pcr擴(kuò)增的原理和步驟

PCRPCRPCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒从车暮喎Q，指在引物指導(dǎo)下由酶化的對特定模板(克隆或基因組DNA)的擴(kuò)DNADNA片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等.PCRDNA為模板，4dNTP3,DNA得到極大程度的擴(kuò)增.在微量離心管DNADNA膜dNTPTaqDNA聚合醇、Mg2件.反映時(shí)先將上述溶液加熱,DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態(tài)：然后減少溶液溫度,使合成引物在低溫下與其祀序列配對，形成部分雙鏈，稱為堰火；再將溫度升至適宜溫度.在TaqDNA聚合酶的化下，以dNTP為原料，引物沿方向DNA片段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重夏變化溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸構(gòu)成一種周期，重復(fù)循環(huán)，使目的基因得以快速擴(kuò)増.PCR循環(huán)過程為三部分構(gòu)成：模板變性、引物退火、痢穩(wěn)定DNA聚合酶在適宜溫度下化DNA鏈延伸合成(見圖)。DNA便它與引物結(jié)合.DNAG-C含量有關(guān)，GCA-T間只有兩個(gè)狙鍵相連.因此Gt含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高些.PCRDNA變性需要在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞破(DMSO),PCR97-C,時(shí)DNA37-65CDNA棋板?引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核昔酸的堿基構(gòu)成。一般規(guī)DNA?2minDNA模板-引物復(fù)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反映原料，靶序列為模板.按基獲得更多的“半保存復(fù)制鮭”，并且這種新鮭又可成為下次循環(huán)的模板.延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長度。在72*C條件下,Taq DNA聚合醪化的合成速度大概為40?60個(gè)堿基,秒.通過一輪“變性-退火-延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在后來的循環(huán)中,DNA都能夠起模板作用，因此每一輪循環(huán)后來，DNA拷貝數(shù)就増加一倍.每完畢一種循環(huán)2?4min,PCR30?402?3丄擴(kuò)増?jiān)缙?，擴(kuò)増的量呈直線上升，但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)成一定比值時(shí).酶的化反映趨于抱和，便出現(xiàn)所謂的“平臺效應(yīng)”.即爬DNAPCRDNA擴(kuò)増暈呈指數(shù)上升.DNA擴(kuò)増量可用Y=(1+X)■*計(jì)算.YDNA片段擴(kuò)増后的拷貝數(shù)，X表達(dá)平(Y)均每次的擴(kuò)増效率，n代表循環(huán)次數(shù)。100%,DNA片PCRDNA片段不再呈指數(shù)増加而進(jìn)入観性増長久或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、AR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素大多數(shù)狀況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴(kuò)増產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分.5,端之間.是需要擴(kuò)増的特定片段.短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的棋板不同樣而形成的,以一種原始模板為例，在第一種反映周期中.DNA3,端開始延".與原始棋板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（即“長產(chǎn)物片段”）DNA片段供分析與檢測用.二、PCRPCR反映的物質(zhì)重要為五種：引物、酶、dNTP,M葉I-PCR特異性反映的核心，PCRDNA.在體外大蛍擴(kuò)増"3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ).另首先引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾構(gòu)造,DNA聚合反映（即錯(cuò)PCRTm值這個(gè)和擴(kuò)増物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù).好的引物設(shè)計(jì)能夠避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生,RNA-PCRcDNA或基M曹愀度,使用特殊的共溶劑如二甲基亞<1）PCR特異性一殷通過引物長度和退火溫度來控制.15-3Qbp?18?27bp,38bp.TmTm74T,不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反映，并且合成長引物還會大大增加合成費(fèi)用?G4C40?60%GC含賞不能Tmttl是寡核昔酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核昔酸雙鏈解鏈的溫Tm5~IOC.Tm=4（G+C）+2（A+T）Tm值，Tm55?80*C,Tm72"C以使復(fù)性條件最佳。