消結(jié)靈治療肝癌的實驗研究

消結(jié)靈治療肝癌的實驗研究

肝癌是癌癥之一，嚴(yán)重危害著健康和生命。全世界每年新發(fā)現(xiàn)的肝癌病人約有40萬例,據(jù)統(tǒng)計在中國發(fā)病率為最高,約占42.5%,男性占惡性癌瘤的第3位,女性占第5位,我國每年死于肝癌的患者約10萬多人。目前,我國經(jīng)中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌已取得了顯著的療效,其5年生存率高達36.5%,居世界領(lǐng)先地位。中藥消結(jié)靈是選用白鮮皮、白附子、牛黃和冬蟲夏草等多種純中藥所組成,具有扶正培本、清熱解毒、理氣化瘀、軟堅散結(jié)之功效。筆者治療中晚期肝癌130例。顯著改善癥狀,增強食欲,緩解疼痛,促使癌瘤縮小或消失,提高機體免疫功能,延長生存期,統(tǒng)計總緩解率為72.3%,總有效率為89.2%。筆者建立起多種動物模型,檢測消結(jié)靈抗癌療效,采用現(xiàn)代電子顯微鏡技術(shù)和免疫組化染色方法觀察超微病理改變,分析和探討抗癌機理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1監(jiān)督藥片的制備中藥消結(jié)靈FPSZ0860沈制流字(1995)第43號,由沈陽軍區(qū)司令部第一干休所門診部藥劑室監(jiān)制,每片含有效成份250mg。將藥片溶掉糖衣皮再研磨成細(xì)粉劑,用蒸餾水溶解成不同濃度的懸液溫火煮沸10min,粗過濾后備用。1.1.2男性,男性,男性昆明小白鼠,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供,選體重19~21g,雌雄兼用。建立起4種癌瘤模型,每種用小白鼠50只,隨機分成對照1組、對照2組(陽性對照)和3個實驗組。1.2小鼠移植瘤模型實體型肝癌(HepA)細(xì)胞株,由國家醫(yī)藥管理局上海工業(yè)研究院藥理研究室提供,S180肉瘤細(xì)胞株、腹水型肝癌(HAC)艾氏腹水癌(EAC)細(xì)胞株,由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。建立實體型HepA和S180模型,將瘤株(1×106)接種在小鼠腋下,使其長成移植瘤。接種24h后,將兩種模型隨機各分成5組,每組10只。實驗分3組,消結(jié)靈懸液劑量為3、6、9g/kg(60mg/ml,120mg/ml,180mg/ml),開始灌胃給藥,每日1次,連續(xù)10日。對照1組灌胃等量生理鹽水。對照2組灌胃給5-氟脲嘧啶(劑量為0.02g/kg)。停藥24h,處死小鼠剝離摘出瘤體,稱瘤體重量,統(tǒng)計抑制率。同時取材以備進行超微病理和免疫組化定位等研究。建立腹水型HAC和EAC模型,將瘤株(1×106)接種于小鼠腹腔,同樣分組和灌胃給藥,連續(xù)10日。停藥后正常飼養(yǎng)觀察動物生存天數(shù),統(tǒng)計生命延長率。免疫組化染色選部分材料,用間接法,第一抗體為單克隆抗體Leu4,抗體為HRP-IgG,對T淋巴細(xì)胞做免疫組化定位研究。2結(jié)果2.1抗hac生命延長率消結(jié)靈對小鼠實驗體型HepA抑制率為48%~70%;S180抑制率為36%~51%;抗HAC生命延長率為72.2%~75.9%;抗EAC生命延長率為73.7%~74.9%。2.2胞質(zhì)形成動力學(xué)在電鏡下觀察對照組肝癌細(xì)胞的超微病理特征和實驗組在消結(jié)靈作用下產(chǎn)生的超微病理改變。對照組超微病理特征:肝癌細(xì)胞核比正常肝細(xì)胞核明顯增大且畸形,核膜多處深陷甚而呈花瓣狀,核內(nèi)常染色質(zhì)豐富,異染色質(zhì)多聚集在核膜內(nèi)側(cè)。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少,可見少量空泡變性的線粒體和較多的糖原顆粒。實驗組超微病理改變:實驗組肝癌細(xì)胞多呈破碎或凋亡狀態(tài),細(xì)胞膜與核膜多處缺損或斷裂,膜周形成透明區(qū)。細(xì)胞器多呈變性狀態(tài),有少量含底物的高電子密度的次級溶酶體。癌細(xì)胞核大呈畸形,很多癌細(xì)胞的核仁解離與異染色質(zhì)融合形成不規(guī)則的致密顆粒。胞質(zhì)內(nèi)有腫脹呈空泡變性的線粒體。很多癌細(xì)胞內(nèi)形成大量類球形高電子密度的初級溶酶體和含底物的次級溶酶體。肝血竇內(nèi)產(chǎn)生較多的枯否氏細(xì)胞,核呈梭形,常見1~2核仁,常染色較發(fā)達。