二妙丸類方配伍物質基礎研究

二妙丸類方配伍物質基礎研究

二益丸（pm）引用朱振恒的醫(yī)學素描，包括黃柏和白術。這是一個潮濕和清熱的經典方劑。三妙丸(S3M)是在EM基礎上加牛膝以活血化淤通絡,補肝腎強筋骨,專治下焦?jié)駸嶂宰C。四妙丸(S4M)在S3M基礎上加薏苡仁,以增強祛濕熱而利筋絡之力,主治濕熱下注之痿證。臨床常用S4M加味治療急性痛風,S4M加清熱藥(忍冬藤和土茯苓)即加味四妙丸(GSM),是抗?jié)駸嶙C痛風的有效方劑。它們均是EM類方,又依次為基礎方和類方,臨床治療濕熱下注證的各種病癥。EM作為基礎方,其有效部位主要由蒼術揮發(fā)油、黃柏生物堿組成,其中生物堿由小檗堿(批號713-9906)、巴馬汀、藥根堿、黃柏堿、木蘭花堿等組成,具有抗炎和免疫抑制作用;牛膝、薏苡仁的有效部位為皂苷類等成分;土茯苓和忍冬藤兩加味藥中主要有黃酮類、有機酸類成分,其中土茯苓中落新婦苷等黃酮類成分,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用,忍冬藤中的綠原酸具有抗炎、抑菌作用。GSM抗痛風有效部位群由揮發(fā)油、生物堿、黃酮、有機酸、皂苷和糖類組成,系統(tǒng)比較二妙丸類方及其有效部位群抗?jié)駸嶙C痛風生物效應顯示,從基礎方到類方,效應的變化存在著一定的聯(lián)系和規(guī)律。為進一步研究二妙丸類方物質基礎配伍變化規(guī)律,作者建立了能充分反映生物堿、黃酮、有機酸等成分信息的GSM有效部位群HPLC指紋圖譜,比較二妙丸類方指紋圖譜共有峰成分特征及配伍變化。1藥代動力學及藥鑒定高效液相色譜儀Agilent1100,含在線真空脫氣機、高壓二元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、Agilent1100化學工作站等。黃柏PhellodendronchinenseSchneid.、蒼術AtractylodeschinensisKoidz.、薏苡仁CorxLacryma-jobiL.var.mayuen,牛膝AchyranthesbidintataBl.、忍冬藤LonicerajaponicaThunb.、土茯苓SmilaxglabraRoxb.6味藥均自購,由南京中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室王春根教授鑒定。綠原酸(批號110753-200413)、藥根堿(批號0733-200005)、小檗堿(批號713-9906)、巴馬汀(批號110713-200208)、落新婦苷(自制,HPLC峰面積歸一化法純度>98%)、紫丁香苷(批號111574-200201)等購自中國生物制品檢定所(批號)。甲醇(色譜純),冰醋酸(分析純),娃哈哈純凈水,其他制備試劑為分析純。2方法和結果2.1小球物提取物的制備對照品樣品制備:將對照品精密稱量后,甲醇定容,配制成0.1g·L-1對照品供試液;將對照品溶液加入加味四妙丸有效部位群溶液中,配制成對照品供試液。黃柏生物堿提取物:按文獻方法,黃柏醇提后,經大孔樹脂純化得生物堿提取物,純度為64.5%。按文獻方法制備二妙丸類方有效部位群,正丁醇萃取,回收溶劑后用80%甲醇定容,其中二妙丸類方有效部位群(EMP,S3MP,S4MP,GSMP)樣品配制質量濃度為0.4g·mL-1;黃柏生物堿、土茯苓黃酮、忍冬藤黃酮、忍冬藤有機酸配制質量濃度為1g·mL-1。蒼術、黃柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、忍冬藤各稱取10g,甲醇浸泡過夜,超聲0.5h,過濾,取濾液定容10mL,制備成1g·mL-1樣品。2.2萃取流程及檢測波長lmKromasilC18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm);流動相A-甲醇,B-1.5%的醋酸水溶液;梯度洗脫程序為0～60min,10%～45%A;60～85min,45%～75%A;85～95min,75%～85%A;95～100min,85%～10%A;流速0.8mL·min-1;檢測波長280nm;柱箱溫度30℃;進樣量10μL;分析時間100min。2.3方法研究2.3.1準確度的研究2.3.2審查的重復2.3.3穩(wěn)定性試驗2.4gsmp指紋圖譜按2.1項下方法制備10批GSMP樣品,2.2項下色譜條件測定色譜圖,制訂指紋圖譜技術參數(shù)。其中保留時間及峰面積相對穩(wěn)定的60個共有峰峰面積占總峰面積90%以上,確定為GSMP指紋圖譜共有峰,見圖1。