基因工程目的基因的制備

6學(xué)時教學(xué)重點：基因組文庫、cDNA文庫及篩選文庫方法的原理及操作規(guī)程。第一節(jié)目的基因的制備第二節(jié)目的基因的別離第四章目的基因的制備與別離1.第一節(jié)目的基因的制備一、直接別離法1、限制性核酸內(nèi)切酶酶切別離法序列基因.酶切后別離與適當(dāng)載體重組轉(zhuǎn)入受體。2.plasmidBamHIBamHIPlasmid-13.2、物理化學(xué)法密度梯度離心法：不同大小的DNA被分開，再用探針雜交檢驗。單鏈酶解法：GC間三鍵，AT間雙鍵，適當(dāng)溫度解開AT多的鏈，GC多的鏈未解開，用單鏈酶降解單鏈，剩下GC鏈。分子雜交法：利用探針分子通過分子雜交固定相關(guān)基因。是基因在開展初期所用的方法4.3、雙抗體免疫法蛋白質(zhì)已別離純化，并制備了它的抗體1。mRNA合成蛋白質(zhì)時與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合形成聚合體。別離這種蛋白質(zhì)聚合體，與制備好的抗體1進行免疫反響。再參加抗體1的抗體進行免疫反響。別離這種反響產(chǎn)物，再去除蛋白質(zhì)，剩下mRNA，反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA。5.6.去蛋白提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNA7.二構(gòu)建基因組文庫從生物組織細胞提取出全部DNA，將DNA酶切成預(yù)期大小的片段，將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入受體細菌或細胞，每一個細胞接受了含有一個基因組DNA片段,許多細胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體.8.1、基因文庫的概念某種生物的基因組的遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中，這個群體即為這種生物的基因組DNA文庫〔genomicDNAlibrary〕9.2、基因文庫的大小一個理想的基因組文庫應(yīng)該是在克隆群體中包含完整基因組的所有DNA序列。DNA片段要有足夠的長度，保證含有某個完整的基因序列。估算：基因組文庫的克隆數(shù)目=基因組DNA總長/DNA片段的平均長度。如：3×106kb/15kb=2×105

10.經(jīng)驗值約比理論值大4.5倍?；蚪M越大，包含的克隆數(shù)越多，反之越少。11.3、構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫的步驟對DNA進行隨機切割，以獲得一定大小的含目的基因的DNA片段。部分消化基因組DNA20kb的DNA片段12.切割方法：物理學(xué)方法：機械力和超聲波。生物化學(xué)法：酶切為滿足切割的隨機性，一般采用識別序列為4bp的限制酶。如Sau3AI或MboI等切后的片段可直接與BamHI酶切的載體連接。切割后通過凝膠電泳或密度梯度離心，回收一定大小范圍的DNA片段。13.與λ噬菌體克隆載體連接重組。噬菌體載體的酶切：兩臂與中央片段相連處有SalI,BamHI和EcoRI酶切位點。兩臂中原有的酶切位點被除去。采納BamHI，因為該酶切產(chǎn)生的粘性末端與Sau3AI或MboI切割末端結(jié)構(gòu)一樣，采用Sau3AI或MboI酶解產(chǎn)生的DNA片段可直接與噬菌體的BamHI酶切位點連接。BamHI切割載體后，電泳或離心將兩臂與中央片段別離，回收兩臂。左臂右臂中央片段14.在T4DNA連接酶的作用下載體兩臂與外源DNA片段連接。15.BamHIsitesLeftarmRightarmCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收16.重組DNA分子在體外包裝成噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)染宿主后鋪板篩選培養(yǎng)，即可得到某種生物的基因組文庫。17.14/31重組的噬菌體體外包裝18.〔1〕、用Cosmid作載體構(gòu)建基因組文庫的優(yōu)點：可容納更大片段〔30-45kb〕，文庫中所需克隆數(shù)少。載體本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切圖譜。4、構(gòu)建Cosmid質(zhì)粒基因組文庫19.〔2〕、缺點：篩選困難：雜交檢測難度大，攜帶外源片段大，復(fù)制困難，拷貝數(shù)少。重組效率低：大片段易出現(xiàn)機械性斷裂而不具備粘性末端。文庫不易貯存：噬菌體的重組DNA群體比含有Cosmid質(zhì)粒的細菌菌落易貯存。20.〔3〕、基因文庫的構(gòu)建過程與噬菌體載體文庫的過程大致相似，區(qū)別有在外源DNA片段的別離要特別小心，防止斷裂。