survilin在人宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌組織中的表達

survilin在人宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌組織中的表達

0單次給藥后整體管理作用survivm是發(fā)現(xiàn)的影響因素。利用桿狀病毒死亡抑制蛋白的重復(fù)序列（bir），并將其與campas3、7和9結(jié)合，以抑制細胞的死亡。位于絲綢和中間的紡織錘體上，以調(diào)節(jié)細胞周期。survivin蛋白在多種惡性腫瘤中過量表達,與腫瘤的發(fā)病、侵潤及預(yù)后密切相關(guān),survivin蛋白在宮頸癌中過量表達已經(jīng)免疫組化法證實,但其復(fù)雜的功能與亞細胞定位的關(guān)系仍未闡明,另外,survivinmRNA在宮頸癌及其癌前病變組織中的定量檢測,及其能否在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控survivin蛋白的表達仍待研究。本研究采用免疫組化法和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測宮頸癌和宮頸癌前病變中survivinmRNA和survivin蛋白的表達,以期評估survivin作為一個腫瘤特異性因子在宮頸癌早期診斷及預(yù)測患病危險度中的價值。1數(shù)據(jù)和方法1.1數(shù)據(jù)收集1.1.1例患者的影像學處理所有標本均取自三峽大學第一附屬醫(yī)院婦科住院部手術(shù)病例和門診陰道鏡室病理活組織檢查病例,包括10例宮頸炎組織、15例癌前病變組織和30例宮頸浸潤癌組織?；颊咧熬醋鲞^放化療。所有標本均由病理科確診,按組織學分級:高分化5例,中分化15例,低分化10例。臨床分級按FIGO1995年標準:30例宮頸癌病例均為磷癌,其中Ⅰ期14例,Ⅱ期16例。三組的平均年齡為47歲。標本離體后立即分為兩份,一份放入液氮中速凍,然后移至-80℃冰箱保存待用;另一部分置于10%福爾馬林溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片。1.1.2試驗劑和試劑即用型survivin多克隆抗體和SABC免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,實時熒光定量PCR相關(guān)試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。1.1.3urviren-r及有限擴增株的構(gòu)建survivin(NM_001012271)探針和引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。survivin-F:5′-AACACTGCTGTGGACCCTACT-3′,survivin-R:5′-GACAACTGCGTCTCTGCCAG-3′,survivin-P:5′-(FAM)CATCCTCACTGCGGCTGTCTGGGC(Eclipse)-3′,擴增片段長度為129bp。GAPDH-F:5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3′,GAPDH-R:5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′,GAPDH-P:5′(FAM)-AACAGCGACACCCACTCCTCCACC(Eclipse)-3′,擴增片段長度為130bp。1.2方法1.2.1免疫組化1.2.1.1.sabc免疫組化法檢測自離醇蛋白的發(fā)現(xiàn)切片常規(guī)脫蠟水化,微波修復(fù)10min,嚴格按照試劑盒說明書進行操作,用已知陽性片作為陽性對照,將磷酸鹽緩沖液代替一抗做為陰性對照。1.2.1.色為陽性survivin陽性染色判斷:以出現(xiàn)淡黃色至深棕黃色為陽性,見圖1、2。運用LeicaQ500IW(德國)自動圖像分析系統(tǒng),在×400鏡下隨機選取5個視野,提取陽性區(qū)域測定總光密度值(SumIOD)。1.2.2采用實時熒光定量pcr方法測定了survidimn1.2.2.mdna的反轉(zhuǎn)錄嚴格按Trizol說明書提取組織總RNA,所提取的總RNA通過A280/A260比率檢測其純度;經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見明顯的28S、18S兩條帶,證明其完整性。之后立即進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為25μl,取11μl總RNA中與1μlOligo(dT)15Primer混勻,70℃水浴5min后冰上驟冷,再分別加入:M-MLV5×Reactionbuffer5μl,10mMdNTPs5μl,RNA酶抑制劑25U,200U/μlM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl,加DEPC水至25μl;37℃水浴60min,反應(yīng)后產(chǎn)物于-20℃冰箱中保存待用。1.2.2.單次pcr擴增(1)DNA標準品的制備DNA標準品為構(gòu)建的線性化質(zhì)粒,是將519bp目的基因片段克隆到pMD18-TVector上,然后將純化后的質(zhì)粒用HindⅢ限制酶進行線性化處理,經(jīng)PCI抽提、乙醇精制后得到標準品。在分光光度儀上測的OD260和OD320的值,依據(jù)公式:(OD260-OD320)×稀釋倍數(shù)×50計算出標準品的濃度。依據(jù)公式:標準品濃度×6.02×1023×10-9/(目的片段長度+質(zhì)粒DNA長度)×660計算出survivin的純化質(zhì)粒的拷貝數(shù)為6.0×1010,用EASYDilution按10倍梯度進行稀釋(107、106、105、104、103、102、101copies/μl)作為制作survivin基因的標準曲線的模板。