pr37抗菌肽對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血清免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響

pr37抗菌肽對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血清免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響

抗生素作為飼料添加劑對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展做出了顯著貢獻(xiàn)。然而抗生素的濫用和亂用,導(dǎo)致在畜產(chǎn)品中的殘留及耐藥菌株的產(chǎn)生。尋找無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)致細(xì)菌耐藥性的飼料添加劑成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究熱點(diǎn)之一?？咕氖巧矬w內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽,不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性;此外,還具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性和水溶性好、無(wú)殘留等特點(diǎn)。在畜禽飼糧中添加抗菌肽,可減少或替代抗生素的使用,對(duì)降低畜禽產(chǎn)品中的抗生素殘留,減少耐藥細(xì)菌,保障人類(lèi)健康均具有重要意義。前人對(duì)天蠶素抗菌肽的研究較多,但對(duì)豬源性PR39抗菌肽的研究較少。為此,本試驗(yàn)在斷奶仔豬飼糧中添加豬源性PR39抗菌肽,研究其對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)、腸道菌群的影響,為進(jìn)一步的科學(xué)研究提供依據(jù)。1材料和方法1.1重組菌的分離培養(yǎng)豬源性PR39抗菌肽由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供;天蠶素抗菌肽由成都金之源公司生產(chǎn);吉他霉素由浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格為1×109U/kg;免疫球蛋白檢測(cè)試劑盒和補(bǔ)體檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。豬源性PR39抗菌肽的制備:從斜面試管中取少量導(dǎo)入了目的基因的畢赤酵母重組菌加入5mL酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基中,以30℃、200r/min振蕩試管24h。按0.1%接種量,即將0.5mL菌液轉(zhuǎn)入裝有500mLBMGY培養(yǎng)基的1L三角瓶中,以30℃、200r/min振蕩試管72h。將菌液裝入無(wú)菌離心管中,在4℃、4000r/min條件下離心10min,棄上清液,用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體(吸取BMMY培養(yǎng)基溶液,將菌體吹下來(lái)),收集所有重懸液并用BMMY培養(yǎng)基定容至500mL,最后將其轉(zhuǎn)入1L三角瓶中。以30℃、200r/min振蕩96h進(jìn)行發(fā)酵表達(dá),期間每24h加0.5mL純甲醇。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液以4℃、5000r/min離心20min,取上清液冷凍干燥,得到固體粉末狀豬源性PR39抗菌肽。1.2基礎(chǔ)飼糧的設(shè)計(jì)選用胎次、體重相近,健康狀況良好的28日齡斷奶仔豬120頭,隨機(jī)分為4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10頭(公母各占1/2)。參照《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T65—2004)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼糧(表1)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼糧+120mg/kg吉他霉素,試驗(yàn)Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)飼糧+200mg/kg天蠶素抗菌肽,試驗(yàn)Ⅲ組飼喂基礎(chǔ)飼糧+300mg/kgPR39抗菌肽。1.3消毒豬圈試驗(yàn)試驗(yàn)自斷奶仔豬28日齡始,試驗(yàn)期21d。試驗(yàn)前充分沖洗和嚴(yán)格消毒豬圈。試驗(yàn)期間每天喂料5次,采用干拌料,以食槽略剩料為原則。試驗(yàn)豬自由采食、自由飲水。圈舍自然通風(fēng),定期打掃,常規(guī)接種免疫。1.4指標(biāo)的測(cè)量和方法1.4.1生產(chǎn)力性能斷奶仔豬28日齡08:00空腹稱(chēng)重為初重,49日齡08:00空腹稱(chēng)重為末重。以每個(gè)重復(fù)為單位記錄采食量。1.4.2腹瀉率試驗(yàn)期間每天09:00觀察豬肛門(mén)和豬糞情況,并做好記錄。