引物中四種堿基的分布最佳是隨機(jī)的，不要有聚嗥吟或聚嘖噬的存在.3,3GC,因這樣會使引物G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)?引物二級構(gòu)造涉及引物本身二聚體、發(fā)卡構(gòu)造、引物向二聚體等.這些因素會影響引物和模板3'AG不不大于.5.0kcal/mol或少于三個(gè)持續(xù)的堿基互補(bǔ)，由于此種情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定構(gòu)造的可能性，引物中影響發(fā)卡構(gòu)造的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對的鍵能之外，與莖環(huán)構(gòu)造形式亦有很大的關(guān)系.應(yīng)盡3,末端有發(fā)卡構(gòu)造的引物.3味端和模板的堿基完全配對對于獲得好的成果是非常重要的,356個(gè)核昔酸的錯(cuò)配應(yīng)盡量的少.3,末端的錯(cuò)配過多,通過減少反映的退火溫度來賠償這種錯(cuò)配不會有3,末端的另一種問題是避免一對引物內(nèi)的同源性.3,末端.引物間的互補(bǔ)將造成不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn),PCRPCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。3,.5AG?AG3,AGDNA聚合反映.需要注意的是.3,33位易發(fā)生簡并.A3個(gè)堿基.因此應(yīng)3'A。5,PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)増?zhí)禺愋詮懖淮?。因此，能夠被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性.5,端修飾涉及：加酶切位點(diǎn)：標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、E3垸如引入蛍白質(zhì)DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等.對于引入一至兩個(gè)酶70%8DNA之間要沒有明顯的相似序列。TaqDNADNA聚合酶，是從水生柄熱歯（Thennusaquaticus）中分離的.TaqDNA聚94000Da.5—＞3的聚合酵活力，5」＞3,T載體），在體外實(shí)驗(yàn)中，TaqDNA聚合酶的出錯(cuò)率為葉?1。%PCR（】）70C290%以上.93C2小時(shí)后其殘留60%,95C240%。（2）PCR2.0kb,且特異性也較高PCR的廣泛應(yīng)用得益于此酶,Taq酶，有用于長片段擴(kuò)増PCR2.5u（50gl時(shí)）’濃度過高可引發(fā)非特異性擴(kuò)dNTPdNTPPCR擴(kuò)增效率有親密關(guān)系，dNTP7.0?7.5,小量分裝，-20*CdNTPPCRdNTP?200呻。1/1.4dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾個(gè)時(shí)（偏高或間氐），就會引發(fā)錯(cuò)配.PCR.dNTPM。+結(jié)Mg?濃度減少。模板（靶基因）棋板核酸的量與純化程度.PCR成敗與否的核心環(huán)節(jié)之一,DNASDSK來消化解決標(biāo)本。SDS的重要功效是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解脫蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白.SDSKDNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑（酚與氯仿抽〉抽提除去蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份.用乙PCR反映.法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,PCR擴(kuò)増.DNADNAl~10ng可迭擇幾個(gè)濃度梯度（10倍為一種梯度）.PCR反映中，過高的模板投入：fi往往會造PCR實(shí)驗(yàn)的失敗。MMg2+對PCR擴(kuò)増的特異性和產(chǎn)量有明顯的彩響.在普通的PCRdNTP200呻ol/lTaqDNA聚合酶的活性.TaqDNAMg?他已添加,Mg2,的緩沖液,PCRMg2\三、PCRPCRPCR反映的特異性決定因素為：（1）DNAI（2）堿基配對原則|TaqDNA聚合酶合成反映的忠實(shí)性】（4）靶基因的特異性與保守性TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反映中棋板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大増加，被擴(kuò)増的靶基因片段也就能保持很高的對的度.再通PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pgFF%gg=IOGg）水平.能從】00萬個(gè)細(xì)胞中檢出一種靶細(xì)胞：在病毒的檢測中，PCR3（3PCRTaqDNA聚合繭,一次性地將反映液加好后,PCR延伸反映,2?4PCR儀（SPCR儀）PCR反映的成果，故耗時(shí)將更短.不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNARNA等均可作為擴(kuò)增模板.可直接DNA擴(kuò)増檢測.PCR一、PCRPCR反映條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)基于PCR原理三環(huán)節(jié)而設(shè)貿(mào)變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn).在原則反映中釆用三溫度點(diǎn)法'DNA90?95*C40?60*C,70?75C.TaqDNA聚合酶的作用下.使引物鏈沿棋板延伸.