(2)標準品和樣本模板的擴增將標準品和樣本模板同時進行擴增,反應(yīng)總體積為25μl,反應(yīng)體系包括cDNA反轉(zhuǎn)錄液2μl,5μmol/L正、反向引物各0.5μl,6μmol/L探針0.6μl,TaKaRaExTaqHS0.25μl,5×RealTimePCRBuffer(Mg2+Free)5μl,dNTPsMixture(10mmol/L)0.75μl,Mg2+Solution(250mmol/L)0.5μl,加水至25μl。擴增條件為:95℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶;隨后進入擴增循環(huán)95℃5s、60℃20s,45個循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)PCR擴增曲線得出各測量標本的Ct(Thresholdcycle)值,見圖3。每批標本均以標準質(zhì)粒作為陽性對照以水作為陰性對照,所有實驗標本均重復(fù)擴增3次。以(1×107～1×101)copy/μl7個濃度的標準品Ct值繪制標準曲線圖,見圖4。根據(jù)GAPDH的Ct值校正survivin的Ct值,依據(jù)校正后的Ct值根據(jù)計算出每個模板的起始拷貝數(shù)。1.3統(tǒng)計處理采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、單因素方差分析和直線回歸分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1宮頸炎、妊娠前病變和睪丸浸漬癌組織中表達比較鏡下示survivin蛋白主要定位于細胞漿內(nèi),見圖1、2。在宮頸炎、宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌組織中均表達,但三者間均存在顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05),宮頸浸潤癌中表達量最高,而宮頸炎組織中僅微量表達,見表1。2.2酶解-創(chuàng)造-酶mdh檢測10例宮頸炎組織、15例宮頸癌前病變組織、30例宮頸浸潤癌組織中均檢測到survivinmRNA,結(jié)果提示GAPDH在所有檢測標本中亦均表達。survivinmRNA在宮頸炎組織中僅微量表達,在癌前病變和浸潤癌中表達逐步明顯增高,見表1,具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.3iiiinrna的表達量宮頸浸潤癌中survivin蛋白和survivinmRNA的表達量在臨床分期組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而在年齡、組織學分級分組間的表達量無統(tǒng)計學差異,見表2。2.4n蛋白和司表1的相關(guān)性癌前病變和宮頸浸潤癌組織中survivin蛋白和survivinmRNA的表達量均顯著相關(guān)(P=0.03和P=0.01),而在宮頸炎組織中兩者無相關(guān)性,見表1。3單次給藥后患者中以不同蛋白和相關(guān)基因型mdna的表達抗凋亡分子表達上調(diào)是惡性轉(zhuǎn)化細胞和腫瘤細胞逃避凋亡機制的主要途徑之一,survivin是目前發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用最強的腫瘤特異性因子之一,其組織分布具有明顯的腫瘤特異性,在胚胎組織中表達豐富,在除胎盤、胸腺和生殖腺外的正常分化組織和癌旁組織均無表達,而在細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡變時又重新表達,在大多數(shù)腫瘤組織中如:肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等過量表達。目前研究者們利用反義寡核苷酸、RNA構(gòu)成酶、survivin反義表達載體、基因沉默技術(shù)和疫苗等方法靶向作用于survivin用于腫瘤的診斷和治療。survivin做為一個具有潛在臨床價值的腫瘤標記物,在宮頸癌中的相關(guān)研究還甚少。本實驗免疫組化實驗數(shù)據(jù)表明survivin蛋白隨著宮頸病變的進展表達量逐步明顯增高,而在宮頸炎組織中僅微量表達,與以往報道一致,此外,VischioniB等指出survivin蛋白復(fù)雜的功能依賴其亞細胞定位,本實驗結(jié)果表明survivin蛋白在宮頸浸潤癌中主要定位于細胞漿,提示其復(fù)雜的功能在胞質(zhì)中被實現(xiàn),與LiF等結(jié)果一致。survivinmRNA過量表達已在多種腫瘤中得到證實,我們的實驗數(shù)據(jù)提示其在宮頸炎組織、宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌組織中的表達量分別為:0.9×105,10.3×105,20.3×105,在宮頸癌前病變組織中的表達量比宮頸炎組織高11倍,浸潤癌組織中表達量比癌前病變高22.6倍,三者間比較差異有顯著的統(tǒng)計學意義,提示survivinmRNA可作為宮頸癌早期診斷和預(yù)測患病危險度的一個可靠指標。此外survivinmRNA與患者年齡、組織學分級無關(guān),僅與臨床分期相關(guān),但MagaliE等采用半定量技術(shù)檢測指出survivinmRNA在宮頸癌的高表達與年齡、臨床分期、組織學分級、絕經(jīng)狀態(tài)均無關(guān),其與臨床的相關(guān)性尚需進一步研究。我們分析survivinmRNA和survivin蛋白在宮頸炎、宮頸癌前病變和宮頸