中藥指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用

中藥指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用

隨著中醫(yī)藥在國際的廣泛應(yīng)用，其有效性和安全性引起了人們的關(guān)注。建立高品質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以保證藥物的安全性、有效性是一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)。中藥質(zhì)量控制一直都是中藥研究與生產(chǎn)中的難點(diǎn)和熱點(diǎn),也是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要基礎(chǔ)和關(guān)鍵;而且目前國內(nèi)中藥質(zhì)量控制的模式和手段具有很多局限性,已成為中藥打入國際市場的主要障礙之一。我國目前推行的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系是由區(qū)分優(yōu)劣的定量指標(biāo)(包括純度、異物、灰分、水分等)和辨別真?zhèn)蔚亩ㄐ灾笜?biāo)(包括產(chǎn)地、采收期、形狀、特征、顏色反應(yīng)、浸出物等)組成的。由藥材中單一或幾個(gè)化合物來對一種或幾種藥材定性或定量標(biāo)定是一種普遍現(xiàn)象,其控制的是中藥中的某部分組分,忽略了中藥中多種成分、多種機(jī)制的協(xié)同作用,難以全面衡量中藥的療效和質(zhì)量。經(jīng)過二十幾年發(fā)展的中藥指紋圖譜在中藥質(zhì)量的綜合評價(jià)和控制方面邁進(jìn)了一大步,被認(rèn)為是中藥質(zhì)量控制的里程碑,已由最初的在方法和技術(shù)方面的基礎(chǔ)研究,開始逐漸進(jìn)入到中藥質(zhì)量控制和評價(jià)的實(shí)際應(yīng)用中。指紋圖譜是基于對中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識,借助于波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖,是實(shí)現(xiàn)鑒別中藥真實(shí)性、評價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式,具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點(diǎn)。指紋圖譜包括了對已知成分和未知成分的分析,反映的化學(xué)成分信息(具體表現(xiàn)為相對保留時(shí)間和相對峰面積)具有高度特異性和選擇性,可較充分地反映出中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分量分布的整體狀況,尤其是在現(xiàn)階段有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下,能夠結(jié)合各種色譜、光譜、波譜手段,特征性地鑒定中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣,成為中藥自身的“化學(xué)條碼”。因此,中藥指紋圖譜能較全面地反映藥材所含化學(xué)成分的相對關(guān)系,體現(xiàn)了中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性,與中醫(yī)藥的傳統(tǒng)理論相適應(yīng),能真正對中藥內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效表征、綜合評價(jià)和全面控制,尤其適用于有效成分不完全明確或不需要完全明確的情況下,對中藥材及中藥產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。中藥指紋圖譜除能用于考察中藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、采收部位、炮制加工、儲存時(shí)間等因素,以提供依據(jù)鑒別生產(chǎn)前原料藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣,更可用于中藥生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制:追蹤制劑中某些化學(xué)成分的變化,監(jiān)測原料藥材與成品之間、成品的各批次間質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性。