其特征是CD5表達(dá)很弱,CD4-CD8+T淋巴細(xì)胞有MHC限制性細(xì)胞毒性功能。所有CD4+T細(xì)胞屬于富含CD2抗原性亞群。CD8和CD4或者通過清除病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能,或者通過分泌具有抗病毒特性的細(xì)胞因子產(chǎn)生保護(hù)性免疫。CD4和CD8分子與MHC之間的相互作用對于T細(xì)胞的激活及T細(xì)胞在對抗原進(jìn)行應(yīng)答過程中起關(guān)鍵性的作用,其中CD8糖蛋白充當(dāng)黏附分子的作用結(jié)合到MHCI分子的α3區(qū);同時(shí)也作為一個(gè)協(xié)同受體調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白激酸p56lck的激活以及參與T細(xì)胞受體介導(dǎo)的免疫原激活。CD8分子有一定的異源性,它或者以αβ二聚體形式存在,或者以αα形式存在。CD8分子的功能由α鏈單獨(dú)即可完成,而β鏈通過改變CD8的生理結(jié)構(gòu)及與MHC之間的相互作用來起調(diào)節(jié)作用。所有胸腺細(xì)胞和成熟T細(xì)胞的前體都存在于小的CD4-CD8-的皮層胸腺細(xì)胞中,CD4+CD8+皮層細(xì)胞的出現(xiàn)早于CD4+或CD8+成熟細(xì)胞。CD4+CD8+T細(xì)胞為豬血液所特有,這些細(xì)胞隨著病毒(包括偽狂犬病病毒)的攻擊或年齡的增長而增加,它們大多為記憶性T淋巴細(xì)胞,這一過程受CD4的調(diào)節(jié)。CD4+CD8+細(xì)胞具有功能受體,似乎處于不活動(dòng)狀態(tài),其表型是固定的,在培養(yǎng)過程中它們同時(shí)表達(dá)CD4和CD8,但不表達(dá)CD1。CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞中CD8表達(dá)的水平低于CD8單獨(dú)表達(dá)的水平。體外研究表明,CD4+CD8-T淋巴細(xì)胞可以通過記憶病毒抗原的激活而成為雙陽性細(xì)胞。由于它們能夠記憶病毒抗原,該亞群又可叫做記憶性T細(xì)胞。CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞有能力對抗原刺激尤其是非最佳抗原刺激發(fā)生反應(yīng),因而有助于識(shí)別抗原。CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞為無功能細(xì)胞亞群,又可分為CD2-CD4-CD8-和CD2+CD4-CD8-兩個(gè)亞群,前者占大多數(shù),它們不能形成E玫瑰花環(huán)及抗免疫球蛋白環(huán)。這個(gè)亞群含有大量具有TCRγδ表面標(biāo)志的T細(xì)胞,缺少CD2、CD4、CD8、slgM、FcR和MHCⅡ類分子,但含有MHCⅠ、CD25、CD44和CD18分子,它有3個(gè)不同的TCRγδ,其δ鏈分子量均為40ku,但γ鏈不同,分子量為38ku的γ鏈主要在從外周血中獲得的CD2-CD4-CD8-T細(xì)胞中表達(dá),分子量為37ku的γ鏈在外周血和淋巴組織中均勻分布,分子量為46ku的γ鏈主要在淋巴組織中的CD2+CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞中表達(dá)。與CD4-CD8-T細(xì)胞相比,CD4+T淋巴細(xì)胞亞群更具有同一性,根據(jù)CD8表達(dá)情況又可分為CD4+CD8+和CD4+CD8-兩個(gè)亞群,CD4+CD8-T淋巴細(xì)胞為Th,CD4+CD8+為雙陽性細(xì)胞,是豬免疫系統(tǒng)所特有的,這兩種細(xì)胞亞群在用突變原刺激后均可增生。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,這兩個(gè)亞群為CD4-CD8+CTL前體提供Th細(xì)胞的功能,MHCⅡ類抗原在CD4+CD8+Th細(xì)胞中協(xié)同表達(dá),其中CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群具有病毒特異性Th記憶細(xì)胞功能。CD8分子在MHCⅠ限制性T淋巴細(xì)胞上表達(dá),是高度T細(xì)胞特異性的二聚體分子,它既以同源二聚體形式存在,又以異源二聚體形式存在。CD8分子在抗原識(shí)別MHCⅠ在分子非多肽部分期間相互作用,可以增加多肽結(jié)合到靶分子上的活力。在外周血中,CD8細(xì)胞分為低表達(dá)和高表達(dá)兩個(gè)亞群,研究認(rèn)為,CD8低表達(dá)細(xì)胞可分為αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞,即自然殺傷性細(xì)胞。