固定金屬離子親和色譜法imac在蛋白質(zhì)分離中的應用

固定金屬離子親和色譜法imac在蛋白質(zhì)分離中的應用

自1975年以來，該技術已在分離和提取蛋白質(zhì)方面得到廣泛應用。該法是基于蛋白質(zhì)對固定在基質(zhì)上金屬離子親和能力的不同進行分離,較其它親和色譜法有許多優(yōu)點:不固定金屬的裸柱可作為陽離子交換劑來分離一些帶正電荷的蛋白質(zhì),除去水中微量金屬,對水進行凈化和消毒;固定金屬離子的色譜柱,在低離子強度下可作為金屬螯合柱分離親和金屬的蛋白質(zhì),在高離子強度下金屬螯合柱又顯示疏水特性,可作為疏水柱分離不同疏水性的蛋白質(zhì);利用同一基質(zhì)可制成吸附性能不同的金屬螯合柱,固定金屬離子的再生和更換非常容易,柱壽命長;在多數(shù)情況下蛋白質(zhì)通過柱子仍保持生物活性;與其它親和柱相比,蛋白質(zhì)負載量高,容易放大和工業(yè)化。由于IMAC具有上述特點,一直受到生物色譜學家的青睞,他們在理論和應用方面都作了大量工作,其中最大的改進是應用組氨酸標記來分離重組多肽或蛋白質(zhì)。本文在前人工作的基礎上,結(jié)合筆者近年的研究成果,介紹了IMAC的原理、金屬螯合柱的制備、蛋白質(zhì)與固定金屬離子的相互作用、蛋白質(zhì)在金屬螯合柱上的保留與洗脫以及IMAC在蛋白質(zhì)研究中的應用。1金屬離子的固定及利用IMAC中的固定相是由基質(zhì)、絡合劑和金屬離子三部分組成?；|(zhì)為固體用以擔載金屬螯合配體。作為分離蛋白用的色譜載體要求粒度小(10～300μm)、孔徑大(≥30nm)、表面積大、分布均勻、剛性好、非特異吸附小、化學穩(wěn)定性高。常用的基質(zhì)有大孔硅膠、交聯(lián)瓊脂糖(sepharose)和交聯(lián)葡聚糖(sephadex)以及有機聚合物TSK-gelG500PW。這些基質(zhì)各有特點,硅膠較后三種有機載體剛性好、分離效率高,但在高pH下易溶解,低pH下易產(chǎn)生硅羥基,且柱容量低,不適于較大規(guī)模的分離純化。TSK的機械強度雖介于硅膠和瓊脂糖或葡聚糖之間,但與金屬螯合配體結(jié)合不牢固,使用時金屬離子易泄漏。絡合劑的作用是將金屬離子固定在基質(zhì)上,為此絡合劑既含能與基質(zhì)共價鍵合的活性基團如—Ν=N==、—OH、—Cl等,又有能與金屬離子配位的多個配位原子。為保證固定金屬離子可以接受蛋白質(zhì)給予的電子對,絡合劑上配位原子數(shù)應小于金屬離子的配位數(shù)。IMAC中常用的絡合劑有亞氨基二乙酸(IDA)、N,N,N′-三(羧甲基)乙烯二胺(TED)、氮基三乙酸(NTA)、羧甲基門冬氨酸(CM-ASP)、四乙烯戊胺(TEPA)、羧甲基α,β-二胺丁二酸(CM-DASA)和乙二胺N,N′-二乙酸(EDDA)等。最近幾年開發(fā)了一些新的不含羧甲基胺的絡合劑,如染料——耐黃2KT、O-磷酸絲氨酸和8-羥基喹啉等。其中IDA應用最廣,這是由于IDA是一種三齒絡合劑,它既能同金屬離子形成穩(wěn)定的金屬螯合物,防止色譜過程金屬離子的泄漏,又使金屬離子在螯合后留下足夠能與蛋白質(zhì)強烈結(jié)合的配位點。IDA適中的親水性也為蛋白質(zhì)的分離提供了溫和的環(huán)境。固定金屬通常為具有d層空價電子軌道的過渡金屬如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Fe3+等,它們與絡合劑形成可與蛋白質(zhì)結(jié)合的金屬螯合配體。為了將金屬螯合配體固定在選擇的基質(zhì)上,連接前必須用活化劑將基質(zhì)活化,使其末端具有能與絡合劑共價鍵合的活性基團如環(huán)氧基。硅膠常用的活化劑為γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷,對有機載體常用環(huán)氧乙烷如表氯醇進行活化。