毛細(xì)管等電聚焦電泳技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)狀

毛細(xì)管等電聚焦電泳技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)狀

近年來，作為一種特殊的微分離技術(shù)，如毛細(xì)管和其他電聚焦電離作用，取得了很大的發(fā)展，尤其是在分析蛋白質(zhì)、抗體、臨床樣品等生命活性物質(zhì)方面。CIEF最早由Hjertén等根據(jù)平板等電聚焦電泳(IEF)的原理建立。它是將帶有兩性基團(tuán)的樣品、載體兩性電解質(zhì)、緩沖劑和輔助添加劑的混合物注入毛細(xì)管內(nèi),當(dāng)在毛細(xì)管兩端加上直流電壓時,載體兩性電解質(zhì)可以在管內(nèi)形成一定范圍的pH梯度,樣品組分依據(jù)其所帶電性向陰極或陽極泳動,柱內(nèi)pH值與該組分的等電點(pI)相同時,溶質(zhì)分子的凈電荷為零,宏觀上該組分將聚集在該點不再進(jìn)一步遷移,達(dá)到使復(fù)雜樣品中各組分分離的目的。CIEF與IEF相比具有耗時短、樣品用量少、易于自動化等諸多優(yōu)點,與毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管電動力學(xué)色譜等其他分離模式相比也具有峰容量大、對兩性溶質(zhì)的選擇性好等特點。隨著CIEF應(yīng)用范圍的不斷拓寬,關(guān)于CIEF的理論研究包括計算機(jī)模擬都取得很大進(jìn)步,在CIEF分離分析技術(shù)方面也取得了長足的發(fā)展。1cas聯(lián)合cief法CIEF實驗使用的載體兩性電解質(zhì)(CAs)一般是由多胺化合物(如:四乙烯四胺、四乙烯五胺)和α-,β-不飽和羧酸(如:丙烯酸)隨機(jī)聚合制得的混合物,其中包含有數(shù)以千計的不同等電點的化合物,足以滿足所需要的pH梯度。對于要求得到更加連續(xù)、均勻的pH梯度的場合,如測定pI值,可以選擇混合CAs。目前有多種品牌的寬等電點范圍(pH3～10,2～11)或窄等電點范圍(pH6～8,9～11)的CAs供應(yīng),這些產(chǎn)品大多直接取于平板IEF,紫外吸收較強(qiáng),實驗中通常只能選擇280nm波長進(jìn)行紫外檢測,導(dǎo)致檢測靈敏度較214nm處大大降低,從而限制了其應(yīng)用范圍。因此有人嘗試不用CAs的CIEF技術(shù),即通過電解純水分別產(chǎn)生氫離子和氫氧根離子,再利用電遷移的方法把氫離子和氫氧根離子引入毛細(xì)管中形成pH梯度,并且向陽極池中加入酸、向陰極池中加入堿來鞏固pH梯度,實現(xiàn)了在純水中分離蛋白質(zhì)。采用動態(tài)pH梯度、無CAs的CIEF方法具有簡單、經(jīng)濟(jì)的特點,但形成的pH梯度極不穩(wěn)定,操作難度相對較大。Fang等使用了一種稱作熱致pH梯度(thermallygeneratedpHgradient)的方法,即在臺錐形毛細(xì)管兩端加上電壓,由于管徑的不同,相同的電流可以在毛細(xì)管內(nèi)不同位置產(chǎn)生不同的溫度,沿管軸形成溫度梯度,從而導(dǎo)致pH梯度的實現(xiàn),使pH梯度的范圍與毛細(xì)管錐度成一定比例關(guān)系。另外,動態(tài)pH梯度也可以通過在毛細(xì)管中引入不同濃度的酸、堿并使之在管內(nèi)動態(tài)地混合而形成。固定pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)技術(shù)在二維凝膠電泳中已經(jīng)得到普遍使用。IPG的使用導(dǎo)致溶液粘度上升,能夠極大地降低溶質(zhì)的擴(kuò)散,可以獲得0.001pH單位的分辨率,而目前CIEF僅能實現(xiàn)0.01pH單位水平的分辨率。但是IPG僅能實現(xiàn)窄范圍的pH值梯度,并且這種方法難以在CIEF中實現(xiàn)。2動態(tài)涂層的制備毛細(xì)管管壁的吸附作用和由管壁雙電層產(chǎn)生的電滲流(EOF)是影響CIEF分離的重要因素。電滲流過大會導(dǎo)致樣品快速通過毛細(xì)管,難以實現(xiàn)聚焦;而管壁的吸附作用使峰寬加大,分辨率降低,甚至滯留樣品,影響分離和檢測。因此,通常需要對使用的毛細(xì)管管壁進(jìn)行處理。對毛細(xì)管管壁進(jìn)行處理包括動態(tài)涂層和靜態(tài)涂層兩種方法。