載體處理時只須酶切，不須進一步別離酶切產(chǎn)物，去除中央片段。但酶切后要用堿性磷酸酶去5`磷酸防止環(huán)化。21.連接重組時，載體量高出外源片段的10倍，保證外源片段最在限度地與載體連接。包裝后的重組顆粒轉(zhuǎn)染宿主時，在37度預(yù)吸附20min，參加1ml培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)45min，再鋪板，培養(yǎng)后出現(xiàn)的是菌落，不是噬菌斑。22.YAC：酵母人工染色體適合克隆長達數(shù)百kb的大片段。常用的YAC載體為pYAC4。首先，用BamHIEcoRI雙酶切載體，形成雙臂，回收兩臂。其次，制備生物完成DNA，用低濃度EcoRI局部消化，純化后與YAC連接。然后轉(zhuǎn)化去壁的酵母細胞，并進行篩選。5、構(gòu)建YAC基因組文庫23.23/31外源基因EcoRI部分消化基因組DNADNA片段24.基因組很大，有重復(fù)序列和非編碼序列。通常表達基因占15%，產(chǎn)生約15000種mRNA。從mRNA別離目的基因更容易。可把mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，從中別離目的基因。三、cDNA文庫的構(gòu)建及目的基因的別離25.1、cDNA基因文庫的概念〔1〕、某生物基因組轉(zhuǎn)錄mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為該生物的cDNA文庫。26.〔2〕、缺點：只反映mRNA所攜帶的信息。不能反映內(nèi)含子、啟動子和終止子及核糖體識別mRNA相應(yīng)的序列。只包含特定組織、特定發(fā)育階段的基因。27.〔3〕、優(yōu)點：A、mRNA為材料，特別適用于RNA病毒。B、克隆數(shù)少，篩選比較簡單。C、假陽性出現(xiàn)概率小。出現(xiàn)假陽性那么有意義，可證明其它片段上也出現(xiàn)該基因序列。D、cDNA中無內(nèi)含子序列可適用于原核生物的直接轉(zhuǎn)化入表達。F、通過與基因組DNA文庫比較，可用于分析真核基因結(jié)構(gòu)、組織和表達。28.〔4〕、分類：表達型：采用表達載體構(gòu)建，插入的cDNA片段可表達產(chǎn)生蛋白，具有抗原性或生物活性。常用的：λgt11cDNA文庫適用于蛋白質(zhì)氨基酸序列未知的，不能采用核苷酸探針篩選的基因而用抗體或化合物進行篩選。29.非表達型cDNA文庫：適于采用核苷酸探針進行雜交篩選的目的基因的別離研究。常用的：λgt10cDNA文庫核苷酸探針可從局部蛋白質(zhì)序列中推測，人工合成寡核苷酸探針。30.根據(jù)載體不同分為：質(zhì)粒cDNA文庫：包含克隆數(shù)少，適于高豐度的mRNA噬菌體cDNA文庫：包含克隆數(shù)多，適于低豐度的mRNA。31.2、cDNA文庫的構(gòu)建包括以下幾步:細胞總RNA的制備及mRNA的別離cDNA第一條鏈的合成雙鏈cDNA的合成cDNA與載體的連接噬菌體顆粒的包裝轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。32.〔1〕、別離細胞總RNA，純化出mRNA。tRNA、rRNA和mRNAmRNA占總RNA的1-5%，種類繁多，分子大小不一。顯著特征：3`端有poly(A)。用Oligo(dT〕結(jié)合在纖維素柱上，帶poly(A)的mRNA可結(jié)合在柱上，而其它RNA那么不能，從而使其與其它RNA分開。33.〔2〕、以mRNA分子為模板合成cDNA第一鏈：以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用適當(dāng)?shù)囊锖铣傻?。引物：oligo(dT)引物：從3`端開始，適于較短的mRNA。隨機引物：在mRNA的任何位置開始，適于較長的mRNA。34.〔3〕、雙鏈cDNA的合成：A、自我引導(dǎo)合成：用堿處理使mRNA-DNA雜交分子中的mRNA降解，cDNA第一鏈解離，單鏈cDNA3`端自身環(huán)化，形成一個發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在DNA聚合酶的作用下產(chǎn)生一個完整的發(fā)夾結(jié)構(gòu)雙鏈cDNA，S1核酸酶將發(fā)夾切去，即可。缺點：S1酶會多切，而喪失信息。35.AAAAAAAAAATTTTTAAAAATTTTT堿處理后，S1核酸酶引物結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶36.B、大腸桿菌RNaseH酶降解取代法：RNaseH酶可識別mRNA-DNA雜交分子，將其中的mRNA模板消化成許多短片段。這些短片段可作為引物，在DNA聚合酶作用下合成第二鏈cDNA，通過DNA連接酶將缺口補平。