制備金屬螯合柱時,通常先用化學方法使活化基質(zhì)與絡合劑鍵合成具有陽離子交換特性的裸柱,然后灌注選用的金屬離子,待吸附達到飽和,用平衡緩沖液除去過剩的金屬離子,即制成所需要的金屬柱。如要更換新的金屬離子,可用乙二胺四乙酸(EDTA)除去舊的金屬離子,重新注入新的金屬離子?？梢钥闯?IMAC實質(zhì)是把蛋白質(zhì)與金屬離子在液相中的均相反應轉(zhuǎn)移到固液兩相間進行。經(jīng)過如此改進,反應的熱力學和動力學性質(zhì)將發(fā)生改變;減小了蛋白質(zhì)與金屬離子在液相作用的自由度,避免了蛋白質(zhì)的變性;使分散在溶液中的蛋白質(zhì)得到富集和分離。2其他結(jié)構的蛋白質(zhì)保留的作用蛋白質(zhì)在IMAC中的保留機理至今還沒有一個定論,多數(shù)學者認為蛋白質(zhì)在固定相的吸附是靜電、疏水和配位作用的總和。所謂配位作用是蛋白質(zhì)表面富電子的給予基(如—NH2、—S-和—COO-)將其孤對電子插入固定金屬離子d層空價電子軌道形成配位鍵;靜電作用是帶電金屬螯合配體與帶電蛋白質(zhì)分子間以及近距離范圍帶電配位原子與固定金屬離子電荷間的相互作用;疏水作用是固定相疏水碳鏈與蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)域的親和作用,這種作用隨溶液鹽濃度的增加而增大。這三種作用力在不同條件下對蛋白質(zhì)的保留貢獻大小不一,常隨流動相、固定相和蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化。在高鹽濃度的流動相體系,根據(jù)疏溶劑理論,隨著鹽濃度的增加,溶液表面張力增大,蛋白質(zhì)與金屬螯合柱間的疏水作用增強,此時支配蛋白質(zhì)保留的作用力不是靜電和配位作用,而是疏水作用。然而在正常的IMAC體系中鹽濃度較低(NaCl≤0.5mol/L,(NH4)2SO4≤0.25mol/L),疏水作用對蛋白質(zhì)保留的影響不很顯著,這時決定蛋白質(zhì)保留的作用力主要為靜電和配位作用。根據(jù)蛋白質(zhì)在金屬螯合柱上的保留特征,可以把常見的金屬柱分為兩類:與蛋白質(zhì)強烈親和的IDA-Cu柱和對蛋白質(zhì)結(jié)合較弱的IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱。對強結(jié)合的IDA-Cu柱支配蛋白質(zhì)保留的主要作用力為配位作用,靜電作用為輔,這從表1的實驗事實可以得到證明。表1中所有試驗蛋白不被離子交換常用的NaCl-磷酸緩沖體系洗脫,說明蛋白質(zhì)和固定金屬離子間的結(jié)合主要不是靜電作用,而是結(jié)合較強的配位鍵。用含純粹競爭洗脫劑(His和Gly)的磷酸緩沖體系,蛋白質(zhì)也不被洗脫,說明蛋白質(zhì)和固定金屬離子間的作用也不是單一的配位作用。僅在其中加入NaCl后蛋白質(zhì)才被洗脫,表明蛋白質(zhì)和金屬離子間除配位作用外,還有靜電作用。NaCl削弱了蛋白質(zhì)與固定金屬離子間的靜電作用,而競爭洗脫劑對固定金屬離子的競爭配位破壞了蛋白質(zhì)與金屬螯合配體間的配位作用。如果把蛋白質(zhì)在弱結(jié)合金屬柱IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn上的保留行為與不固定金屬離子的IDA裸柱進行比較,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在弱結(jié)合金屬柱上仍保留IDA裸柱陽離子交換特性。例如蛋白質(zhì)可用含NaCl的磷酸緩沖體系洗脫,蛋白質(zhì)保留值隨等電點(pI)的增加而增大,保留值對pH變化較敏感,說明蛋白質(zhì)和金屬螯合配體間具有靜電作用特征。另一方面,蛋白質(zhì)在弱結(jié)合金屬柱上也增加了新的色譜行為,例如金屬離子的插入使蛋白質(zhì)保留值發(fā)生改變,蛋白質(zhì)對pH的依賴關系與裸柱正相反,在裸柱上蛋白質(zhì)保留值隨pH的增加而減小,而在弱結(jié)合金屬柱上隨pH增加保留值趨于增大(表2)。