宮頸細(xì)胞中hpv16e6基因的熒光定量檢測

宮頸細(xì)胞中hpv16e6基因的熒光定量檢測

宮頸是發(fā)展中國家女性最常見的腫瘤。高危型的人乳頭瘤病毒(HPV),特別是HPV16型被認(rèn)為是該腫瘤的主要病因。HPV16基因組主要由早期基因區(qū)(E區(qū))、晚期基因區(qū)(L區(qū))和長控制區(qū)(LCR)組成,E區(qū)有6個(gè)開放讀碼結(jié)構(gòu)(ORF),即E1、E2、E4、E5、E6及E7,其中與轉(zhuǎn)化有關(guān)的為E6和E7基因。HPV致癌的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)化蛋白E6、E7與細(xì)胞癌基因和抑癌基因相互作用。E6蛋白獨(dú)立致癌性日益受到重視。而新疆婦女宮頸癌組織中HPV16E6(新疆株)(AF327851)與德國標(biāo)準(zhǔn)株相比發(fā)生了堿基突變和相應(yīng)的氨基酸序列改變,其可能成為新疆婦女宮頸癌高發(fā)的主要誘因。為此,我們對新疆婦女宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、疑似宮頸癌而病理結(jié)果為炎癥(宮頸炎)的蠟塊組織及甲醛浸泡的宮頸癌組織提取的DNA并檢測了其中HPV16E6基因;另外對一批婦科門診患者隨機(jī)取宮頸管的脫落細(xì)胞及分泌物作為對照,初步了解新疆婦女HPV的感染狀況。采用熒光定量聚合酶鏈(FQ-PCR)方法,對上述5組不同患者的宮頸組織細(xì)胞進(jìn)行了HPV16E6檢測,同時(shí)設(shè)立細(xì)胞內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白,利用熒光標(biāo)記的探針對擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行即時(shí)雜交,測定其熒光強(qiáng)度并與細(xì)胞內(nèi)參照的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較,從而達(dá)到對目的基因進(jìn)行量化分析的目的,使該研究方法能夠在未來用于宮頸癌的早期篩查,指導(dǎo)臨床治療,監(jiān)測病情變化,并可能應(yīng)用于該病的風(fēng)險(xiǎn)評估和放療的療效觀察。對象和方法一、因妊娠和宮頸炎而產(chǎn)生的各組宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本隨機(jī)采自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門診患者,由醫(yī)生在無菌操作下用棉拭子刷取宮頸脫落細(xì)胞,并置于無菌生理鹽水中,充分震蕩洗滌,密封送檢。宮頸脫落細(xì)胞組共96例,其中漢族78例,維吾爾族16例,哈薩克族2例。宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、宮頸炎蠟塊組織由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供,共157例:蠟塊組織中宮頸癌59例,其中維吾爾族45例,漢族13例,柯爾克孜族1例。CIN組共65例,其中漢族41例,維吾爾族22例,哈薩克族2例。宮頸炎組共33例均為維吾爾族。切取8μm厚石蠟切片3片,放入高溫滅菌的離心管中室溫保存待用。另有10例的宮頸癌標(biāo)本來自新疆喀什,均為維吾爾族。二、方法1.探針及引物合成根據(jù)已注冊的HPV16E6基因序列(GenBankAF327851),利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)如下引物序列:上游引物5′CACAGGAGCGACCCAGAAA3′和下游引物5′GACATACATCGACCGGTCCAC3′,擴(kuò)增片段長約400bp,根據(jù)擴(kuò)增片段的序列,利用英國premier公司的BeaconDesigner軟件設(shè)計(jì)探針序列:5′(FAM)ACCACAGTTATGCACAGAGCTGC(TAMRA)3′;引物及探針分別由日本TaKaRa公司和加拿大Sangon公司合成。細(xì)胞內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白基因引物、探針,取自美國PerkinElmer(PE)AppliedBiosystems公司的β-肌動(dòng)蛋白Controlreagentskit。dNTP,Taq酶購自日本TaKaRa(大連)公司。