本文將以指紋圖譜所用技術(shù)(化學(xué)指紋圖譜、生物指紋圖譜和代謝指紋圖譜三大類)及分析方法為依據(jù)分類闡述近年來指紋圖譜研究進(jìn)展,并指出指紋圖譜在未來研究中應(yīng)注意的問題,以期指紋圖譜能為中藥質(zhì)量控制、中藥的現(xiàn)代化和國際化提供有益的參考。1指紋圖譜的測定化學(xué)指紋圖譜是依據(jù)中藥中所含化學(xué)成分種類及其量用不同的儀器、方法檢測得到的指紋圖譜。根據(jù)所用方法的不同將中藥化學(xué)指紋圖譜分為2類:波(光)譜指紋圖譜、色譜指紋圖譜。1.1x-ct實(shí)驗(yàn)光譜指紋圖譜中常用的有紅外光譜、近紅外光譜、紫外光譜以及X射線衍射光譜、核磁共振等。由于這些方法能夠給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)信息,部分信息也可能與特定的化學(xué)成分有直接關(guān)聯(lián),所以它們在中藥指紋圖譜的研究中僅是作為輔助手段。1.1.1網(wǎng)絡(luò)在線質(zhì)量控制紅外光譜法測定的是物質(zhì)中分子吸收光譜,是由分子振動或轉(zhuǎn)動引起偶極距的凈變化產(chǎn)生,不同物質(zhì)有其特征指紋性。近些年來,近紅外光譜用于中藥質(zhì)量控制尤其廣泛。由于近紅外光譜儀具有體積小、分析速度快及受溫度、壓力和振動等外部因素干擾小等優(yōu)點(diǎn),已充分應(yīng)用于中藥的加工過程監(jiān)控和質(zhì)量控制,不僅可以對原藥材、飲片、成藥、顆粒劑以及注射劑等連續(xù)的加工過程進(jìn)行在線的質(zhì)量控制,而且對于藥材的提取過程也可以進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控。孫素琴等以紅外光譜法對地黃、正紅花油的分析以及對鹿角、鹿茸、鹿角霜的鑒別為例指出:中藥多組分化合物的紅外光譜中,具有同一類官能團(tuán)的多種成分可整體形成疊加峰,對其分析可得物質(zhì)群組的信息,逐步分析后,再逐級利用二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜及二維紅外光譜等分辨能力更高的方法,并借助于光譜數(shù)據(jù)庫檢索、相似度量化評價(jià)、多組分定量分析等識別手段,對多產(chǎn)地的中藥進(jìn)行質(zhì)量控制,能夠真實(shí)反映中藥樣品的整體信息,可進(jìn)行宏觀物質(zhì)群組分析,對特定的群組進(jìn)行微觀分析,并可對多成分進(jìn)行定量分析。整個(gè)分析過程直接、簡便、合理、有效,可從源頭開始,建立從整體到局部、從定性到定量的全過程、全成分的分析體系。Fournier等應(yīng)用一種特殊形式的二維四波混頻紅外振動光譜(2DIRFWM)作為可能的蛋白質(zhì)指紋識別工具,可以測定某些肽的氨基酸量。Vijayalakshmi等用紫外-可見光譜和紅外光譜指紋圖譜比較和評價(jià)鐵力木根提取物的提取率,每個(gè)提取物和官能團(tuán)在500~3500cm-1區(qū)域內(nèi)可出現(xiàn)指紋光譜。1.1.2紫外吸收光譜法檢測不同產(chǎn)地、異質(zhì)期時(shí)性別外在樣品的表達(dá)拉曼光譜具有無需預(yù)處理、不需破壞樣品、分析速度快、靈敏度較高、樣品濃度低的特點(diǎn),為中藥的質(zhì)量控制、中藥有效成分的微量分析與深層次研究提供了一種新的方便而可靠的分析方法。孟慶華等建立了一種計(jì)算紫外光譜相似度的方法,實(shí)現(xiàn)對中藥注射液質(zhì)量的控制。用紫外吸收光譜上所有數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算樣品紫外光譜和多個(gè)對照品紫外光譜的相似度并求出平均值,通過該平均值與閾值的比較對樣品質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。鄒華彬等采用紫外指紋圖譜技術(shù)和雙指標(biāo)(共有峰率和變異峰率)序列分析法對不同產(chǎn)地、不同采集年份的白芍及相近植物赤芍、丹皮進(jìn)行了定量評價(jià)。結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)采用的藥材范圍內(nèi),相近產(chǎn)地的白芍具有最相近的關(guān)系,不同產(chǎn)地的白芍之間存在著較明顯的差異,同一地區(qū)不同年份的白芍之間有較明顯的差異,并可以明確區(qū)分白芍及丹皮,并可對至少2個(gè)樣品進(jìn)行定量評價(jià),為白芍質(zhì)量的準(zhǔn)確定量評價(jià)提供了一種新方法。