高黎貢山白花嶺地區(qū)淀粉水解透明圈的篩選

高黎貢山白花嶺地區(qū)淀粉水解透明圈的篩選

淀粉酶（amylae）廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。這是解粘液和糖原酶的總稱。這是第一種用于工業(yè)生產(chǎn)、用途最廣泛、產(chǎn)量最高的酶制劑品種p1-5。淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造P33-34、果汁和食品加工P76-78、醫(yī)藥、洗滌劑P30-35、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑P33-34等多種領(lǐng)域。由于淀粉酶具有重要的商業(yè)價(jià)值,致使很多研究者積極尋找產(chǎn)生該酶的新菌株,或者利用生物工程的方法尋找該酶的基因,改造菌株P(guān)1131-1133,使淀粉酶的產(chǎn)量提高數(shù)倍或數(shù)十倍,并已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),給選育高產(chǎn)淀粉酶提供了新的途徑。近年來,國(guó)內(nèi)的酶制劑工業(yè)蓬勃發(fā)展,品種和產(chǎn)量也不斷在增加,但是同國(guó)外酶制劑行業(yè)還有一定的差距,并且我國(guó)淀粉酶劑型、品種和生產(chǎn)菌種都比較單一P51-52。由于我國(guó)淀粉資源相對(duì)比較豐富,淀粉應(yīng)用范圍比較廣泛,因此淀粉酶工業(yè)發(fā)展必將促進(jìn)我國(guó)其他工業(yè)的迅速發(fā)展,為適應(yīng)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要,應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大淀粉酶的產(chǎn)量和品種,這有助于發(fā)現(xiàn)新的淀粉酶來適應(yīng)新的工業(yè)需求P3-5。為此,本文從高黎貢山百花嶺不同海拔的土壤樣品中篩選一批產(chǎn)淀粉酶的株菌,為進(jìn)一步研究淀粉酶的酶活性、產(chǎn)酶條件優(yōu)化等相關(guān)性質(zhì)奠定一定的基礎(chǔ)。1.材料和方法1.1材料表面1.1.1土壤土壤樣品采自高黎貢山百花嶺海拔1500-1600m之間的區(qū)域,取5-20cm深處土樣裝入紙袋,作好記錄。1.1.2制備工藝1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用):瓊脂20g,牛肉膏3.0g,蛋白胨10g,NaCl5.0g,蒸餾水1000ml,pH7.0-7.2,121.3℃滅菌20min。2)淀粉酶選擇培養(yǎng)基(采用改進(jìn)的LB培養(yǎng)基+1.0%可溶性淀粉):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl5.0g,可溶性淀粉10g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,pH7.8。1.1.3主試劑培養(yǎng)基成分為市售分析純和生化試劑。1.1.4壓力蒸汽滅菌器DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限司),CP214電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司制造),200B華菱冰箱,氣浴恒溫振蕩器,微波爐。1.2方法1.2.1菌懸液的采集將采集的樣品用蒸餾水分別稀釋10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍配制成菌懸液,分別取50μl的菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上,用玻璃棒將其在平板上涂布均勻,然后置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)。2)平板劃線培養(yǎng)用接種針從涂布均勻的平板中挑取外觀形態(tài)、大小、顏色各不相同的菌落,繼續(xù)在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上劃線接種,置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24h~48h,直至產(chǎn)生單個(gè)菌落。1.2.2淀粉淀粉酶試驗(yàn)將各種不同的單菌落分別標(biāo)號(hào)后,接于淀粉酶選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),并將其對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào),放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h-48h。取出上述培養(yǎng)好的平皿,在長(zhǎng)出的菌落上滴加碘液,菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn),說明淀粉被水解,即該菌株能產(chǎn)生淀粉酶。挑選有明顯透明圈的單菌落再轉(zhuǎn)接到淀粉酶選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(利用接種針挑取并點(diǎn)接于培養(yǎng)基),經(jīng)碘液染色后根據(jù)“水解圈直徑/菌落直徑”的大小值,篩選出產(chǎn)淀粉酶菌株。2.產(chǎn)淀粉酶菌株的水解圈我們從高黎貢山百花嶺海拔1500-1600m之間的區(qū)域土壤中采集土樣,篩選產(chǎn)淀粉酶的菌株。結(jié)果得到23株產(chǎn)淀粉酶的菌株,這23株菌株在含有淀粉的篩選平板上產(chǎn)生明顯的淀粉水解透明圈,如圖1所示。分別把23株菌株編號(hào)為CM1~CM23,其水解圈直徑D2與菌落直徑D1的比值如表1所示。菌株產(chǎn)生水解圈的情況如圖1所示。從表1可知,23株產(chǎn)淀粉酶的菌株所形成的透明圈直徑與它們的菌落直徑之比大多數(shù)在1.9到4.5之間;個(gè)別菌株該值比較大,比如CM3、CM7、CM9、CM16、CM23,它們的透明圈直徑與菌落直徑之比分別達(dá)5.5,5.2,5.5,5.0,5.0。透明圈直徑與菌落直徑之比可作為判斷菌株產(chǎn)酶能力大小的初步指標(biāo)。3.淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及初步鑒定通過對(duì)高黎貢山采集的土樣進(jìn)行稀釋分離、接種選擇、鑒定,并根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)的特性,在淀粉選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的單菌落加碘液后菌落周圍出現(xiàn)了透明圈,成功篩選鑒定出23株具有產(chǎn)淀粉能力的產(chǎn)生菌,同時(shí)對(duì)水解圈直徑和菌落直徑