1.4.3去蛋白血清制備試驗(yàn)結(jié)束后,每組選取3頭試驗(yàn)豬,前腔靜脈采血后屠宰,靜置1h后3000r/min離心5min,獲取仔豬血清。運(yùn)用試劑盒,采用免疫比濁法測(cè)定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)含量。1.4.4細(xì)菌計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)斷奶仔豬49日齡,每組選取3頭豬屠宰,分別采集盲腸、結(jié)腸、直腸中的食糜,用平板培養(yǎng)法測(cè)定其中大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù),用1g腸道食糜中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)[lg(CFU/g)]表示。在無(wú)菌操作臺(tái)中稱(chēng)取1g食糜于試管中,加入無(wú)菌蒸餾水9mL,振蕩混勻,依次按10倍等比稀釋至10-7。分別吸取稀釋液100μL接種到麥康凱培養(yǎng)基,進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng);接種到乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基,進(jìn)行乳酸桿菌培養(yǎng);接種到雙歧桿菌培養(yǎng)基,進(jìn)行雙歧桿菌培養(yǎng)。培養(yǎng)皿放入大干燥器中,將點(diǎn)燃的蠟燭放入后密閉,大腸桿菌37℃恒溫培養(yǎng)24h,乳酸桿菌和雙歧桿菌37℃恒溫培養(yǎng)48h,取出計(jì)數(shù)。1.5顯著性分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理后,采用SPSS19.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行顯著性分析,用LSD法進(jìn)行多重比較,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。2結(jié)果2.1、和組f/g的比較由表2可知,各組初重、末重和ADFI差異均不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組ADG均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ組F/G顯著低于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組間差異不顯著(P>0.05),試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組腹瀉率顯著低于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅱ組顯著低于試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組差異均不顯著(P>0.05)。2.2血清igm含量由表3可知,試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組血清IgG含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05);對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組之間,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組之間差異均不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅱ組血清IgM含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05);對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組之間,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間差異均不顯著(P>0.05)。各組之間血清IgA、C3和C4含量差異均不顯著(P>0.05)。2.3各組大鼠、盲腸、腸乳酸桿菌及盲腸雙歧桿菌數(shù)比較由表4可知,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組盲腸和結(jié)腸大腸桿菌數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅱ與Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組直腸大腸桿菌數(shù)顯著低于對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05),對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)。各組盲腸、結(jié)腸和直腸乳酸桿菌數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組盲腸雙歧桿菌數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05),對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)。各組之間結(jié)腸和直腸雙歧桿菌數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。