靜態(tài)涂層是對毛細(xì)管管壁進(jìn)行處理的傳統(tǒng)方法,主要包括物理涂層和化學(xué)涂層兩種,此外還有物理-化學(xué)法等。不同方法的涂層穩(wěn)定性差別較大,其中化學(xué)涂層的穩(wěn)定性相對更高。動態(tài)涂層是在溶液中加入聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、纖維素衍生物等親水性高聚物,使其動態(tài)吸附在毛細(xì)管壁上,部分遮蓋住SiO-,降低EOF,從而使聚焦過程得以進(jìn)行。動態(tài)涂層不能完全消除EOF,殘余的EOF可以用于移動樣品區(qū)帶,使聚焦和樣品移動同時進(jìn)行。精心選擇的動態(tài)涂層在某些情況下也可以得到非常理想的分離結(jié)果。例如采用含3.2%～4.8%CAs(Ampholine3-10)、0.06%～0.18%甲基纖維素(MC-1500)、0.8%N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)及1%～2%的?；撬?taurine)緩沖溶液分離人血清白蛋白(humanserumalbumin)和人表皮生長因子(humanepidermalgrowthfactor),結(jié)果表明該方法不僅可用于分離酸性、中性、堿性蛋白質(zhì),也可通過引入pI內(nèi)標(biāo)測定組分的pI值。動態(tài)涂層的優(yōu)點是簡單、方便,毛細(xì)管可以長期反復(fù)使用,但同時也存在穩(wěn)定性相對較差、極端pH情況容易導(dǎo)致峰展寬等缺陷。目前,CIEF中更普遍采用涂層毛細(xì)管的方法。毛細(xì)管的涂層分為硅氧鍵型(SiOCR)和硅碳鍵型(SiCSiRR′R″)兩大類。聚丙烯酰胺涂層是最常用的CIEF毛細(xì)管涂層之一,已經(jīng)廣泛用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和各種酶類的分析分離。由于聚丙烯酰胺中的酰胺基在堿性溶液中易于水解,在高pH條件下的穩(wěn)定性較差,導(dǎo)致管內(nèi)涂層不均勻,限制了毛細(xì)管的使用壽命。聚乙烯醇(PVA)涂層通過在毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合上聚醋酸乙烯并進(jìn)一步水解制得,可以在較寬的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定使用,在分析糖蛋白過程中具有比聚丙烯酰胺涂層更好的重現(xiàn)性。含氟烴涂層(fluorocarboncoating)也較穩(wěn)定,常規(guī)CIEF條件下可以使用上百次。纖維素類涂層也較常用,將內(nèi)徑為100μm且涂布羥丙基甲基纖維素的毛細(xì)管用于CIEF實驗中測定酵母細(xì)胞,細(xì)胞濃度低于3個/μL時可得到極好的重現(xiàn)性,峰容量可達(dá)4000(文獻(xiàn)原文表述)。其他諸如聚硅氧烷、聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、甲殼素類、麥芽糖(maltose)涂層都有報道,但是對它們的使用相對較少。3柱內(nèi)檢測方式CIEF常用的檢測方法包括紫外吸收法、質(zhì)譜法、熒光法、電化學(xué)法和化學(xué)發(fā)光法等。具體實驗中根據(jù)實際需要采用全柱掃描檢測、在線柱間檢測和柱尾檢測的模式。其中在線柱間檢測是CIEF最常采用的,它是在一定的操作條件下,使聚集后的區(qū)帶通過檢測窗口,并直接采用光學(xué)檢測器進(jìn)行檢測。當(dāng)采用聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測時,通常需要采用柱尾檢測的方法,使柱尾流出的組分通過電化學(xué)檢測器或?qū)⑵湟胭|(zhì)譜儀。3.1全柱成像檢測CIEF中使用全柱掃描檢測具有諸多優(yōu)點[13,28,29,30,31,32,33]:由于檢測過程中樣品區(qū)帶不移動,因而能夠極大地縮短分析時間、提高分辨率,并且可以實時監(jiān)測聚焦過程,經(jīng)一次實驗即可找出最佳聚焦時間。通過對多次掃描數(shù)據(jù)的平均還能夠提高信噪比(S/N)。最簡單的全柱掃描檢測裝置是利用機(jī)械裝置平穩(wěn)移動毛細(xì)管、通過單點檢測器實現(xiàn)。