這是由于隨著pH的增加蛋白質(zhì)和固定金屬間配位作用增強的緣故?？傊?高鹽濃度下蛋白質(zhì)在IMAC中的保留是疏水、靜電和配位的協(xié)同作用,其中以疏水作用為主。在低鹽濃度色譜體系蛋白質(zhì)與固定相間主要是靜電與配位作用;對強結(jié)合的IDA-Cu柱蛋白質(zhì)與固定相間以配位作用為主,靜電作用為輔;對弱結(jié)合的IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱,蛋白質(zhì)與固定相間以靜電作用為主,配位作用次之,但隨溶液pH的增加配位作用隨之增大。3金屬離子和蛋白質(zhì)表面配體的選擇影響蛋白質(zhì)與金屬螯合柱作用的因素很多,主要有金屬離子和蛋白質(zhì)表面配體的性質(zhì)、溶液pH、離子強度和其它競爭配體等,搞清這些問題對提高分離的選擇性和選擇適宜分離條件非常重要。3.1cu對蛋白質(zhì)晶場的影響當同一蛋白與不同金屬作用時,由于金屬離子所帶電荷、離子半徑和電子層結(jié)構的不同,對蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不同的親和力。IMAC中常用的幾種金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+具有相同電荷,其離子半徑分別為69、72、74和74pm。半徑越小,配位作用越強,與蛋白質(zhì)形成的絡合物越穩(wěn)定。因此,Cu柱對蛋白質(zhì)具有最強的結(jié)合力,Co和Zn柱結(jié)合最弱。除離子半徑外,絡合物的穩(wěn)定性也受配位原子對中心離子外層d軌道的影響。根據(jù)配位化合物晶體場理論,蛋白質(zhì)表面的配位基如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基通?？梢钥醋魅鯃鰪娕潴w。當這些基團與Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+配位時,中心離子的d電子分布發(fā)生改變,其晶體場穩(wěn)定化能(CFSE)如表3所示。從表3可知,Cu2+配位化合物穩(wěn)定化能最低(-12.3Dq),加之Cu2+半徑最小,因此對蛋白質(zhì)配位最強,Ni2+次之,Co2+和Zn2+最弱,這個順序與蛋白質(zhì)在金屬螯合柱上的保留順序一致。應當指出,與蛋白質(zhì)結(jié)合最強的金屬離子未必能使蛋白質(zhì)得到最好分離,因為較強的結(jié)合往往也使雜質(zhì)的吸附增加。3.2蛋白質(zhì)表面氨基酸的結(jié)構變化配位體對金屬絡合物穩(wěn)定性的影響,還包括配位氨基酸的類型、數(shù)目、離解常數(shù)和空間取向。從理論上講,蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基中的α-氨基和羧基以及側(cè)鏈上電子給予基都能參與同固定金屬的配位。但由于側(cè)鏈上的配位原子具有較大空間自由度,可以充分與固定金屬接近,因此,在金屬螯合色譜中側(cè)鏈上氨基酸殘基對金屬離子的結(jié)合較末端氨基和羧基更為重要。側(cè)鏈上的配位原子,就其酸堿軟硬性可分為三類:配體中的氧原子、脂肪族氮和三價磷屬硬堿;芳香族氮為交界堿,而硫是軟堿。根據(jù)軟硬酸堿規(guī)則,Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+是交界酸,它們優(yōu)先同屬交界堿的芳香族氮和軟堿硫原子配位。因此,組氨酸中的咪唑基、色氨酸中的吲哚基和半胱氨酸中的巰基是蛋白質(zhì)中與金屬絡合最強的配基,其中以組氨酸最為重要。而屬于硬堿的羧基和磷酸基優(yōu)先同硬酸金屬離子Fe3+和Mg2+配位。