應用細菌16srrnardna序列檢測益生菌對實驗性結(jié)腸炎的保護作用

應用細菌16srrnardna序列檢測益生菌對實驗性結(jié)腸炎的保護作用

炎癥性腸病（ibd）是由遺傳、免疫、腸道菌群和環(huán)境等多種因素相互作用引起的病理過程。考慮到腸道菌群在IBD病理過程中的重要作用,應用益生菌制劑是一種潛在的治療手段,例如益生菌制劑VSL#3是國外應用多年的8種益生菌混合制劑,已經(jīng)臨床證實可通過改善腸道菌群平衡對部分腸道炎癥有治療效果。但腸道細菌的種類繁多,傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)、鑒定方法只能對一小部分腸道細菌進行鑒定和定量,且敏感性低、影響因素多。16SrRNA為原核生物的一種核糖體RNA,同時具有保守序列及高變序列,近年來一直是微生物系統(tǒng)分類的一個重要指標,根據(jù)16SrDNA設計種屬特異性PCR引物對腸道細菌DNA樣本進行擴增檢測,可用于半定量測定腸道菌群含量。本研究擬采用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonicacid,TNBS)灌腸建立實驗性大鼠急性腸炎模型,采用16SrRNAPCR技術(shù)檢測腸道細菌,證實是否可通過服用益生菌改善腸道菌群平衡以緩解大鼠實驗性結(jié)腸炎。1材料和方法1.1細菌、氨基酸試劑2,4,6-三硝基苯磺酸為Sigma公司產(chǎn)品[Picrylsulfonicacidsolution,5%(w/v)],批號107K5008;VSL#3,美國VSL制藥公司產(chǎn)品,購自中國臺灣亞太制藥有限公司,批號:5511C71,冷藏及運輸均符合說明書要求。其總菌含量為450×109/袋(2.5g),8種益生菌成分,含量見文獻。5-氨基水楊酸(商品名:美沙拉秦,5-aminosalicylicacid,5-ASA),法國愛的發(fā)制藥公司。細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANampBacteriaDNAKit)為北京天根公司產(chǎn)品,批號:17317。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技公司。1.2模型和實驗組1.2.1fp3動物Sprague-Dawley大鼠24只,SPF級,購自武漢大學動物實驗中心[許可證號:SCXK(鄂)2008-0004],雌雄各半,體重200-300g。1.2.2tnbs灌注造模前大鼠禁食36h以排空大便,所有大鼠均在2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后行TNBS灌腸造模,造模方法為:將0.3ml5%(w/v)TNBS與無水乙醇按1∶1配制好的灌腸液注入大鼠結(jié)腸距肛門8cm處并保留1min。1.2.3大鼠腸道組織病理學檢測按性別隨機分為3組,每組8只,造模完成后第2天開始各組開始灌胃治療。VSL#3組每日每只大鼠灌胃2mlVSL#3溶液(含0.1gVSL#3粉劑),5-ASA組每日每只2ml5-ASA(200mg),模型組僅給予生理鹽水灌胃。灌腸7d后處死,取距肛門8cm處結(jié)腸組織,剪開置于生理鹽水中漂洗后分作2份,一份置入4%多聚甲醛浸泡24h以作HE染色切片,另一份置-80℃冰箱保存,將腸內(nèi)容物標本迅速裝入1.5mlEP管密閉,并放入-80℃冰箱保存。實驗過程中觀察大鼠體重、毛色、活動狀態(tài)、進食及大便情況。動物飼養(yǎng)及造模、手術(shù)取材過程均在武漢大學實驗動物中心完成。1.3慢性慢性阻燃反應除各實驗組外,另取2只正常大鼠做正常對照。常規(guī)做HE染色切片,在顯微鏡下進行病理學觀察,參照McCarthy的方法對實驗性結(jié)腸炎進行評分,主要評分依據(jù)為:黏膜上皮層糜爛的程度,杯狀細胞丟失和炎癥細胞浸入程度。0分:正常;1分:輕度炎癥浸潤;2:明顯的炎癥浸潤(隱窩炎、隱窩膿腫);3:明顯的炎癥浸潤伴杯狀細胞丟失;4:明顯的炎癥浸潤伴黏膜糜爛。1.4培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法取盲腸內(nèi)糞便0.1g置于含半胱氨酸的Ringer稀釋液9ml內(nèi)稀釋,攪拌混勻,并制成濃度為10-5,10-6,10-7,10-8g/L4種混懸液,各取100μg分別在麥康凱培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基(BBL)、乳酸桿菌培養(yǎng)基(MRS)上均勻涂抹,(36±l)℃培養(yǎng)18-36h不等。