由于省略了遷移過程而使聚焦時間縮短,一般整個分析過程僅需2min。全柱掃描檢測經(jīng)常使用通用折射率梯度成像檢測器(URIGID)。其方法原理是:激光束(He-Ne633nm或者二極管670nm)經(jīng)校準(zhǔn)后分解為多束,聚焦在毛細(xì)管柱上,穿過樣品帶和管壁,經(jīng)過兩層管壁和樣品的折射之后仍按原來的方向射出;利用電荷耦合器件(CCD)或者光電二極管將該光束信號記錄下來,其信號強(qiáng)度正比于折射率梯度而非折射率本身。折射率檢測的靈敏度較低,雙光束設(shè)計可改善靈敏度和檢測限。任何折射率與緩沖溶液有差別的組分都可以使用這種檢測方法。折射率梯度成像檢測受載體吸收的影響較大,但檢測限依然可達(dá)10-8～10-7mol/L,采用小分子載體兩性電解質(zhì)有利于提高檢測靈敏度。吸光光度、熒光等檢測手段也適宜于CIEF全柱掃描檢測。吸光光度法可以在415nm下檢測有色蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞色素C)、在280nm下檢測其他蛋白質(zhì)。激光誘導(dǎo)熒光檢測是目前最靈敏的方法之一,即使只收集到10%的發(fā)射熒光信號,濃度檢測限也可達(dá)到10-11mol/L,物質(zhì)的量檢測限可達(dá)4.5×10-17mol,其缺點是熒光標(biāo)記后的樣品可能具有不同的pI,或者產(chǎn)生不止一個標(biāo)記物。全柱檢測使用的柱長一般相對較短,通常為4～10cm,這使得進(jìn)樣量和峰容量受到限制。3.2微透析類接口質(zhì)譜(MS)是被研究得最多的CIEF聯(lián)用技術(shù)。MS使用軟電離方法已經(jīng)能夠處理很高分子質(zhì)量的生物大分子,分子質(zhì)量的測定精度可以達(dá)到1u的水平;通過對MS數(shù)據(jù)的分析處理還可以獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)信息。CIEF與MS聯(lián)用研究的關(guān)鍵是接口技術(shù)。采用包層液接口(SFJ)的CIEF/MS聯(lián)用技術(shù)可以達(dá)到10-7mol/L的檢測限。但是SFJ常將過多的帶電粒子引入流出物中,而MS儀器具有特定的離子俘獲能力,太多的蛋白質(zhì)同時進(jìn)入將導(dǎo)致其線性范圍降低。微透析類接口的使用已經(jīng)相當(dāng)常見,有文獻(xiàn)報道使用一種特殊的接口技術(shù),可以克服SFJ的這個缺點,同時可以使用水溶液流動相,并且樣品用量較少。這種接口采用外徑250μm的聚亞砜半透膜管,用來套接分離毛細(xì)管和一支短的錐形小毛細(xì)管,后者接MS電噴霧接口。實驗當(dāng)中將無機(jī)鹽和低分子質(zhì)量的兩性載體滲出管外,而被分析組分如馬肌紅素(horseheartmyoglobin)、碳酸脫氫酶I(carbonicanhydraseI)、β-球蛋白A(β-lactoglobulinA)等則沿著毛細(xì)管到達(dá)MS儀器。MS的另一改進(jìn)是傅里葉變換離子回旋共振(Fouriertransformioncyclotronresonance,FTICR)技術(shù)。采用這種技術(shù)的電噴霧離子源質(zhì)譜(ESI-FTICR-MS)能夠同時實現(xiàn)超高分辨率、高精度和高靈敏度的測定,檢測組分的分子質(zhì)量可達(dá)106u。在此條件下可以直接檢測分子質(zhì)量相差1u的人血紅素A和C(HbA和HbC)。誘導(dǎo)耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)與CIEF聯(lián)用可以用于測定多種小分子化合物,例如不同價態(tài)的有機(jī)化合物或無機(jī)化合物。3.3軸向照射法檢測紫外-可見檢測方法雖然對于蛋白質(zhì)等的檢測靈敏度相對較低,但通過濃縮技術(shù)可以達(dá)到檢測靈敏度0.5mg/L(pH3～10)、峰容量720(柱長65cm)、信噪比大于3、基線分離分辨率為0.01pH。采用軸向照射方法顯然可以極大地增加光程長度,例如在低折射率的聚四氟乙烯管中加入含高折射率有機(jī)物如甘油的混合樣,使得激發(fā)光束被限制在管中傳播。用此方法分析兩種天然熒光蛋白(R-藻紅蛋白和綠熒光蛋白),檢測濃度可達(dá)10-13mol/L,對R-藻紅蛋白的檢出限達(dá)10-19mol?