37.AAAAAAAAAATTTTTAAAAATTTTTRNaseHDNA聚合酶+連接酶引物結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶38.C、oligo(dG)寡聚引物引導(dǎo)法在第一鏈cDNA分子尚未與mRNA別離之前，在其3`端加上一段oligo(dC)序列再堿性蔗糖梯度離心處理，使mRNA降解，回收全長cDNA再以互補oligo(dG)序列作引物，引導(dǎo)第二鏈合成。此法無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不用S1核酸酶。39.AAAAAAAAAATTTTT堿性蔗糖梯度離心，水解RNA回收cDNAOligo(dG)DNA聚合酶引物結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶TTTTTCCCCC5`3`AAAAACCCTTTTTCCCCC5`5`5`CCCCCGGGGGTTTTT40.D、PCR法：以cDNA的第一鏈為模板，設(shè)計一組引物，用PCR擴增獲得雙鏈cDNA。41.AAAAAAAAAATTTTTAAAAACCCTTTTT堿性蔗糖梯度離心，水解RNA回收cDNA引物結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶CCCCCTTTTTCCCCC5`3`5`5`5`SalCCCCCSalGGGGGTTTTTTTNotI加PCR引物SalI-GGGGGTTTTTTT-NotIAAAAAANotI42.〔4〕、將cDNA雙鏈重組到質(zhì)?；蚴删w上導(dǎo)入大腸桿菌宿主細胞。A、標準方法將cDNA甲基化。防酶切B、末端轉(zhuǎn)移酶加尾或加適當(dāng)?shù)你暯宇^與適當(dāng)方法處理的載體連接。C、將重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主。常用的載體是λgt10/λgt101，一般不用轉(zhuǎn)化效率低的質(zhì)粒。43.AAAAAATTTTTTTEcoRI位點cDNAEcoRI甲化酶AAAAAATTTTTTTAAAAAATTTTTTTEcoRI銜接物DNA連接酶EcoRI酶切AAAAAATTTTTTTEcoRI位點EcoRI酶切cos位點cos位點cos位點cos位點連接后體外包裝感染大腸桿菌44.45.表達型cDNA文庫的構(gòu)建演示2446.3、mRNA豐度與cDNA文庫大小總mRNA中某種基因的mRNA數(shù)量越多，cDNA文庫中貯存該基因工程概率越大，越容易別離。高豐度的mRNA構(gòu)建較小的cDNA文庫即可，反之，那么構(gòu)建大的文庫。文庫大小的理論公式：cDNA克隆數(shù)=細胞總mRNA數(shù)/某種mRNA的拷貝數(shù)細胞總mRNA數(shù)為500500個某種mRNA的拷貝數(shù)3500文庫最小為500500/3500=143個47.經(jīng)驗值是理論值的4.5倍左右48.四、利用PCR擴增目的基因采用PCR進行DNA的克隆省時、省力，但要求對待擴增的DNA片段的序列必需，至少要求DNA片段的兩端約20bp序列是的。PCR的有以下幾種類型：49.1、套式PCR兩對引物擴增同一樣品的方法。從一個DNA模板的同一區(qū)域擴增出不同長度的片段而設(shè)計。外側(cè)引物內(nèi)部引物50.2、反向PCR酶切線性DNA模板連接成環(huán)，或加上接頭后再連接成環(huán)。用另一種酶切環(huán)中序列上的酶切位點。利用序列設(shè)計引物PCR擴增出未知序列。51.序列未知序列未知序列用限制性內(nèi)切酶1去切連接環(huán)化序列中有1個限制性內(nèi)切酶2的位點酶2切序列序列PCR52.3、長程PCR常規(guī)PCR擴增幾kb長程可擴增10kb聚合酶：LATaq酶，EXTaq酶。模板純度和完整性高引物長度30-35bp〔常規(guī)20bp〕，濃度為0.1-1mmol/L〔常規(guī)：0.2-1μmol/L〕53.反響程序：94℃1min，98℃20s68℃15min(復(fù)性及延伸)30循環(huán)54.4、反轉(zhuǎn)錄PCRRT-PCR提取RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以cDNA為模板進行PCR擴增。55.五、人工化學(xué)合成