其中雙歧桿菌和乳酸桿菌采用厭氧培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)并計數(shù)菌落形成單位(CFU/g糞便)。鑒定方法參照文獻。1.5pcr擴增過程1.5.1大便細菌的制備及DNA的提取參照文獻分兩步進行。首先制備細菌:取大便標本0.2g加入4ml無菌PBS充分攪拌,置入渦旋震蕩器上震蕩3min,以確保大便混懸液充分混勻。經(jīng)700g×1min離心并棄去大便沉渣,將上清液13000g×5min離心,棄上清,將沉淀加PBS充分吹散、離心3次,沉淀主要為細菌成分。第2步按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書要求完成,包括加入的溶菌酶至20g/L以保證革蘭陽性菌充分破壁。提取DNA完成后,經(jīng)紫外分光光度計測定DNA含量。1.5.2PCR通用細菌(Unibac)、乳酸桿菌(LAA)、雙歧桿菌(Bif164)、大腸桿菌(E.coli)16SrDNA引物序列參照文獻,由上海生工公司合成,Unibac上游引物:5′-CGTGCCAGCCGCGGTAATACG-3′,片段長度611bp;下游引物:5′-GGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3′;LAA上游引物:5′-CATCCAGTGCAAACCTAAGAG-3′,下游引物:5′-GATCCGCTTGCCTTCGCA-3′,片段長度286bp;Bif164上游引物5′-GGGTGGTAATGCCGGATG-3′,下游引物:5′-CCACCGTTACACCGGGAA-3′,片段510bp;E.coli上游引物:5′-GGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTC-3′;下游引物:5′-TTCCCGAAGGCACATTCT-3′,長度584bp。50μl反應體系:DNA模板7μl,10×擴增緩沖液5μl,dNTP及上、下游引物各2μl,Taq酶2U,BSA50μg。反應條件:94℃預變性5min后,94℃15s→58℃1min(大腸桿菌退火溫度56℃)→72℃50s共35循環(huán),然后72℃10min完成PCR過程。PCR產(chǎn)物片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,G:BOX凝膠成像系統(tǒng)分析各組目的片段灰度值和相對灰度,相對灰度=目的片段灰度值/通用細菌Unibac片段灰度值。1.6統(tǒng)計分析各組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1各組大鼠腸黏膜狀態(tài)變化見表1。造模后3組大鼠均表現(xiàn)出急性腸炎模型的特征,即出現(xiàn)食欲下降、活動減少、皮毛雜亂無光澤,腹脹,體重下降,持續(xù)腹瀉和大便帶血。1周內(nèi)各組均有大鼠死亡,其中TNBS模型組死亡3只。處死時可見結(jié)腸異常膨大、腸壁淤血腫脹、部分腸管與周圍組織黏連。結(jié)腸病理學檢查可見模型組腸黏膜炎癥程度明顯較VSL#3及5-ASA組嚴重,腸黏膜出現(xiàn)潰瘍、糜爛、出血,腺管結(jié)構(gòu)破壞,炎癥細胞對腸壁的侵入更深、更廣。腸炎評分見表1。2.2腸球菌組的變化2.2.1各組小鼠腸道菌群的比較PCR擴增片段的電泳照片見圖1。根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果,計算各組雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的16SrDNA產(chǎn)物的相對灰度值。見表2。經(jīng)方差分析,各組間的每種細菌16SrDNA擴增產(chǎn)物相對量均有顯著性差異(雙歧桿菌F=13.160,P<0.01;乳酸桿菌F=5.137,P<0.05;大腸桿菌F=7.126,P<0.01)。組間兩兩比較結(jié)果見表2。與模型組相比,可見VSL#3灌胃治療后可明顯增加腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量,而大腸桿菌明顯抑制(P<0.05或P<0.01)。5-ASA組的腸道菌群成分未見到類似變化(P>0.05)。2.2.2細菌培養(yǎng)計數(shù)各組大便細菌培養(yǎng)結(jié)果見表3。經(jīng)方差分析,各組細菌培養(yǎng)計數(shù)均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01),結(jié)果也顯示VSL#3組乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)目增加,而大腸桿菌數(shù)目減少。