南瓜多糖對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰腺fas、fas-l、bcl-2及bax表達(dá)的影響

南瓜多糖對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰腺fas、fas-l、bcl-2及bax表達(dá)的影響

糖尿病是一種常見的內(nèi)側(cè)代謝疾病。多項(xiàng)研究表明，胰島上的細(xì)胞死亡對(duì)糖尿病的發(fā)生和發(fā)展起著非常重要的作用。1型糖尿病是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,以胰島β細(xì)胞選擇性破壞為特征。越來越多的研究證實(shí)凋亡是1型糖尿病β細(xì)胞破壞的主要方式。而在2型糖尿病動(dòng)物模型人胰島淀粉樣多肽轉(zhuǎn)基因鼠及Zucker糖尿病肥胖(ZDF)鼠體內(nèi),亦發(fā)現(xiàn)存在β細(xì)胞凋亡。因此,保護(hù)受損的胰島β細(xì)胞,減少胰島β細(xì)胞的凋亡是治療糖尿病的一個(gè)重要途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種植物及天然藥物在保護(hù)胰島β細(xì)胞方面發(fā)揮著重要的作用。南瓜多糖(pumpkinpolysaccharide,PP)是從天然植物南瓜中提取的有效成分,已有研究發(fā)現(xiàn)PP具有降低血糖作用,但其降血糖作用的機(jī)制還不十分清楚。本研究主要觀察南瓜多糖對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)所致糖尿病大鼠的降糖作用,及其對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠胰島Fas、Fas-L、Bcl-2及Bax表達(dá)的影響,分析南瓜多糖對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的作用,從而為南瓜多糖治療糖尿病提供新的理論依據(jù)。1材料表面1.1rt-pcr檢測(cè)caPP是從天然植物南瓜中提取、純化所得,由中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院提供。HPLC測(cè)得活性PP的平均分子量為1.150×105u,氣相色譜法分析其單糖組分為鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖,其摩爾比為4∶2∶3∶5。靈芝多糖(ganodermalucidumolysaccharide,Gl-PS),由中國(guó)安惠生物科技有限公司提供;STZ(美國(guó)Sigma公司);葡萄糖酶法血糖測(cè)定試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所);抗Fas、Fas-L多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);TRIzolReagent(上海華舜公司);M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)、dNTP、TaqDNApolymerase(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)。Bax、Bcl-2基因序列由Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)提供,引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。Bax引物:Left:5′-GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC-3′;Right:5′-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3′;Bcl-2引物:Left:5′-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3′,Right:5′-CATCCACAGAGCGATGTTGT-3′;β-actin引物:Left:5′-GCACCACACTTTCTACAATGA-3′,Right:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAGT-3′。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂SD大鼠80只,體重180～220g,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK蘇:2002-0022)。2方法2.1動(dòng)物分組及模型構(gòu)建將大鼠隨機(jī)分為兩組,正常對(duì)照組(8只)和造模組(72只)。大鼠禁食12h后,按60mg·kg-1體重給予一次性腹腔注射STZ。72h后測(cè)空腹血糖值,取血糖值大于11.1mmol·L-1者為造模成功大鼠。取造模成功大鼠40只再隨機(jī)分為STZ模型對(duì)照組、Gl-PS對(duì)照組(300mg·kg-1);PP小劑量組(150mg·kg-1);PP中劑量組(300mg·kg-1);PP大劑量組(600mg·kg-1)。各組灌胃給藥時(shí)間均為3wk。2.2血液測(cè)試取大鼠頸動(dòng)脈血4ml,測(cè)定腹血糖(bloodglucose,BG):采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖濃度。2.3免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞的散在半定量分析免疫組織化學(xué)SP染色法測(cè)定Fas和Fas-L的表達(dá)。400倍顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野數(shù)200個(gè)細(xì)胞,對(duì)切片染色情況進(jìn)行半定量分析:無免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞為“-”;免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞較少,且散在分布者為“+”;免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞較多,分布密集者為“++”。求出每組中“+”和“++”標(biāo)本所占總例數(shù)的百分比為該組標(biāo)本陽(yáng)性率。2.4bax、bcl-2基因檢測(cè)按TRIzol法提取胰腺組織總RNA,取總RNA約2μg,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)體積為20μl。以β-actin作為內(nèi)參,取1μlcDNA進(jìn)行PCR循環(huán),擴(kuò)增Bax、Bcl-2基因。