序列計算機控制的全自動核酸合成儀。56.第二節(jié)目的基因的別離從基因文庫中別離。57.一、功能克隆1、根據(jù)特異蛋白別離目的基因方法一：別離特異蛋白測定氨基酸序列，推測基因核苷酸序列。合成核苷酸探針。篩選基因文庫58.設(shè)計的探針最短15-16bp，通常17-20bp。由于遺傳密碼的簡并性，多數(shù)氨基酸有2種或多種遺傳密碼，一種氨基酸順序存在多種可能的DNA順序。為了獲得全部可能的順序，通常要合成一組混合的核苷酸探針，其中只有一條是和目的基因完全互補，在篩選時可能出現(xiàn)多個假陽性反響。59.“猜測體〞探針：一條或很少的幾條。制備探針時，選擇密碼子簡并性盡可能少的蛋白質(zhì)順序，或者根據(jù)不同生物密碼子使用頻率的差異加以推測。60.方法二：將別離的特定蛋白作為抗原，免疫動物制備抗體。用特異的抗體篩選含目的基因的表達型文庫。61.本卷須知：文庫是表達型，有表達的蛋白與抗體反響。一般以融合形式表達目的基因。將cDNA插入到細菌基因的下游，使細菌的基因與插入基因相連，表達時生生一個融合蛋白，比產(chǎn)生天然蛋白要穩(wěn)定，也可產(chǎn)生高水平的表達。必須考慮cDNA在表達載體中的方向和閱讀框架問題，以保證目的基因的正確表達。62.2、功能互補法克隆基因。將重組DNA分子導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的受體細胞，然后將此受體細胞在缺少所需要的營養(yǎng)底物的根本培養(yǎng)基培養(yǎng)。只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補基因的受體才會長成轉(zhuǎn)化菌落。63.二、序列克隆法1、根據(jù)基因序列別離目的基因.利用基因中局部保守序列設(shè)計合成探針，篩選基因文庫獲得全序列。64.探針雜交覆蓋膜印跡取下膜雜交位點與菌落比對65.2、表達序列標簽法表達序列標簽〔expressedsequencetag，EST〕：指基因序列中一段能特異地標記或表征基因的序列，它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其他基因的差異，長度為100-150bp。利用EST尋找新基因的策略稱表達序列標簽法。66.根本步驟：從組織特異性或細胞特異性的cDNA文庫中隨機挑選克隆，進行末端測序〔測定400bp〕。通過對GenBank、EMBL或其他核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)機檢索，可以檢測出所測定序列及其對應(yīng)的多肽氨基酸序列。將檢測的序列與基因庫中的基因進行同源性比較，可檢測到許多基因，還可以發(fā)現(xiàn)許多新的未知基因。最后，通過基因文庫的篩選或PCR技術(shù)別離目的基因。67.三、差異雜交法1、適用范圍：適用于在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達的基因以及受生長因子調(diào)節(jié)的基因。適用于以特殊處理誘導(dǎo)表達的基因。68.抗病煙草感病煙草別離mRNA別離mRNA構(gòu)建cDNA文庫轉(zhuǎn)入E.coli.反轉(zhuǎn)錄合成探針反轉(zhuǎn)錄合成探針雜交雜交復(fù)印到兩張硝酸纖維素膜上分別與兩種探針雜交目的基因克隆69.四、減法雜交技術(shù)又稱減數(shù)雜交。70.待去除的一種組織或狀況下的mRNA稱為“驅(qū)動mRNA〞〔如不抗病水稻的mRNA〕，以此為模板，以oligo(dT)25——流動磁珠〔結(jié)合在流動磁珠上的oligo(dT)25〕為引物合成驅(qū)動cDNA。另一種組織或狀況下所含有需要保存的mRNA稱為“目的mRNA〞〔抗病水稻中的抗病基因〕，以此為模板合成目的cDNA雙鏈71.將目的cDNA雙鏈加到過量的驅(qū)動cDNA單鏈——流動磁珠中進行分子雜交。能與驅(qū)動cDNA雜交的目的cDNA分子通過驅(qū)動cDNA結(jié)合在磁珠上，未雜交的分子被別離出來。其中應(yīng)包括抗病基因的cDNA。72.驅(qū)動cDNA-磁珠目的cDNA雙鏈雜交建庫除去73.五、DifferentialdisplayofmRNA

mRNA差異顯示技術(shù)原理與步驟74.〔4種核苷酸，兩兩組合共有4*4=16種如下：〕AAAUACAG，UAUUUCUG，CACUCCCG，GAGUGCGG其中Poly(A)上游不包含poly(A)的兩個核苷酸組合有12種。5`-AUGCCCGUAUACGGUAGAAAA………AAAA-3`5`-AUGCCCGUAUACGGUAGUAAA………AAAA-3`5`-AUGCCCGUAUACGGUAGCAAA………AAAA-3`5`-AUGCCCGUAUACGGUAGGAAA………AAAA-3`mRNA上有12種組合：AU、AC、AG、UU、UC、UG、CU、CC、CG、GU、GC、GG75.以oligo(dT)MN為引物，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA時，可有12種引物，T11MN，M為T以外的任何核苷酸〔A，C，G〕，N為任何一種核苷酸〔A，T，C，G〕。5`-AUGCCCGUAUACGGUAUAAAAAAAAAAAAAA….A-3`TATTTTTTTTTTT-5`mRNA上有12種組合：AU、AC、AG、UU、UC、UG、CU、CC、CG、GU、GC、GG對應(yīng)12種引物：T11分別加上TA、TG、TC、AA、AG