CD8高表達(dá)細(xì)胞為Tc細(xì)胞。不同免疫狀態(tài)的豬CD8低表達(dá)和CD8高表達(dá)細(xì)胞比例不同。CD4-CD8+細(xì)胞包括NK細(xì)胞,具有抗腫瘤細(xì)胞的自發(fā)的細(xì)胞毒活性及MHC限制性細(xì)胞毒活性的T細(xì)胞前體,它的特點(diǎn)是CD8表達(dá)的情況不同,所有CD8+T淋巴細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD2抗原,但根據(jù)表達(dá)CD5情況不同分為CD5+CD4-CD8+和CD5-CD4-CD8+兩個(gè)亞類,前者為CD8高表達(dá)細(xì)胞,后者為CD8低表達(dá)細(xì)胞,Yang等選擇了與CD8具有不同反應(yīng)性的單克隆抗體,其中,單克隆抗體CD8.1和CD8.2與CD8α鏈反應(yīng),而單克隆抗體CD8.3與CD8.4則與CD8γδ鏈反應(yīng)。組織分布研究表明CD8+胸腺細(xì)胞和外周CD8αβT細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD8α和CD8β鏈。而外周CD4+CD8+αβ_T細(xì)胞,CD8γδ細(xì)胞及NK細(xì)胞只表達(dá)CD8α鏈,功能研究顯示CD8αβ_T細(xì)胞是CD3介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的效應(yīng)細(xì)胞。不同表型的T細(xì)胞數(shù)量和功能的改變,對于疾病的早期診斷、預(yù)后和尋求更為合理的免疫防治措施提供了新的強(qiáng)有力的依據(jù)。在病毒感染后,由于病毒的復(fù)制可以導(dǎo)致CD4+細(xì)胞數(shù)量減少,因此CD4+細(xì)胞的變化代表著疾病的進(jìn)程,可以確定由病毒感染導(dǎo)致的免疫缺陷程度。CD4+T細(xì)胞比例越小,患者越有可能發(fā)生嚴(yán)重感染,為此,預(yù)后及臨床決斷已建立于CD4+水平上。豬外周血中有高比例的CD4+CD8+特殊的細(xì)胞亞群,低比值的CD4+細(xì)胞/CD8+細(xì)胞,這些特點(diǎn)有助于更深入地了解CD4+和CD8+在抗原識(shí)別和細(xì)胞免疫中的功能。1.3第二,基于免疫干擾IFN是一組可溶性糖蛋白,由Thl細(xì)胞產(chǎn)生,分子量為20～100ku他們分為三大類即白細(xì)胞干擾素、纖維母細(xì)胞干擾素和免疫干擾素。其中免疫干擾素是由T細(xì)胞產(chǎn)生的,又叫γ干擾素。干擾素主要由病毒,尤其是RNA病毒產(chǎn)生的。它具有抗病毒的作用,但對病毒沒有直接滅活作用,它不能阻止病毒的吸附、進(jìn)入細(xì)胞及釋放。當(dāng)IFN與細(xì)胞表面受體結(jié)合后,共同內(nèi)化,觸發(fā)一系列酶反應(yīng),解除抗病毒蛋白基因抑制物的作用,使抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄特定的mRNA,翻譯出抗病毒蛋白質(zhì),該物質(zhì)抑制病毒mRNA的翻譯,從而抑制了病毒的合成。2cd8和cd4分子對cre免疫調(diào)節(jié)的作用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)對于清除大多數(shù)病毒是十分重要的。將T細(xì)胞亞群進(jìn)行標(biāo)記然后克隆到很多病毒如流感病毒中研究其作用,結(jié)果已經(jīng)得到共識(shí),因此,由T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位對于設(shè)計(jì)亞單位疫苗來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)非常重要。CD8和CD4分子在保護(hù)性免疫中均起重要的作用,CD8分子通過細(xì)胞毒作用清除病毒感染的細(xì)胞,CD4分子則分泌具有抗病毒特性的細(xì)胞因子。因此,識(shí)別T細(xì)胞的抗原表位,是設(shè)計(jì)接種對策來引入CMI反應(yīng)的非常有利的工具,細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(CMI)保護(hù)宿主免受病毒感染,PRRSV感染可以在體外誘導(dǎo)針對全病毒的CMI反應(yīng)。2.1prrsv感染克氏原螯蝦t細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)在病毒性疾病中,細(xì)胞免疫的一個(gè)重要作用是清除病毒和預(yù)防疾病,這已經(jīng)被大量的資料所證實(shí)。同時(shí)PRRSV分離株的抗原多樣性可能也起源于毒株特異性的免疫反應(yīng)。