DNA模板提取所用試劑(包括蛋白酶K)購自加拿大Sangon公司。2.儀器主要為美國PerkinElmer(PE)公司的5700熒光定量PCR儀。3.因子檢測細(xì)胞dna宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本DNA提取方法按照中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心的FQ-PCR試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行,DNA提取液由該中心提供。得到的宮頸脫落細(xì)胞DNA溶液在-20℃冷藏備用。甲醛溶液浸泡的宮頸癌組織DNA的提取方法,在徐來祥等方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)。石蠟包埋組織DNA提取,首先用二甲苯對組織切片脫蠟,使細(xì)胞與消化液充分接觸,保證了組織的完全破碎,DNA釋放和蛋白去除更加完全。4.pcr檢測pucm-t、pv136的熒光強(qiáng)度與獲得力β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)梯度由試劑盒給定。HPV16E6標(biāo)準(zhǔn)梯度按如下方法建立:將本實(shí)驗(yàn)室的pUCm-T/HPV16E6提取純化后用TE緩沖液[10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA(pH8.0)]稀釋成103~107copy/μl,經(jīng)定量PCR檢測其熒光強(qiáng)度與拷貝數(shù)的線性關(guān)系后確定。5.目的基因片段的擴(kuò)增總體積50μl,內(nèi)含dNTPs200μmol/L,上下游引物各0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,探針6pmol,緩沖液(25℃pH9.0的10mmol/LTrisHCI,50mmol/LKCI,0.1%Triton×100)及MgCl2濃度值的確定按析因?qū)嶒?yàn)方案進(jìn)行。反應(yīng)緩沖液配制好后,分兩管分別加入HPV16E6和β-肌動(dòng)蛋白引物及其相應(yīng)探針,加入模板量為1μl/管,分別擴(kuò)增HPV16E6目的基因片段和β-肌動(dòng)蛋白基因片段。擴(kuò)增條件:95.0℃預(yù)變性5min,變性95.0℃45s,退火55.0℃45s,延伸72℃45s,循環(huán)40次,最后72℃延伸8min。實(shí)時(shí)檢測熒光強(qiáng)度的變化,定量擴(kuò)增完畢,每個(gè)樣本得到兩條熒光曲線及各自的拷貝值(CH&Cβ,HPV16E6拷貝數(shù)和β-肌動(dòng)蛋白拷貝數(shù)),CH/Cβ即為所求組織所含HPV16E6DNA的相對數(shù)量值。6.mg2+濃度的析因設(shè)計(jì)固定變性溫度,同時(shí)固定模板量及緩沖液,將Mg2+濃度和復(fù)性溫度進(jìn)行兩因素三水平(分別以55℃和58℃為復(fù)性溫度,Mg2+濃度分別為1.5mmol/L、1.75mmol/L及2mmol/L)的析因設(shè)計(jì),使兩因素的每一水平都有機(jī)會(huì)組合。當(dāng)某一反應(yīng)組得到Ct值較小熒光強(qiáng)度較高時(shí),說明相對其他反應(yīng)組而言,在模板量相同的情況下該組用較少的循環(huán)次數(shù)就可達(dá)到閾值,即其反應(yīng)敏感性相對較高,因而該反應(yīng)所對應(yīng)的反應(yīng)體系即為此次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的“最佳”水平。7.ipv6基因片段以最終優(yōu)化出的反應(yīng)體系應(yīng)用于擴(kuò)增HPV16E6基因片段。在應(yīng)用于臨床標(biāo)本前,進(jìn)行4次HPV16E6和β-肌動(dòng)蛋白基因片段FQ-PCR,以觀察最佳反應(yīng)體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性。8.-肌動(dòng)蛋白基因片段的檢測對臨床獲得的5組標(biāo)本,核酸提取后,分別擴(kuò)增目的基因HPV16E6和細(xì)胞內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白基因片段,重復(fù)一組,取平均值之比即得到每一樣本的CH/Cβ(copyHPV16E6/copyβ-肌動(dòng)蛋白)值。