配位作用強弱,除配位體的性質(zhì)外,也與配位氨基酸殘基的數(shù)目、離解常數(shù)和空間取向有關。通常蛋白質(zhì)表面組氨酸數(shù)目越多,離解常數(shù)越大,配位原子中孤對電子取向與金屬離子中空價電子軌道伸展方向越一致,蛋白質(zhì)與金屬螯合配體越容易成鍵。表4給出RNase、Cyt-C、Lys和BSA表面氨基酸的分布情況。單從蛋白質(zhì)表面組氨酸的數(shù)目來看,蛋白質(zhì)在同一柱上的流出順序應為Lys、Cyt-C、RNase和BSA。但經(jīng)X射線結(jié)構分析可知,RNase表面的兩個組氨酸殘基處于蛋白質(zhì)表面的不同位點,105位的組氨酸(H105)很容易接近固定金屬,而H119難以接近,所以RNase表面有效配基數(shù)與Lys、Cyt-C相當。但由于RNase的pI低于Cyt-C和Lys,在實驗pH條件下,蛋白質(zhì)分子正電性較低,所以在弱配位的金屬螯合柱上仍然先被流出。Cyt-C與Lys相比,在Cyt-C表面僅含一個可接近的H33,而在Lys表面除有一個H15外,還有兩個輔加的62位和123位的色氨酸殘基。另外LysH15的離解常數(shù)(KC=6.3×10-6)大于Cyt-CH33的離解常數(shù)(KC=3.2×10-7),因此Lys與固定金屬具有較強親和力,洗脫時最后流出。BSA表面雖含2個組氨酸,但因pI較低,在操作pH下蛋白質(zhì)帶負電,與負電性的螯合配體相互排斥,應最先流出。3.3ph對蛋白質(zhì)洗脫的影響pH在蛋白質(zhì)吸附與解吸中的作用相當復雜,因為它不僅涉及緩沖體系成分的親核行為,也影響電子給予體和接受體的性質(zhì)。表2是蛋白質(zhì)在IMAC中保留值與pH的關系。從表2看出,隨著溶液pH的增加,蛋白質(zhì)在金屬螯合柱上的保留值有增大趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因,是由于隨著pH的增加,蛋白質(zhì)表面配位原子質(zhì)子化的程度減弱,與固定金屬離子的配位作用增強;另一方面,隨pH的增加,配位原子負電性增大,與帶正電荷的金屬離子在近距離范圍的靜電作用增強。因此在IMAC中蛋白質(zhì)保留值隨pH增加而增大。利用保留值與pH的這種關系,可以通過減小溶液pH達到洗脫蛋白的目的。事實上隨著pH的減小,溶液中質(zhì)子開始同金屬離子競爭結(jié)合蛋白質(zhì)表面配體—NH2、—S-和—COO-,降低了配體與金屬離子結(jié)合的能力;再者,質(zhì)子化氨基上的正電荷開始排斥帶正電荷的金屬離子,—S-和—COO-的質(zhì)子化削弱了對金屬離子的吸引力,使得蛋白質(zhì)與固定金屬離子的結(jié)合物變得更不穩(wěn)定,于是蛋白質(zhì)得到洗脫。IMAC中調(diào)節(jié)pH常用的緩沖液是磷酸鹽和醋酸鹽體系。為防止蛋白質(zhì)變性、避免硅膠溶解和硅羥基的形成并有利于蛋白質(zhì)的吸附,溶液的pH通?？刂圃?.0～8.0。3.4其他柱的洗脫實驗證明,固定金屬離子的IDA柱具有兩種色譜功能。在低鹽濃度可作為金屬螯合柱,而在高鹽濃度又可作為疏水柱,并且這兩種功能隨流動相中鹽濃度發(fā)生改變。當用低濃度鹽的緩沖液作流動相(NaCl<0.5mol/L),除強親和性的IDA-Cu柱外,吸附在弱親和性IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱上的蛋白質(zhì)利用增加鹽濃度的方法都可以被洗脫。這是由于低鹽濃度時,支配弱親和金屬柱與蛋白質(zhì)的作用力為靜電作用。隨著鹽濃度的增加,由于屏蔽效應而使帶相反電荷的金屬離子與蛋白質(zhì)間的靜電作用減弱,故蛋白質(zhì)的保留值隨鹽濃度增加而減小。但對與蛋白質(zhì)強結(jié)合的IDA-Cu柱,由于支配固定相與蛋白質(zhì)作用的力為配位鍵,因此用增加鹽濃度的方法不能將吸附蛋白洗脫,僅用與蛋白競爭結(jié)合金屬離子的競爭洗脫劑才被洗脫。