與對照品比對,第39個共有峰(tR49.0291min)是巴馬汀,定作參照峰。計算其他各共有峰相對保留時間和相對峰面積比值,按其相對保留時間定性,各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.5%,其中占峰面積10%以上的15,18,19,27,33,37,39,40號峰的相對峰面積的RSD均小于3%。2.5加味四妙丸加味液的峰面積變化2.2項下色譜條件測定對照品、組方藥及其有效部位色譜圖,與GSMP指紋圖譜對比見圖2。根據各色譜峰相對保留時間比值比對,以及對加入定量對照品的與未加入定量對照品的加味四妙丸供試液的峰面積變化進行對比,確定第14,28,37,43,51號峰來源于土茯苓黃酮部位,其中,37號共有峰為落新婦苷;第4,34,38,44號峰來源于忍冬藤黃酮部位;第17,18,46號峰來源于忍冬藤有機酸,其中,第18號峰為綠原酸;第20號峰為黃柏中的紫丁香苷,第11,21,23號峰來源于牛膝,第7,54號峰來源于薏苡仁,其余42個共有峰來源于黃柏生物堿部位,其中,36號峰為藥根堿,39號峰為巴馬汀,40號峰為小檗堿。2.6emp和固相配伍分類按2.2項下色譜條件測定EMP,S3MP,S4MP,GSMPHPLC指紋圖譜,疊加圖見圖3,二妙丸類方與基礎方二妙丸有效部位群的指紋圖譜特征相似。EM基礎方與類方有效部位群共有峰及其相對峰面積比值見表1。EMP指紋圖譜43個共有峰來源于黃柏,其中42個共有峰來源于生物堿部位;S3MP指紋圖譜共有峰在EMP基礎上增加了3個牛膝共有峰;S4MP指紋圖譜共有峰在S3MP的基礎上增加了薏苡仁2個共有峰;GSMP指紋圖譜共有峰在S4MP的基礎上增加了加味藥14個共有峰,來源于加味藥黃酮和有機酸類部位。基礎方EM配伍類方后,生物堿部位共有峰相對峰面積有一定的變化趨勢。小檗堿在配伍后相對峰面積比值相對穩(wěn)定;藥根堿,8,9,22,24,25,26,30,31,32,33,35,41,45,47,49,50,52,53,56,57,59,60號共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)后,相對峰面積比值減小,配伍土茯苓、忍冬藤后(GSM),相對峰面積增加;10,12,13,16,20,29,42,48號共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)及加味藥(GSM)后,相對峰面積有減小趨勢;1,2,3,5,6,15,19,27,55號峰共有峰在S3M,S4M,GSM中相對峰面積有增加的趨勢。EM配伍牛膝、薏苡仁后,多數(shù)共有峰有增加的趨勢。3妙丸類方有效部位指紋圖譜的建立及應用測量方劑配伍規(guī)律是中醫(yī)藥理論的特色和關鍵,以經典方作為基礎方,按其制方規(guī)范加減配伍所形成的多種類方在臨床上應用較多。將傳統(tǒng)醫(yī)學理論與現(xiàn)代科技相結合,研究經典方與其類方的藥效物質基礎變化規(guī)律,闡明類方方劑配伍規(guī)律的科學內涵,是探索方劑配伍規(guī)律的重要途徑之一。中藥復方化學成分復雜,而以有效部位為藥效物質基礎的基本單元,利用現(xiàn)代色譜分析技術,測定有效部位指紋圖譜,符合中藥藥效物質基礎整體性和模糊性的特征要求。在GSMP指紋圖譜中,主要共有峰來源于二妙丸生物堿部位,因此,二妙丸及其3個類方指紋圖譜具有很大的相似性。牛膝、薏苡仁有效部位為皂苷,在該指紋圖譜中不能反映出來,S3MP,S4MP指紋圖譜增加的共有峰較少,而GSMP指紋圖譜中,增加的共有峰來源于加味藥中黃酮和有機酸有效部位。本研究是以巴馬汀為參照峰,其他共有峰是按相對峰面積比值進行比較,因此,生物堿部位的共有峰是相對與巴馬汀相對峰面積的相對變化。多數(shù)生物堿部位共有峰在配伍S3M,S4M后相對含量減少,與前人研究一致。作者通過建立GSMPHPLC指紋圖譜,比較二妙丸類方有效部位群生物堿、黃酮、有機酸有效部位成分信息的特征及其差異,探索類方方劑物質基礎的表征途徑。要全面表征二妙丸類方有效部位群物質基礎特征,還需進一步表征揮發(fā)油、皂苷等有效部位成分特征,并用現(xiàn)代統(tǒng)計分析方法研究多成分-配伍-效應變化的相關性。取GSMP供試品,連續(xù)進樣6次,按2.2項下色譜條件測定色譜圖,各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%,占總峰面積10%以上的共有峰相對峰面積RSD均小于3%,表明精密度良好。按2.1項下方法制備6批GSMP供試品,