Bax基因PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3min→94℃40s→53℃30s→72℃45s(循環(huán)35次)→72℃延伸10min。Bcl-2基因擴(kuò)增:94℃預(yù)變性3min→94℃40s→50℃30s→72℃45s(循環(huán)35次)→72℃延伸10min。每管在第10個(gè)循環(huán)后,加入β-actin引物,同時(shí)擴(kuò)增β-actin基因。PCR產(chǎn)物在含溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠上電泳分離,使用小源凝膠分析系統(tǒng)獲得凝膠電泳圖像,再使用ScionImage圖像分析軟件進(jìn)行PCR產(chǎn)物條帶分析。為了減少誤差,以目的基因與內(nèi)參的比值代替目的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.5單因素方差分析定量資料采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(scheffe法,兩兩比較),各組數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。定性資料樣本率的比較采用χ2分析。3結(jié)果3.1pp中劑量和大劑量對(duì)大鼠血糖的影響如Tab1所示:STZ模型組大鼠的血糖濃度明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01);PP小劑量組對(duì)血糖的影響較小(P>0.05),PP中劑量、大劑量組大鼠血糖濃度均明顯下降(P<0.05,P<0.01);PP中劑量組與Gl-PS陽(yáng)性對(duì)照組相比,對(duì)血糖的影響差異無顯著性(P>0.05)。3.2fas免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)光鏡下發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上可見Fas/Fas-L免疫陽(yáng)性反應(yīng),Fas/Fas-L免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀。正常胰島細(xì)胞Fas的表達(dá)較少,Fas-L的表達(dá)較多;而在糖尿病大鼠的胰島組織中,Fas免疫陽(yáng)性細(xì)胞大量表達(dá),多為散在分布,Fas-L免疫陽(yáng)性細(xì)胞也呈大量表達(dá),其多表現(xiàn)為彌漫性分布;在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Fas/Fas-L的表達(dá)率不同,STZ模型組中Fas/Fas-L的表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05),PP小、中、大劑量組Fas/Fas-L的表達(dá)率明顯低于STZ模型組(P<0.05),并且隨著PP劑量的增大,Fas/Fas-L的表達(dá)率逐漸減小。見Fig1、Tab2。3.3pp對(duì)bax基因表達(dá)的影響STZ模型組大鼠Bax基因的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01),STZ模型組大鼠Bcl-2基因的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01);給藥3wk后,PP小劑量組對(duì)Bax基因的表達(dá)影響較小(P>0.05),PP中劑量、大劑量組大鼠Bax基因的表達(dá)明顯下降(分別為P<0.05,P<0.01),PP小劑量、中劑量、大劑量組大鼠Bcl-2基因的表達(dá)明顯增加(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.01)。見Fig2、3、Tab3。4阿斯匹林斯基因組學(xué)和pp對(duì)大鼠胰島細(xì)胞凋亡的調(diào)控STZ可選擇性破壞大鼠胰島β細(xì)胞,使胰島素分泌減少,血糖增高。研究發(fā)現(xiàn),低劑量多次鏈脲佐菌素誘發(fā)大鼠發(fā)生1型糖尿病的主要原因是由于誘發(fā)了β細(xì)胞凋亡。Liu等也提出STZ可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式,特異性地?fù)p傷胰島β細(xì)胞。近年研究顯示,在糖尿病的發(fā)病過程中涉及到的胰島細(xì)胞凋亡的機(jī)制有:Fas/Fas-L系統(tǒng),Fas依賴的細(xì)胞毒途徑是胰島β細(xì)胞損傷過程中可能的分子機(jī)制,Fas基因產(chǎn)物是細(xì)胞膜表面受體蛋白(即CD95),它與T淋巴細(xì)胞膜上Fas-L結(jié)合,向細(xì)胞內(nèi)傳遞“死亡信號(hào)”,誘導(dǎo)靶細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生凋亡。另外Bcl-2基因家族也參與了胰島β細(xì)胞凋亡的發(fā)生,Bcl-2和Bax蛋白水平高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)。Bax增高,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Bcl-2增高,抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠胰島組織中Fas和Fas-L的表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組,Bax基因的表達(dá)明顯升高,Bcl-2基因的表達(dá)降低,Bcl-2/Bax的比值降低。從而證實(shí)了Fas/Fas-L系統(tǒng)、Bcl-2基因家族與STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究證實(shí)PP具有降血糖作用,且認(rèn)為PP的抗糖尿病作用可能與PP改善胰島細(xì)胞功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了PP降血糖作用的機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn)PP可以降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島組織中Fas、Fas-L蛋白的表達(dá)、降低大鼠胰島細(xì)胞Bax基因的表達(dá)、增加大鼠胰島細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)、Bcl-2/Bax的比值明顯升高,從而改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的凋亡,保護(hù)受損的胰島β細(xì)胞,促進(jìn)胰島素的分泌。但我們也發(fā)現(xiàn)小劑量