在高鹽濃度(NaCl>0.5mol/L,(NH4)2SO4>0.25mol/L)IMAC的保留行為類似HIC,支配蛋白質(zhì)在固定相吸附的作用力是疏水作用。因此吸附在固定相的蛋白質(zhì)可利用疏水色譜中常用的減小鹽濃度的方法被洗脫。但對強親和性的IDA-Cu柱,由于蛋白質(zhì)與Cu2+間的強配位作用,即使利用降低鹽濃度的方法也不被洗脫,僅通過競爭洗脫才能破壞蛋白質(zhì)與固定Cu2+間的結(jié)合。3.5流動相中競爭金屬離子的吸附與金屬螯合柱強烈結(jié)合的蛋白質(zhì),有時用降低pH和改變離子強度的方法不能將吸附的蛋白洗脫下來,這時可以在流動相中加入能與被吸附蛋白競爭結(jié)合固定金屬離子的競爭洗脫劑如組氨酸、甘氨酸、咪唑和氨等,利用競爭洗脫劑與固定金屬離子競爭配位作用,將吸附在固定相上的蛋白置換下來。也可以使用與固定金屬離子同時競爭結(jié)合被吸附蛋白的競爭劑。由于流動相中競爭洗脫劑與固定金屬離子間有較強的配位作用,往往易造成固定金屬離子的泄漏,尤其使用強配位的EDTA。為了減免這種現(xiàn)象,使用的競爭洗脫劑配位強度和濃度要適當,也可以在流動相加入少量固定金屬離子以抑制金屬離子的流失或在金屬柱后串聯(lián)一支IDA裸柱,除去泄漏的金屬離子以免污染系統(tǒng)和產(chǎn)品。綜上所述,在高離子強度的流動相中,金屬螯合柱顯示疏水性能,可用減小鹽濃度的方法洗脫蛋白質(zhì)。在低離子強度的金屬螯合色譜體系,可用減小pH或增加鹽濃度的方法洗脫。對用這兩種方法都不能洗脫的一些強結(jié)合蛋白,可按競爭洗脫方法進行。為了提高分離的選擇性,有時在流動相中加入少許去污劑如Tween80,以消除干擾。加入甘油和蛋白酶抑制劑可以維持酶的活性。加入2-巰基乙醇可防止蛋白質(zhì)聚集。為使各種蛋白質(zhì)在最佳pH、離子強度和競爭洗脫劑濃度下被洗脫,洗脫方式多按分段或梯度進行。4生物材料研究中的imaIMAC在生物大分子研究中的應用主要集中在兩方面:蛋白質(zhì)的識別和分離純化。4.1蛋白質(zhì)表面his的分布與分布Chicz等利用IMAC作為探針來區(qū)分天然均一蛋白及其變種,并將這種技術擴展到基因工程,用以識別蛋白質(zhì)表達錯誤。此法的依據(jù)是當?shù)鞍踪|(zhì)突變發(fā)生一位或多位氨基酸取代時,必然影響其表面組氨酸與固定金屬離子的作用,導致蛋白質(zhì)保留值發(fā)生變化,根據(jù)保留值的變化判斷蛋白質(zhì)遺傳過程表達的正確性。他們把野生枯草桿菌蛋白酶同一位或多位取代的枯草桿菌蛋白酶變種的保留值進行了比較,發(fā)現(xiàn)無論一位或多位取代都使天然蛋白酶的保留值發(fā)生明顯變化,并且變化的大小與取代的氨基酸性質(zhì)有關。如在pH6.2用中性氨基酸取代Gly166位點,蛋氨酸(Met)給出最大保留值,纈氨酸(Val)給出最小保留值。在pH6.2用帶電氨基酸取代Gly166位點,His給出最大保留值而谷氨酸(Glu)給出最小保留值。導致突變后蛋白質(zhì)保留值變化的原因,可能由于一位或多位取代引起蛋白質(zhì)表面His64與固定金屬離子作用的微環(huán)境發(fā)生變化。Sulkowski根據(jù)不同金屬離子配位需要His數(shù)目的不同,提出利用金屬螯合柱識別蛋白質(zhì)表面His的分布,并建立了His的拓撲圖。從表5看出,當?shù)鞍踪|(zhì)通過金屬螯合柱時,僅在IDA-Cu柱保留,而不在IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱保留,表明蛋白質(zhì)表面僅有一個可與固定金屬離子配位的His。若蛋白質(zhì)僅被IDA-Cu和IDA-Ni保留,而不被IDA-Co和IDA-Zn保留,表明蛋白表面His的分布為—His(Xn)His。若蛋白質(zhì)在上述四種金屬螯合柱都保留,表面His的分布可能為—His(Xn)His(n(2,3);α-螺旋)和—HisHis—。