冀憲領(lǐng)等對紫外指紋圖譜鑒定(別)白僵蠶質(zhì)量的可行性進(jìn)行了分析,初步建立了可應(yīng)用于白僵蠶鑒別的紫外指紋圖譜技術(shù),該方法可為白僵蠶的質(zhì)量控制提供依據(jù)。1.1.4關(guān)血清指紋圖譜的研究大多數(shù)中藥成分具有熒光性質(zhì),熒光光譜能形象地反映出熒光組分的各種信息,特別是所有熒光組分的種類和量的信息分別都會反映在光譜上,使得每種中藥的熒光光譜有所差異而具有了良好的指紋性;如果再結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù),根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確認(rèn),便可達(dá)到對中藥的識別和質(zhì)量控制等目的。張瑜等建立關(guān)黃柏的1H-NMR指紋圖譜方法,對關(guān)黃柏的總提取物、總生物堿提取物和總檸檬苦素提取物三者的指紋圖譜進(jìn)行對比分析研究。結(jié)果表明,關(guān)黃柏總提取物的指紋圖譜主要顯示小檗堿、巴馬汀的特征共振信號;關(guān)黃柏總生物堿提取物的指紋圖譜主要顯示小檗堿、巴馬汀和黃柏堿的特征共振信號;關(guān)黃柏總檸檬苦素提取物的指紋圖譜主要顯示黃柏酮、黃柏內(nèi)酯的特征共振信號;各圖譜能夠很好地表征出主要成分的特征信號,可以作為關(guān)黃柏指紋圖譜研究的輔助方法以控制中藥質(zhì)量。姜苗苗等應(yīng)用1H-NMR技術(shù)建立銀翹解毒液的指紋圖譜,并應(yīng)用Excel2003軟件計(jì)算10批銀翹解毒液樣品相似度,其中8批樣品的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦相似度在0.97以上,另外2批相似度在0.82~0.91。該指紋圖譜專屬性強(qiáng),準(zhǔn)確可行,能全面、快速、客觀地反映其質(zhì)量特征,可用于銀翹解毒口服液類中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價(jià)和控制。Lin等通過1H-NMR指紋圖譜方法分別檢測1~6年生栽培干人參,產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集使用主成分分析和聚類分析,建立一個(gè)能夠真實(shí)、明確區(qū)分人參栽培年限的質(zhì)量監(jiān)控方法。1.1.6準(zhǔn)確可靠,形成標(biāo)準(zhǔn)檢測體系X射線衍射是用X射線對被測樣品進(jìn)行照射而產(chǎn)生的衍射圖譜(如Fourier指紋圖譜的幾何拓?fù)鋱D形和特征衍射峰等),是各組分衍射效應(yīng)的疊加,是恒定組成的樣品的特征圖譜。X射線衍射法對樣品前處理只需進(jìn)行物理(粉碎)加工,不需化學(xué)處理,可保持樣品組分全貌,所需樣品量小,操作快捷方便,所獲得的圖譜信息量大、指紋性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠,作為樣品定性鑒別的依據(jù)可靠性強(qiáng)。目前建立的方法中以動物、礦石類藥材居多,但也不乏植物藥材。Wang等建立了大黃的X射線衍射指紋圖譜方法并對3個(gè)產(chǎn)地的大黃進(jìn)行檢測和圖譜峰差異性評價(jià)和整體相似性評價(jià)。結(jié)果顯示:3個(gè)樣品所含的化學(xué)成分相同,但量不相等,其衍射圖譜及衍射峰值具有一定的指紋特征,表明X射線衍射法可為區(qū)分不同產(chǎn)地大黃藥材的質(zhì)量及鑒別提供依據(jù),是鑒別不同產(chǎn)區(qū)的大黃及其他中藥材的一種快捷有效的方法。趙翠等采用X射線衍射技術(shù)對8個(gè)煅硼砂樣品進(jìn)行定性分析,并對各樣品共有峰進(jìn)行相似度分析。結(jié)果顯示:其中7個(gè)樣品衍射圖譜幾何拓?fù)涮卣骰疽恢?后經(jīng)夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法計(jì)算,發(fā)現(xiàn)不同樣品X射線衍射圖譜共有峰相似度均較高,與聚類分析結(jié)果一致,表明X射線衍射指紋圖譜分析方法專屬性強(qiáng),準(zhǔn)確可靠,可實(shí)現(xiàn)對煅硼砂的鑒別和質(zhì)量評價(jià)。