9.統(tǒng)計(jì)處理用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將宮頸癌、CIN、宮頸炎的蠟塊組織及對照脫落細(xì)胞檢測結(jié)果差異顯著性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)和秩合檢驗(yàn)。結(jié)果一、復(fù)性溫度下熒光曲線分別以55℃和58℃為復(fù)性溫度,Mg2+濃度分別為1.5mmol/L、1.75mmol/L及2mmol/L時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn);58℃為復(fù)性溫度時(shí)均未得到陽性的熒光曲線;以55℃為復(fù)性溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:FQ-PCR得到的Ct值及熒光強(qiáng)度最佳為MgCl22mmol/L組,用已知陽性模板進(jìn)行穩(wěn)定性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)(每次設(shè)立陰性對照組),結(jié)果穩(wěn)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合度高。二、fq-pcr檢測睪丸中-肌動(dòng)蛋白、pv136表達(dá)情況維吾爾族宮頸癌患者共55例,年齡平均46.7歲(28~68歲);漢族宮頸癌患者14例,年齡平均48.8歲(34~72歲)。宮頸癌、CIN、宮頸炎的蠟塊組織分別為59例、65例及33例。甲醛溶液浸泡的宮頸癌組織10例,宮頸管脫落細(xì)胞96例,各組β-肌動(dòng)蛋白及HPV16E6陽性情況見表1。FQ-PCR檢測宮頸癌組織中β-肌動(dòng)蛋白、HPV16E6的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線分別見圖1(a、b)及圖2(a、b),標(biāo)準(zhǔn)曲線理想,結(jié)果可靠。宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本96例中β-肌動(dòng)蛋白陽性91例,HPV16E6陽性3例,陽性率3.3%;宮頸癌蠟塊組織59例β-肌動(dòng)蛋白均陽性,其中HPV16E6陽性49例,陽性率83.05%;宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)蠟塊組織65例中,28例因β-肌動(dòng)蛋白陰性被剔除,余37例β-肌動(dòng)蛋白陽性者中,HPV16E6陽性28例,陽性率75.7%;宮頸炎的蠟塊組織33例中,3例β-肌動(dòng)蛋白陰性被剔除,余30例β-肌動(dòng)蛋白陽性者中,HPV16E6陽性28例,陽性率93.3%;甲醛溶液浸泡的宮頸癌組織10例中2例β-肌動(dòng)蛋白陰性被剔除,余8例中HPV16E6陽性4例,陽性率50%。三、免疫、cin、宮頸炎蠟塊與pv18e6表達(dá)的秩合檢驗(yàn)對β-肌動(dòng)蛋白陽性的宮頸不同病變組織中HPV16E6陽性率及其相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,宮頸癌、CIN、宮頸炎各組HPV16E6陽性率與脫落細(xì)胞組HPV16E6陽性率間差異有顯著意義,χ2值分別為100.5,75.1,95.98,P值均<0.005;而宮頸癌、CIN、宮頸炎蠟塊3組之間HPV16E6陽性率差異無顯著意義,P>0.05。在β-肌動(dòng)蛋白陽性的宮頸不同病變組織中,HPV16E6陽性率及其相對含量見表2;秩合檢驗(yàn)結(jié)果:不同病變組間HPV16E6的相對含量差異顯著,宮頸癌蠟塊組織HPV16E6的相對含量高于各CIN組及對照脫落細(xì)胞組,P<0.05;CIN各組又高于對照脫落細(xì)胞組,P均<0.01。對宮頸不同病變組織單位細(xì)胞所含HPV16E6DNA的定量值用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:HPV16E6的相對含量隨病情加重(從正常脫落細(xì)胞組到宮頸癌)有上升趨勢(圖3),相關(guān)系數(shù)r=0.83,P<0.01。各指標(biāo)檢測的差異世界范圍的研究表明人乳頭瘤病毒是引起宮頸癌的主要病因之一,97%的宮頸癌患者中都有HPV檢出。雖然巴氏涂片法的細(xì)胞學(xué)檢測在早期宮頸病變診斷中扮演著重要的角色,但是HPV的DNA檢測可以在CIN選擇治療、病情預(yù)測中提供重要的參考。