除了上述應用外,近年也出現(xiàn)一些與IMAC相關的新技術如生物傳感器、固定金屬親和毛細管電泳(IMACE)以及固定金屬親和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(IMAC-MS),用以檢測樣品中分析物。4.2親和色譜法檢測用IMAC分離純化蛋白質(zhì)常用三種方法:直接色譜法(DC-IMAC)、螯合肽-固定金屬親和色譜法(CP-IMAC)和疊層親和色譜法(CSAC)。4.2.1imac與雙水相萃取的分離純化DC-IMAC是利用被分離蛋白與固定金屬離子的親和作用直接進行色譜分離,這是IMAC中最常用的一種方法。按此方法分離的蛋白有許多種,樣品主要來源于人、動物、植物組織、器官和體液以及生物發(fā)酵液和培養(yǎng)液。主要工作有:人血清中清蛋白、α-胰蛋白酶抑制劑、糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和免疫球蛋白的分離與鑒定;人血漿中凝血因子、血纖維蛋白原、α2-巨球蛋白和α1-蛋白酶抑制劑、α1-巰基糖蛋白、α1-巰基蛋白酶抑制劑的分析;人血中超氧化物歧化酶、血型糖蛋白、血小板生長因子、人蛋白和鈣結(jié)合蛋白、人及動物和大腸桿菌中干擾素的測定;豬滑液和動物組織培養(yǎng)液中膠原酶、豬結(jié)腸腸胃多肽、豬乳中胰蛋白酶抑制劑、狗心肌紅蛋白、鼠肝中核苷二磷酸、鼠腹水中單克隆IgG、雞胸中糖原磷酸酶和乳酸脫氫酶、兔骨金屬蛋白酶、兔腎酪氨酸磷酸酶、牛奶中α-乳清蛋白、大豆中脂肪氧化酶、麥芽中α-淀粉酶、生長激素和催乳激素、西紅柿蔗糖合酶異構物、發(fā)酵液中蘋果酸脫氫酶等的分離純化。在基因工程產(chǎn)品的分離純化中,近幾年一些生物化學家也將IMAC技術用于變性蛋白的再折疊,通過色譜過程中的稀釋、去變性劑和交互折疊等作用,使胍變或脲變蛋白在金屬螯合柱上得到復性。例如用Ni(Ⅱ)-NTA柱復性的蛋白有:哺乳動物蛋白、DNA螺旋酶、人源抗HBsAg單鏈抗體、外聚磷酸酶等。這個方法對基因工程中存在于包含體內(nèi)重組蛋白的復性非常有用。它較常規(guī)復性方法操作簡單,一次可同時完成分離、去變性劑和復性等步驟,蛋白質(zhì)的錯誤折疊較少,復性效率高。為進行大規(guī)模純化,Clemmitt等和Willoughby等把IMAC和擴張床吸附色譜(EBA)結(jié)合起來,利用金屬螯合填充物對被分離蛋白的選擇性親和和擴張床的流態(tài)化性能,可直接從發(fā)酵液或動植物培養(yǎng)液中分離出目標蛋白。Sivars等把IMAC擴展到雙水相萃取體系,用金屬-聚乙二醇作為其中一相,溶于水的高分子化合物或鹽溶液作另一相,利用固定金屬離子對蛋白質(zhì)的選擇親和及蛋白質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同進行分離。由于這兩種方法可直接分離未經(jīng)澄清的樣品,因此在分離細胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)具有很大潛力。4.2.2化學或酶法純化通常在蛋白質(zhì)里His的含量較少,約占球形蛋白氨基酸總量的2%,并且僅有一半暴露在蛋白質(zhì)的表面,其中可與固定金屬離子接近的有效His為數(shù)更少,因此自然界僅有部分天然蛋白質(zhì)擁有金屬親和性。為了擴大IMAC的應用范圍,Smith等根據(jù)重組肽對固定金屬離子有強親和能力,建立了CP-IMAC,此法是利用融合技術先將對固定金屬離子有親和力的螯合肽連接到被純化蛋白的C-或N-末端,制成對固定金屬離子有親和力的融合蛋白。經(jīng)IMAC分離后,再用化學或酶法斷裂技術除去融合蛋白中的螯合肽,即得高純度目標產(chǎn)品。例如Hochui等為了純化鼠二氫葉酸還原酶,先使鼠二氫葉酸還原酶與多His螯合肽融合,然后用Ni(Ⅱ)-NTA柱分離,得到足夠純的融合蛋白,再用羧肽酶A除去末端的螯合肽。