為了探討PRRSV如何引發(fā)CMI,研究人員已經(jīng)進(jìn)行了大量研究來建立檢測針對PRRSV抗原特異性CMI的方法,通過T細(xì)胞反應(yīng)識(shí)別抗原已經(jīng)成為抗病毒感染十分重要的手段,利用該反應(yīng)已經(jīng)證明PRRSV感染后可以引起淋巴細(xì)胞增生和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)。因此目前采用體外T細(xì)胞增生的方式和體內(nèi)DTH方式來建立檢測細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法。在體外利用病毒抗原在不同時(shí)期刺激PRRSV感染豬和對照豬的外周血單核細(xì)胞來研究T細(xì)胞的增生反應(yīng),并通過吸收3H_胸腺嘧啶的量來確定T細(xì)胞的增殖量。在PRRSV感染的動(dòng)物體內(nèi)針對PRRSV的T細(xì)胞增生反應(yīng)劇烈,這一過程是PRRSV特異性的和病毒滴度依賴性的,CD4的抗體可以阻斷該增生反應(yīng),所以這一增生反應(yīng)主要由CD4+T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)。Nielsen報(bào)道PRRSV感染豬后CD4+和CD8+細(xì)胞的百分率急劇下降,CD4+細(xì)胞在第3、7和第15天與對照組差異顯著,CD8+細(xì)胞在第3天時(shí)與對照組差異極為顯著,但逐步升高,到第10天雖然差異不顯著但已超過感染前水平。Shimizu等報(bào)道,SPF豬在人工感染PRRSV后第3～28天CD4+/CD8+比感染前顯著下降。有報(bào)道PRRSV感染后28天出現(xiàn)抗原特異性的淋巴細(xì)胞增生,在第49天達(dá)到高峰,第77天出現(xiàn)下降,重復(fù)感染后細(xì)胞增生反應(yīng)的幅度加大。這種增生反應(yīng)可被抗CD4+及MHCⅡ類抗原的抗體所阻斷,表明這種增生反應(yīng)是CD4+T淋巴細(xì)胞依賴性的,PRRSV感染可以產(chǎn)生Thl細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),其感染程度也受CD8反應(yīng)的影響。LopezFuertes等研究了體外感染PRRSVLV株后恢復(fù)期的CMI反應(yīng)。在PRRSV攻擊后第4周開始,這些豬的外周血單核細(xì)胞(PBMC)特異性地增加,并持續(xù)3周左右。利用阻斷單抗研究表明,這些增生反應(yīng)是在SLA_Ⅱ類分子的參與下,依賴于CD4+細(xì)胞的。利用PRRSV刺激細(xì)胞3周左右,可以顯示出CD4+CD8+和CD4-CD8+亞群及表達(dá)TCRγδ受體的T細(xì)胞在感染的細(xì)胞內(nèi)增加,而這一時(shí)期CD4+CD8-的細(xì)胞減少。在自然感染PRRSV的豬體內(nèi)可以看到淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生了變化,外周血中CD4+/CD8+細(xì)胞的比例明顯降低,但由于PRRSV常常與繼發(fā)感染有密切的關(guān)系,因此,PRRSV并非總是誘導(dǎo)產(chǎn)生這樣的變化。在感染的早期和康復(fù)期,CD4+CD8+細(xì)胞比例的下降分別是由于CD4+細(xì)胞數(shù)目的減少和CD8+細(xì)胞數(shù)量的增加引起的。而由于毒株的來源及毒力的差異,所以不同報(bào)道結(jié)果也不盡一致,有的甚至產(chǎn)生相反的結(jié)果,如Zhou等報(bào)道,PRRSV可以引起小豬CD4+細(xì)胞數(shù)量增加,而CD8+細(xì)胞數(shù)量減少。2.2小鼠海馬淋巴結(jié)和細(xì)胞適應(yīng)株P(guān)RRSV可以引起繼發(fā)感染,推測PRRSV逃避宿主防御機(jī)制之一是通過阻斷一種抗病毒蛋白的激活,或抑制豬體內(nèi)干擾素(IFN)的活性。在感染PRRSV野毒株SDSU_23983的豬淋巴結(jié)和肺部有IFN_γmRNA的表達(dá),用IFN_γ預(yù)處理的MARC_145細(xì)胞可以以劑量依賴的方式并在較低濃度下抑制野毒株和細(xì)胞適應(yīng)株的繁殖。IFN_γ對病毒復(fù)制的效應(yīng)包括感染細(xì)胞和病毒量下降,單個(gè)細(xì)胞中RNA的含量也降低。2_氨基嘌呤(2_AP)是一種dsRNA介導(dǎo)的蛋白激酶(PKR)抑制劑,加入2_AP后可以部分地恢復(fù)病毒的復(fù)制,同時(shí)將每個(gè)細(xì)胞中的mRNA恢復(fù)到接近正常細(xì)胞的水平,表明PKR抑制病毒PNA的合成。2.3prrsv在豬細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)在體外利用ORF6產(chǎn)物誘導(dǎo)的T細(xì)胞增生反應(yīng)