HPV實(shí)驗(yàn)室檢測方法很多,常規(guī)PCR技術(shù)簡便、快速、靈敏,但存在著不能定量、易被污染、易假陽性等缺陷。而核酸熒光定量PCR技術(shù)可克服上述問題,它是近幾年發(fā)展起來的新的核酸檢測技術(shù),該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,加入了1條用熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針。在PCR反應(yīng)過程中,實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化,待反應(yīng)結(jié)束后,自動(dòng)計(jì)算出起始DNA的拷貝數(shù)。該技術(shù)有許多優(yōu)越性,如無須擴(kuò)增后分析,避免PCR產(chǎn)物污染,大范圍拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量等。在FQ-PCR反應(yīng)體系中,熒光標(biāo)記的探針與模板成功雜交并發(fā)出熒光需要一定的離子強(qiáng)度,離子強(qiáng)度太低或太高都不利于熒光探針的成功雜交及發(fā)光。熒光探針的酶切發(fā)光需要TaqDNA聚合酶的作用,而此酶活性的發(fā)揮依賴于游離鎂離子的存在,故在此優(yōu)化方案中分析了鎂離子對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。取人體細(xì)胞內(nèi)β-肌動(dòng)蛋白基因作細(xì)胞內(nèi)參照,同時(shí)擴(kuò)增病毒目的基因片段和內(nèi)參照,能夠提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。因人體細(xì)胞內(nèi)β-肌動(dòng)蛋白基因與病毒基因是同時(shí)提取并同條件擴(kuò)增的,所以檢測得到的β-肌動(dòng)蛋白基因,一方面是對臨床標(biāo)本DNA提取成功與否的監(jiān)測指標(biāo),另一方面CH/Cβ代表HPV16E6DNA量與人β-肌動(dòng)蛋白DNA量的比,說明患者單位細(xì)胞的帶病毒量,在一定程度上可以反映病毒在局部復(fù)制的活躍程度。96例宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本系2d內(nèi)隨機(jī)采自門診就診者,絕大多數(shù)為陰道炎,其次為宮頸炎,盆腔炎及其他非腫瘤患者,HPV16E6檢出率較低(3.3%),代表門診普通婦女人群中HPV16的感染情況,可作為對照。59例宮頸癌蠟塊中HPV16E6陽性49例,陽性率83.0%。李潔等在全國14個(gè)省、市、自治區(qū)內(nèi)共檢測815例子宮頸癌,HPV總檢出率為53.5%,其中HPV16的檢出率最高,但僅為31.9%;新疆宮頸癌組織中以HPV16型感染為主,HPV16的陽性率為60%;其結(jié)論與本研究基本一致,但本研究樣本含量大且HPV16的陽性率更高,考慮為本實(shí)驗(yàn)靈敏度較高或針對的人群不同所致。CIN蠟塊組織65例中,28例因β-肌動(dòng)蛋白陰性被剔除,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性;余37例β-肌動(dòng)蛋白陽性的CIN中,HPV16E6陽性28例,陽性率75.7%,低于宮頸癌組,而差異無顯著意義。本組病例統(tǒng)計(jì)分析顯示,宮頸癌蠟塊組織HPV16E6的相對含量高于CIN及對照脫落細(xì)胞組,CIN各組又高于對照脫落細(xì)胞組,均P<0.05。HPV16E6的相對含量隨病情加重呈上升趨勢,二者呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.83。故用FQ-PCR檢測宮頸不同病變組織中HPV16E6的相對含量的方法,可應(yīng)用于宮頸癌的篩查,不同程度癌前病變(CIN)轉(zhuǎn)歸的判斷,以及治療后病人愈后判斷和放療的療效觀察,風(fēng)險(xiǎn)評估。新疆地區(qū)宮頸癌高發(fā),且維吾爾族患者占絕大多數(shù)。本文從分子水平上研究了新疆地區(qū)宮頸癌與HPV16E6基因的關(guān)系。HPV16E6基因與新疆地區(qū)宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。值得一提的是宮頸炎的蠟塊組織中,HPV16E6陽性率高達(dá)93%,與宮頸癌及CIN組差異無顯著意義。該組均為