3益生菌制劑的聯(lián)合應用腸道中菌群含量豐富,菌群的分布和平衡在腸炎時會發(fā)生變化,并影響腸道炎癥的過程。有文獻報道毛螺旋菌(Lachnospiraceae)、擬桿菌(Bacteroidetes)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)在IBD患者腸道中的相對數(shù)量少于正常人群。實驗性結(jié)腸炎模型的腸道菌群異常的報道也較多,但由于采取的方法各異,從普通的培養(yǎng)計數(shù)到基于細菌16SrRNA探針或引物的原位雜交或基因擴增技術(shù)。研究的范圍也從幾種代表細菌到多達幾十種代表細菌。一些研究僅做到具體菌株的分析(多為傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法),更多的則涵蓋至細菌的門、綱、目一級,甚至根據(jù)系統(tǒng)演化樹分析整個細菌譜。無論采取何種方法,大多數(shù)研究的結(jié)果均表明腸炎過程中會出現(xiàn)腸道某些菌群或菌株的數(shù)量變化。本研究亦證實了大腸桿菌數(shù)量減少而雙歧、乳酸桿菌的數(shù)量增加。從總體趨勢看來,菌群分析方法將會更多地采用基于16SrRNA的技術(shù)。原因在于傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)、鑒定的菌群分析技術(shù)耗時耗力,精確性差,且很多菌種無法通過培養(yǎng)的方法達到分離、鑒定和定量的目的。因16SrRNA基因序列高度保守,其核苷酸位點的變化具有種的特異性,故利用PCR鑒定細菌的特異性和靈敏性都較高。一般認為益生菌主要通過拮抗腸道致病菌、改善腸道營養(yǎng)物質(zhì)等方面達到緩解腸道炎癥的效果。本研究證實VSL#3對腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)與結(jié)腸炎癥的改善也有一定關聯(lián),達到與傳統(tǒng)治療腸炎的藥物5-ASA相近的治療效果。5-ASA主要通過作用于回、結(jié)腸黏膜,影響花生四烯酸代謝,抑制前列腺素合成,也可通過對過氧化物反應和免疫細胞的抑制作用,從而抑制腸炎過程。VSL#3等益生菌制劑并非在于直接影響機體的炎癥反應,而主要通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,抑制致病菌的黏附、定植及產(chǎn)生有害成分,增強腸黏膜的屏障功能。益生菌本身也可對宿主產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用,但相關機制尚不明了。由于益生菌制劑對IBD的臨床療效并不確切,故目前國際上通過認證的益生菌處方藥不多,僅有VSL#3在結(jié)腸憩室炎或隱窩炎(pouchitis)的治療中已被證實有效,并提示可以用于腸炎(潰瘍性結(jié)腸炎)的治療。該藥物在我國內(nèi)地沒有上市銷售,與國內(nèi)常見益生菌制劑比較,其活菌含量高、種類也較多(8種),推薦使用劑量大,價格貴,但有一定的冷藏和運輸(常溫不可超過1周)限制,故國內(nèi)罕有VSL#3治療腸炎的相關報道。本研究通過觀察VSL#3對實驗性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群平衡的影響,對比傳統(tǒng)腸炎治療藥物5-ASA,證實VSL#3可能通過糾正腸道菌群平衡達到抑制腸炎的作用。關于選取何種細菌來代表菌群成分,本研究僅僅選擇了3種細菌作菌群分析,原因在于這3種細菌很具有代表性,培養(yǎng)鑒定的方法成熟。雖然沒有文獻能夠指明腸道中哪些屬于益生菌和哪些屬于致病菌(或有害菌),但乳酸菌和雙歧桿菌多數(shù)被認為是益生菌,也構(gòu)成了VSL#38種配方菌中的7種,大腸桿菌也在多數(shù)研究中作為非益生菌的代表(雖然某些大腸桿菌菌株,如E.coli1917也是傳統(tǒng)意義上的益生菌代表)。結(jié)果表明基于16SrRNA/rDNA的PCR技術(shù)能夠取得與傳統(tǒng)方法類似的結(jié)果。本研究主要采用細菌16SrRNA/rDNAPCR技術(shù)對菌群中多種細菌的相對量進行測定,與傳統(tǒng)菌群分析技術(shù)比較,PCR方法更加便捷,能檢測的菌群種類更廣泛,可為尋找其他的腸炎致病菌開辟新的途徑。本研究顯示,由于大便樣本的含水量存在個體、組間、甚至是時間上的差異,