3討論3.1抗菌肽的使用對(duì)大鼠adg和f/g的影響仔豬在斷奶后由于采食變化產(chǎn)生應(yīng)激,容易造成生長(zhǎng)受阻,生產(chǎn)性能下降。國(guó)內(nèi)外研究者在斷奶仔豬飼糧中添加中草藥、酸化劑、酶制劑、微生態(tài)制劑等做了大量研究,在飼糧中添加抗菌肽越來(lái)越受到重視。對(duì)斷奶仔豬的生產(chǎn)性能的效果,抗菌肽與某些抗生素相當(dāng)甚至優(yōu)于抗生素,但效果與劑量密切相關(guān)。飼糧中添加1%的防御素抗菌肽,斷奶仔豬的ADG提高13.66%、F/G下降7.18%;飼糧添加3‰天蠶素抗菌肽,可提高仔豬ADG22.2%,降低F/G18.4%。仔豬飼糧中添加天蠶素抗菌肽250mg/kg組在提高飼料轉(zhuǎn)化率、降低飼料成本方面較之抗生素組效果更好;添加300mg/kg與常用抗生素配伍可顯著提高斷奶仔豬末重、ADFI和ADG,且抗菌肽組末重和ADG略高于抗生素組,而F/G略低于抗生素組。本試驗(yàn)中,飼糧中添加200mg/kg天蠶素抗菌肽,斷奶仔豬的ADG提高了5.31%,F/G下降了1.39%;飼糧中添加300mg/kg豬源性PR39抗菌肽,斷奶仔豬的ADG提高了5.62%,F/G下降了1.39%?？咕木徑饬俗胸i斷奶后產(chǎn)生的應(yīng)激,改善了腸道內(nèi)環(huán)境,促進(jìn)了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高了生產(chǎn)性能。3.2pr29抗菌肽對(duì)原理的體外抑菌效果由于仔豬自身免疫系統(tǒng)不完善,飼糧和生活環(huán)境急劇改變,斷奶第1周仔豬容易腹瀉。在仔豬飼糧中添加抗菌肽能顯著降低腹瀉率,飼糧添加3‰天蠶素抗菌肽可使其降低66.77%,1%防御素抗菌肽可使其降低76.08%。本試驗(yàn)中,飼糧中添加200mg/kg天蠶素抗菌肽,斷奶仔豬的腹瀉率下降了37.81%;飼糧中添加300mg/kg豬源性PR39抗菌肽,斷奶仔豬的腹瀉率下降了27.97%。豬源性PR39抗菌肽在體外抑菌試驗(yàn)中,對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用,對(duì)乳酸桿菌抑制作用不明顯。通過(guò)對(duì)腸道菌群比例的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)豬源性PR39抗菌肽能夠抑制有害菌繁殖,促進(jìn)有益菌增殖,改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu),利于仔豬維持腸道穩(wěn)態(tài),通過(guò)這種方式最終降低了仔豬腹瀉率。3.3抗菌肽對(duì)肉仔雞血清學(xué)指標(biāo)的影響仔豬的血液指標(biāo)變化與健康狀況、生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。免疫球蛋白是存在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)廣泛參與體液免疫反應(yīng)的球蛋白,其中IgG和IgA具有抑制菌、抗病毒等免疫活性,IgM具有激活補(bǔ)體等功能。斷奶仔豬飼糧中添加抗菌肽能顯著提高免疫球蛋白水平,飼糧中添加320g/t的天蠶素抗菌肽可提高斷奶仔豬血清中IgG含量;肉仔雞飼糧中添加天蠶素抗菌肽,顯著促進(jìn)了IgA分泌。本試驗(yàn)中天蠶素抗菌肽組和豬源性PR39抗菌肽組血清免疫指標(biāo)優(yōu)于抗生素組和對(duì)照組,抗生素組與對(duì)照組差別不大?？股貙?duì)細(xì)菌的殺滅作用,減少了腸道有害菌的同時(shí)也殺滅了有益菌;通過(guò)腸道進(jìn)入仔豬血液循環(huán)系統(tǒng),對(duì)仔豬體內(nèi)免疫造成影響。抗菌肽作為一類(lèi)多肽,在腸道抑制細(xì)菌的同時(shí)被腸道的酶類(lèi)降解,不會(huì)被吸收進(jìn)入體內(nèi),也無(wú)殘留。抗菌肽通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群,減少有害菌對(duì)機(jī)體的入侵,提高仔豬免疫力。3.4動(dòng)物對(duì)外源性病原菌的抵抗能力動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群是重要的非特異性防御因素,它們的存在對(duì)于入侵的病原菌有拮抗作用。正常菌群彼此保持著一種動(dòng)態(tài)平衡,與宿主的正常生理功能有著密切的關(guān)系。關(guān)于抗菌肽的抗菌機(jī)制,普遍認(rèn)為是通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜,破壞膜的完整性,從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。飼糧中添加外源性的抗菌肽,能夠增加動(dòng)物對(duì)外源性病原菌的抵抗能力。飼糧中添加抗菌肽,顯著降低斷奶仔豬大腸桿菌數(shù)、提高雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù);添加0.3%天蠶素抗菌肽能顯著降低斷奶仔豬糞中大腸桿菌數(shù)。研究表明,飼糧中添加2000和4000U/kg抗菌肽,仔豬腸道大腸桿菌數(shù)分別下降了24.20%和27.01%。本試驗(yàn)中,飼糧中添加200mg/kg天蠶素抗菌肽,斷奶仔豬腸道的大腸桿菌數(shù)減少了2.47%,雙歧桿菌數(shù)增加了1.43%;飼糧中添加300mg/kg豬源性PR39抗菌肽,斷奶仔豬