；瘜W(xué)發(fā)光檢測靈敏度比光譜、熒光法高102～106倍,并且設(shè)備簡單,操作容易。例如采用魯米諾-H2O2體系柱后檢測細(xì)胞色素C,靈敏度達(dá)10-9mol/L,峰高-濃度線性范圍為10-6～10-9mol/L。此外,一些特殊的檢測方法也被用于CIEF檢測,例如γ-射線檢測器能夠在5.1×10-14到2.55×10-12g/L之間獲得非常好的線性。4重點過程中的條件優(yōu)化4.1遷移方式的改進(jìn)CIEF中對進(jìn)樣的要求通常不如毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)中那么嚴(yán)格。CZE中一般要求進(jìn)樣量低于毛細(xì)管體積的1%左右,才能獲得比較好的分離效果;而CIEF操作中完全可以將整個毛細(xì)管柱灌滿,因而可以處理比CZE更多的樣品。CIEF中將樣品導(dǎo)入毛細(xì)管可采用流體動力學(xué)和電泳兩種模式。流體動力學(xué)模式又可以分為壓力和真空兩種方法。電泳進(jìn)樣由于組分電泳速度的差別可能導(dǎo)致不同組分的進(jìn)樣量不匹配。除非使用全柱檢測方法,否則聚焦完成后必須移動樣品使之通過檢測窗口來實施檢測。遷移樣品的方法包括電滲流、壓力/真空、化學(xué)驅(qū)動?；瘜W(xué)驅(qū)動法通過在陰極或陽極池中加入酸、堿、鹽(通常是NaCl)來改變pH梯度分布使樣品流出,不過這種方法對末端組分效果較差,改進(jìn)的辦法是用兩性電解質(zhì)代替NaCl。在采用陰極遷移方式時,pI值比較低的兩性電解質(zhì)能夠改善酸性組分的遷移;而pI值適中的兩性電解質(zhì)可以改善酸性和中性組分的遷移。在不切斷電源的情況下利用一定的真空度遷移分離區(qū)帶,這種方法既能夠保持流形基本不變,也不破壞pH梯度,又使遷移速度加快,可取得很好的遷移效果。4.2表面活性劑的加入組分聚焦在等電點處時其凈電荷為零,分子間原本存在的靜電排斥消失,再加上CIEF特有的濃縮作用,生物大分子特別是蛋白質(zhì)極易相互聚集,進(jìn)而產(chǎn)生沉淀(蛋白質(zhì)沉淀后往往給出非常尖銳的峰或者峰形帶毛刺)。另外,疏水性強(qiáng)的組分如膜蛋白在水溶液中溶解度很小,因此需要一些添加劑如尿素、乙二醇、表面活性劑、蔗糖、山梨醇糖等防止沉淀或起增溶的作用。此外,在溶液中加入甲基纖維素還可以隨時填補(bǔ)涂層的流失。使用在線檢測的方法可能會遇到聚焦組分超出檢測窗口,處于檢測死區(qū)的情況,通過向溶液中添加TEMED可以解決這個問題。添加TEMED可以擴(kuò)展pH范圍,從而在陰極端建立一個pH平臺,將組分往低pH區(qū)域“推擠”,使全部組分都聚焦在檢測窗口的一側(cè),在遷移過程中都能通過檢測點。4.3電流強(qiáng)度的影響一定濃度的鹽溶液有利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的天然構(gòu)象,疏水性蛋白和一些抗體中也需要有一定濃度的鹽才能形成穩(wěn)定溶液。但是在CIEF中鹽的濃度過高會影響pH梯度、增加聚焦時的電流強(qiáng)度、使焦耳熱加大,導(dǎo)致分離效率下降,因此通常需要對實際樣品進(jìn)行脫鹽處理。蛋白質(zhì)的脫鹽處理可以在聚焦前實施,包括透析和過濾等方法;也可在線使用透析法或電壓梯度法脫鹽。電壓梯度法是在一定時間內(nèi)使毛細(xì)管兩端的電壓從0逐漸上升到一個比實際聚焦電壓低的值,根據(jù)鹽離子淌度大于蛋白質(zhì)的特點,使其快速移出毛細(xì)管,當(dāng)鹽濃度降到適宜的范圍時再進(jìn)行CIEF操作。仔細(xì)設(shè)計升高電壓的程序,人血液、腦脊髓液等樣品可以直接上柱分析,無需預(yù)先處理。4.4cief的基礎(chǔ)柱長、操作電壓、聚焦和遷移時間等都會對分離結(jié)果產(chǎn)生影響。短柱(可短到1.2cm)與全柱檢測方法結(jié)合,可以極大的加快分析速度。長柱能獲得較大的峰容量,但是色譜柱太長又會帶來操作上的困難。通常使用的柱長是10～80cm。高電壓是CIEF高分辨率的基礎(chǔ),但是過高的電壓將會導(dǎo)致焦耳熱過大,使溶液粘度降低,組分?jǐn)U散加劇,降低分離效率。一般操作電壓選擇200～1000V/cm。聚焦時間必須足夠,應(yīng)避免聚焦尚未完成即開始遷移。但是聚焦時間也并非越長越好,因為在毛細(xì)管中停留太久,將會增加分子的擴(kuò)散距離和產(chǎn)生沉淀的機(jī)會。常用聚焦時間為3～30min。通常認(rèn)為