對于較短靶基因（100?300bp時(shí)）可釆用二溫度TaqDNAB仍有較高的化活性）。?94TIminDNA93C為高溫環(huán)境對醇的活性有影響.PCRPCR敗退火（復(fù)性）PCR結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰擅。退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長度、堿基構(gòu)成及其濃20個(gè)核昔酸，G+C50%的引物，55*C為選擇最適退火溫度Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值＜5?10C）Tm值允許范疇內(nèi).選擇較髙的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提髙30?60延伸溫度與時(shí)間*TaqDNA聚合醵的生物學(xué)活性：70?80C,150核昔酸/S博分子】7or60核昔酸/S/酶分子；55C,2490C時(shí).DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR70?75C72C,過高的延伸溫度不利于引物和棋板的結(jié)合.PCRIkbDNA片段,Imin是足夠的。3?4kb3?4min：lOkb需延伸至】5min?延伸進(jìn)間過長會PCR擴(kuò)増程度。PCRDNA30-40PCRPCR產(chǎn)物與否為特異性擴(kuò)増.對的的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可根據(jù)研究對象和目的不同而釆用不同的分析辦法。凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB漠乙錠染色紫外儀下觀察.初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCRPCR,,聚丙烯酰胺凝膠電泳：6-10%PCRPCRPCRSouthern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核昔酸鏈（內(nèi)部寡核昔酸）.PCR產(chǎn)物雜交.此法既可作特異性鑒定.PCR產(chǎn)物的敏捷度，還可知其分子量及條PCR察有無著色斑點(diǎn),PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。PCRPCRPCR48h以內(nèi)，有些最佳于當(dāng)天電泳檢測,48h后帶型不規(guī)PCR模板：①棋板中含有雜蛋白質(zhì),Taq醸克制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蚩白：④在提取制備模板時(shí)丟失過多.在酶和引物質(zhì)量好時(shí).酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析與否因酶的活性喪失或不夠而造成假陰性.Taq酶或漠乙錠。<3）PCR失敗或擴(kuò)増條帶不抱① OD值，更要注藏引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，并且兩引物帶的亮度應(yīng)大致一致.PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決. 引物度高濃度小最分裝保存，避免多次凍融或長久放冰箱冷藏部分,Mg?，濃度：Mg?+PCRPCRPCRPCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶?PCR20偽、301、50100囚,用多大PCR201后，再做大致PCR擴(kuò)増來說相稱重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)増而減少特異性擴(kuò)増效率退火溫度過髙影響引物與模板的結(jié)PCR失敗的因素之一.靶序列變異：如祂序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合.PCR擴(kuò)增是不會成功的。PCRPCRPCR產(chǎn)物為非目的性的序列.黑序列太短或引物太短.容易出現(xiàn)假陽性.需重新股計(jì)引物.靶序列成擴(kuò)増產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種因素：一是整個(gè)基因構(gòu)成大片段的交叉污染，造成假陽性。這種假陽性可用下列辦法解決：（D操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，避免將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除薛及不能耐高溫的物質(zhì)外，全部試劑或器材均應(yīng)髙壓消毒.所用離PCR產(chǎn)物，而造成假陽性的產(chǎn)生,PCR辦法來減輕或消除。PCR擴(kuò)増后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特Mg2+PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。另首先是酶的質(zhì)和量,擴(kuò)増.其對策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物.②減低酶量或調(diào)換另一來源的醇.加模板量，減少循環(huán)次數(shù).（93P變性.65CPCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶.其因素往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高,M矽?濃度過高，退火溫度過低'循環(huán)次數(shù)過多引發(fā).其對策有，（DdNTP的濃度：③適宜減少濃度.④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。釋成其它濃度。分裝過程注意避免污染（如釆用雙蒸水滅菌后分成小管單獨(dú)保存于冰箱作為PCRNawRNas