胞質(zhì)增生富含大量溶酶體和分泌泡,還有少量線粒體、糖原顆粒、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離的多聚核糖體。其表面有較多的微突起。2.3t細(xì)胞基因突變采用間接法定位染色T淋巴細(xì)胞。一抗為單克隆性Leu4二抗HRP-IgG,顯示T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜與微突起及核膜呈細(xì)顆粒狀鋨黑為強陽性反應(yīng)。3消結(jié)靈的作用機制純中藥片劑消結(jié)靈,具有扶正培本,清熱解毒、理氣化瘀、軟堅散結(jié)之功效。通過應(yīng)用消結(jié)靈治療中晚期肝癌130例的療效觀察結(jié)果和建立4種抗癌動物模型統(tǒng)計其抑癌作用結(jié)果,又從分子水平觀察超微病理改變和免疫組化定位,看到消結(jié)靈對癌瘤細(xì)胞具有直接或間接的殺傷破壞作用,抑制癌瘤細(xì)胞的分裂增殖,提高機體細(xì)胞免疫功能并通過免疫系統(tǒng)抑制和殺傷癌瘤細(xì)胞?，F(xiàn)將消結(jié)靈抗癌瘤作用的途徑和機理分析歸納如下。3.1胞失去支架屏障對細(xì)胞膜與核膜,它是由脂類、蛋白質(zhì)和糖類構(gòu)成的,一旦受到損傷不僅使癌細(xì)胞失去支架屏障而且破壞其物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等重要功能,最終致使癌細(xì)胞裂解凋亡。還與線粒體變性、糖原顆粒減少、核糖體溶解、常染色質(zhì)消失、核仁顆粒化和DNA模板失活等而導(dǎo)致供能ATP與蛋白質(zhì)合成障礙有密切關(guān)系。3.2核仁核仁細(xì)胞核具有儲存遺傳信息,控制細(xì)胞的代謝、分化和增殖等功能。癌瘤細(xì)胞不僅核大畸形,核質(zhì)比例顯著增高,而且核仁亦大數(shù)量常見2~4個,標(biāo)明代謝增生活躍。核仁是核內(nèi)重要結(jié)構(gòu),主要是合成核蛋白體核糖核酸(rRNA)并參與合成蛋白質(zhì)。核仁解離呈顆?；?染色質(zhì)也融合于顆粒中,致使分裂增殖受阻。在電鏡下大量觀察實驗組標(biāo)本,尚未找到癌細(xì)胞有絲分裂象。3.3釋放水解酶溶酶體在細(xì)胞內(nèi)具有防御功能,正常細(xì)胞內(nèi)含量較少。藥效能誘導(dǎo)癌瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量初級溶解酶體和含底物的次級溶酶體。并使初級溶酶體易釋放出多種酸性水解酶,分解消化外來異物和癌細(xì)胞代謝毒素及變性細(xì)胞器,起到自殺性破壞癌細(xì)胞的作用。它釋放出蛋白水解酶,能溶解肽鏈,破壞蛋白的合成,若釋放出糖苷酶,能溶解糖鏈,同樣破壞癌細(xì)胞。以上3項討論表明,消結(jié)靈具有較強的細(xì)胞毒作用,實現(xiàn)軟堅散結(jié)之功效。3.4t細(xì)胞作用檢測很多文獻報道,癌瘤患者細(xì)胞免疫功能低下,上海腫瘤醫(yī)院于爾康等觀察脾虛小鼠荷肝癌后T淋巴細(xì)胞功能下降。本實驗組看到對照組與上述報道基本相同,但實組組看到消結(jié)靈能激活T淋巴細(xì)胞增生功能活躍。通過光鏡觀察E-玫瑰花形和淋巴轉(zhuǎn)化實驗看到其數(shù)量明顯增加。電鏡下觀察在癌細(xì)胞之間有較多淋巴細(xì)胞浸潤。用免疫組化間接法,對T淋巴細(xì)胞進行定位染色,看到其細(xì)胞膜與核膜呈細(xì)顆粒狀鋨黑為強陽性反應(yīng),結(jié)果證實,T淋巴細(xì)胞功能顯著增強,提高了機體細(xì)胞免疫功能。電鏡下還看到自然殺傷性淋巴細(xì)胞(又稱癌導(dǎo)彈)數(shù)量也增加并直接攻擊破壞癌細(xì)胞。3.5提高細(xì)胞免疫功能枯否氏細(xì)胞,即巨噬細(xì)胞存在于肝血竇內(nèi),正常狀態(tài)下其數(shù)量不多。消結(jié)靈能促進其數(shù)增多,體積增大,細(xì)胞核常染色質(zhì)豐富,細(xì)胞器發(fā)達富含大量溶酶體和分泌泡,表明其功能活躍。表面微突起較多,相當(dāng)于偽足能游走移動,有的可穿透血竇內(nèi)皮附著在癌細(xì)胞表面。它不僅有吞噬作用,還能分泌多種抑癌調(diào)節(jié)因子,抑制或殺傷癌細(xì)胞。它能分泌白細(xì)胞介素-1(IL-1),促進輔助性T細(xì)胞增殖分化;分泌δ-干擾素(δ-IFN),增強自然殺傷性淋巴細(xì)胞的攻擊活性;分