wn-caenin信號(hào)通路在腫瘤中的表達(dá)及意義

wn-caenin信號(hào)通路在腫瘤中的表達(dá)及意義

癌癥是中國南方常見的腫瘤。與之前的顯著相比，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是治療失敗的主要原因。臨床分期是目前判斷鼻咽癌預(yù)后的主要指標(biāo)，但即使是同一分期的患者也可能具有不同的預(yù)后。因此，尋找可靠、有效的分子預(yù)后指標(biāo)有助于實(shí)施個(gè)體化治療，并對(duì)高危患者加強(qiáng)隨訪，以期盡早診治疾病進(jìn)展。Wnt/β-catenin通路是調(diào)控干細(xì)胞增殖及分化的信號(hào)通路，近年來被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。通路中的信號(hào)分子Wnt-1能促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生，但與腫瘤進(jìn)展的聯(lián)系的研究較少，與鼻咽癌預(yù)后的關(guān)系未見報(bào)道。通路中的關(guān)鍵分子β-catenin的高表達(dá)是乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的不良預(yù)后因子之一，但它對(duì)于判斷鼻咽癌預(yù)后的參考作用存在爭議，值得探討。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的技術(shù)檢測Wnt-1、β-catenin蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)，探討其與鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇及劑量收集1999年1月至1999年12月在中山大學(xué)腫瘤防治中心初治的鼻咽癌患者的鼻咽活檢組織標(biāo)本111例。所有病例均經(jīng)病理確診為低分化鱗癌或未分化癌，且未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊吣行?7例，女性24例；年齡18～71歲，中位年齡47歲。按鼻咽癌’92分期，Ⅰ期3例，Ⅱ期24例，Ⅲ期58例，Ⅳa期26例。所有患者均行根治性放療，設(shè)野有108例為面頸聯(lián)合野、3例為面頸分野，采用60Coγ線或6～8MV直線加速器常規(guī)外照射，鼻咽部總劑量為68～80Gy，有4例患者鼻咽照射60Gy后采用后裝照射，劑量為15～16Gy；有1例患者鼻咽照射70Gy后予后裝補(bǔ)量，劑量為9Gy。頸部治療劑量為60～70Gy，預(yù)防劑量為50～56Gy。24例患者接受以PF方案為主的誘導(dǎo)化療，10例患者接受以鉑類為主的同期化療。1.2免疫組化試驗(yàn)免疫組化試劑羊抗人多克隆抗體Wnt-1(sc-6280）購自美國SantaCruz公司，鼠抗人單克隆抗體β-catenin(ZM-0442）、SP-9003免疫組化染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型Wnt-1抗體工作濃度為1∶200，濃縮型β-catenin抗體的工作濃度為1∶100ㄢ1.3體外受精文化培養(yǎng)全部石蠟包埋組織連續(xù)4μm切片，常規(guī)脫蠟至水，采用微波法抗原修復(fù)20min，恢復(fù)室溫后依次以PBS消除內(nèi)源性過氧化物酶及以兔血清封閉，加入一抗4℃過夜，次日加入二抗37℃孵育30min，加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素室溫孵育20min。滴加DAB鏡下控制顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后封片。以0.01mol/LPBS液代替一抗作陰性對(duì)照，以已知Wnt-1、β-catenin蛋白陽性的乳腺癌組織作陽性對(duì)照。1.4觀察陽性信號(hào)在顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。Wnt-1的陽性信號(hào)位于胞膜或胞質(zhì)，β-catenin的陽性信號(hào)位于胞質(zhì)或胞核，為棕黃色顆粒狀，觀察陽性信號(hào)的染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比予分別計(jì)分。完全不染色、淺棕黃色、棕黃色、深棕黃色分別賦值為0、1、2、3分；陽性細(xì)胞百分比0%～24%、25%～49%、50%～74%、75%～100%分別賦值為1、2、3、4分，兩者相乘為陽性得分。依據(jù)分值的中位數(shù)將其分成兩組：中位數(shù)以下者為低表達(dá)組，中位數(shù)及以上組為高表達(dá)組。1.5中位隨訪時(shí)間所有病例具有完整的存檔病歷及隨訪資料，中位隨訪時(shí)間為65個(gè)月（8～88個(gè)月）。1年、3年、5年隨訪率分別為98.2%、97.3%、93.7%。1.6生存率及生存分析方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman法；壽命表法計(jì)算生存率；用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，組間差異采用log-rank檢驗(yàn)；多因素預(yù)后分析采用Cox回歸模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。無復(fù)發(fā)生存期為治療開始至局部復(fù)發(fā)或末次隨訪時(shí)間，無轉(zhuǎn)移生存期為治療開始至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或末次隨訪時(shí)間，無進(jìn)展生存期為治療開始至局部復(fù)發(fā)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或末次隨訪時(shí)間。2結(jié)果2.1病例分析全組病例隨訪期內(nèi)的復(fù)發(fā)率為18.9%（21/111），轉(zhuǎn)移率為14.4%（16/111），總生存率為62.2%（69/111）ㄢ2.2病例定義為wnt-1、-catenin表達(dá)Wnt-1和β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。依據(jù)分組標(biāo)準(zhǔn)，全組病例有61.3%（68/111）的病例定義為Wnt-1高表達(dá)，有57.7%（64/111）的病例定義為β-catenin高表達(dá)。將Wnt-1和β-catenin的得分（0、1、2、3、4、6、8、9、12分）行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，其相關(guān)系數(shù)為0.387(P<0.001）ㄢ2.3無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義在不同性別、年齡、T分期、N分期、’92分期的病例中，Wnt-1高表達(dá)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而在中晚期病例中β-catenin的高表達(dá)率較早期病例高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）；但在不同性別、年齡、T分期、N分期的病例中β-catenin表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表1)2.4轉(zhuǎn)移生存率與無進(jìn)展生存率Wnt-1低表達(dá)組和高表達(dá)組的5年無復(fù)發(fā)生存率、無轉(zhuǎn)移生存率及無進(jìn)展生存率分別是84.4%和76.7%、87.5%和82.4%、73.1%和61.6%，其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）ㄢ2.5率、無轉(zhuǎn)移生存率及無進(jìn)展生存率比較β-catenin低表達(dá)組和高表達(dá)組的5年無復(fù)發(fā)生存率、無轉(zhuǎn)移生存率及無進(jìn)展生存率分別為88.4%和73.0%、93.6%和77.2%、82.3%和54.0%，兩者的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見圖2～4）ㄢ2.6enin表達(dá)情況的單因素分析結(jié)果將性別、年齡、’92分期、T分期、N分期、鼻咽部劑量、頸部淋巴結(jié)劑量、有無誘導(dǎo)化療、同時(shí)期化療、Wnt-1及β-catenin表達(dá)情況共11個(gè)因素對(duì)PFS的影響行單因素分析，結(jié)果顯示，只有β-catenin表達(dá)情況和’92分期與無進(jìn)展生存期有關(guān)（P<0.05）。進(jìn)一步將性別、年齡、’92分期、T分期、N分期、β-catenin表達(dá)情況用Enter法納入Cox回歸模型行多因素分析，結(jié)果顯示僅患者的性別和β-catenin的表達(dá)情況與無進(jìn)展生存期相關(guān)（P<0.05，見表2）ㄢ3胞質(zhì)-catenin與預(yù)后的關(guān)系目前研究認(rèn)為，腫瘤可能是發(fā)生在干細(xì)胞水平上的疾病。Wnt/β-catenin通路是調(diào)控干細(xì)胞增殖及分化的信號(hào)通路，當(dāng)異常激活時(shí)會(huì)引致腫瘤的發(fā)生。Wnt蛋白是Wnt/β-catenin通路的信號(hào)分子，β-catenin是通路的關(guān)鍵分子，它在胞質(zhì)的累積是通路的關(guān)鍵步驟。正常成熟細(xì)胞中沒有Wnt信號(hào)，胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin水平極低。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，胞質(zhì)中β-catenin大量積聚并轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)上百個(gè)靶基因（如c-myc、cyclinD1等）的轉(zhuǎn)錄，最終效應(yīng)是加速細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究中，111例鼻咽癌組織中β-catenin高表達(dá)率達(dá)57.7%，臨床中晚期（Ⅲ、Ⅳa期）的患者，胞質(zhì)β-catenin高表達(dá)的比例較早期（Ⅰ、Ⅱ期）患者顯著增加，提示腫瘤負(fù)荷大、生物學(xué)特性兇險(xiǎn)與胞質(zhì)β-catenin的表達(dá)相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)β-catenin高表達(dá)的鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展率明顯高于低表達(dá)者，可能與β-catenin在胞質(zhì)累積后入核、激活多基因（包括EMC蛋白纖維粘連素、金屬蛋白酶等）的轉(zhuǎn)錄，使腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。多因素分析表明胞質(zhì)β-catenin高表達(dá)是影響鼻咽癌治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后因素，說明胞質(zhì)β-catenin表達(dá)可能比臨床分期更能有效地預(yù)測預(yù)后，更能反映腫瘤的生物學(xué)特性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，胞質(zhì)β-catenin高表達(dá)的乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌患者預(yù)后不良，但在鼻咽癌中尚未見相關(guān)研究。而本次研究的結(jié)果提示胞質(zhì)β-catenin表達(dá)有望成為判斷鼻咽癌預(yù)后的有效分子指標(biāo)，結(jié)合臨床分期可指導(dǎo)治療。Wnt-1是Wnt蛋白家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)Wnt-1在腫瘤的發(fā)生上可能扮演重要角色，但它與腫瘤的預(yù)后關(guān)系鮮見報(bào)道，只在前列腺癌中有所研究。Chen等研究顯示，Wnt-1高表達(dá)的前列腺癌患者易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是前列腺癌預(yù)后不良的分子指標(biāo)。本研究應(yīng)用免疫組化檢測Wnt-1在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有61.3%的高表達(dá)率，但它的表達(dá)與患者的臨床特征無關(guān)；Wnt-1高表達(dá)組的無復(fù)發(fā)生存率、無轉(zhuǎn)移生存率、無進(jìn)展生存率與低表達(dá)組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示W(wǎng)nt-1可能與鼻咽癌的預(yù)后轉(zhuǎn)歸無直接關(guān)系，但它是否參與鼻咽上皮的癌變過程有待進(jìn)一步探索。本研究中，Wnt-1與β-catenin呈正相關(guān)，但相關(guān)程度不強(qiáng)（r=0.387），與鼻咽癌預(yù)后的相關(guān)性也有差別，提示除了Wnt-1以外，還可能存在其他上調(diào)胞質(zhì)β-catenin表達(dá)的信號(hào)。Wnt蛋白家族的其他成員，如Wnt-3a、Wnt-8a、Wnt-8b等，亦通過穩(wěn)定胞質(zhì)β-catenin水平來介導(dǎo)下游事件。此外，PTEN、EGFR通路、EB病毒介導(dǎo)的PI3/Ak等通路的激活或β-catenin降解機(jī)制的異常也可導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)濃度的升高。因此，胞質(zhì)β-catenin受調(diào)節(jié)的因素很多，它的表達(dá)及其臨床意義可不完全與Wnt-