劉廣楨等建立冰硼散X射線衍射分析方法,對市售8個(gè)廠家冰硼散進(jìn)行X射線衍射指紋圖譜分析及特征標(biāo)記峰鑒別,發(fā)現(xiàn)不同廠家冰硼散樣品X射線衍射圖譜中均可檢出冰片、玄明粉和朱砂的特征峰,部分樣品可檢出硼砂的特征峰。該方法可用于冰硼散的鑒定。1.2中藥產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)符合我國的國情色譜法是分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣泛的分析方法之一,也是中藥指紋圖譜最基本的技術(shù)和現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵技術(shù),非常適合我國的國情。常用的色譜指紋圖譜技術(shù)有薄層色譜指紋圖譜、液相色譜指紋圖譜、氣相色譜指紋圖譜、高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜等。各種技術(shù)均有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),適用范圍也各有差別,選擇何種色譜指紋圖譜技術(shù)取決于供試品的性質(zhì)和研究目的。1.2.1色譜指紋圖譜薄層色譜是應(yīng)用最普遍的鑒別手段,多國藥典都采用其作為必不可少的藥材鑒別方法。薄層色譜具有經(jīng)濟(jì)、簡便、直觀、快速、時(shí)效高、適用廣、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),以及效能低、受環(huán)境影響大、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。楊成等應(yīng)用高效薄層色譜法和薄層掃描技術(shù)獲得了可用于區(qū)分來自冬蟲夏草、靈芝、黃芪、人參、西洋參和三七的6種多糖組分的薄層色譜指紋圖譜。雷敬衛(wèi)等為鑒別生熟地黃及考察熟地黃飲片質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性而建立了薄層色譜指紋圖譜方法,結(jié)果顯示10批清蒸和10批酒燉樣品間的相似程度較高,飲片質(zhì)量比較均一、穩(wěn)定,與《中國藥典》2010年版中規(guī)定的鑒別方法比較,反映的信息更豐富、更具說服力。Galal等建立了白花丹葉薄層色譜指紋圖譜的方法,對3種白花丹(藍(lán)花丹PlumbagoauriculataLamk.、紫花丹P.indicaL.和白花丹P.zeylanicaL.)的葉、莖和根進(jìn)行分析,結(jié)果表明,三者的葉和根差異明顯,而莖無明顯差異。1.2.2羌活藥材質(zhì)量評價(jià)高效液相色譜是研究指紋圖譜應(yīng)用最廣泛的方法之一,具有分離效能高、分析速度快及儀器自動化等特點(diǎn),依托正相色譜和反相色譜兩大技術(shù)、紫外檢測器(UV)、熒光檢測器(FD)、電化學(xué)檢測器(ECD)、蒸發(fā)激光光散射檢測器(ELSD)、示差折光檢測器(RID)、二極管陣列檢測器(DAD)、質(zhì)譜檢測器(MS)等多種檢測器以及種類豐富的色譜柱,使得液相色譜法適用性非常強(qiáng)。王海波等通過對65種不同來源羌活藥材的熒光指紋圖譜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,構(gòu)建羌活的高效液相-熒光指紋圖譜質(zhì)控方法,確定了羌活藥材質(zhì)量評價(jià)熒光指紋譜的基準(zhǔn)樣本值,得到20個(gè)共有指紋色譜峰,各羌活樣品與基準(zhǔn)樣本相似度值均在0.8以上。周慧等分別采用高效液相色譜技術(shù)和ESI-MS技術(shù)得到了分離度、精密度和重現(xiàn)性均較好的刺五加葉HPLC-UV及ESI-MS指紋圖譜,并成功鑒別了刺五加葉與山楂葉,可為刺五加葉的質(zhì)量控制提供參考。Xiong等建立了普通針毛蕨的高效液相指紋色譜法鑒定和質(zhì)控方法,圖譜中有11個(gè)特征峰,并可同時(shí)定量分析原芹黃酮、原芹黃素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、芹黃素4′-O-β-D-葡萄糖苷和芹黃素4種物質(zhì)的量,該方法可靠、快速。Zhao等建立了牛膝的高效液相指紋色譜質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),確定其中3個(gè)峰為蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮,并,進(jìn)行定量HPLC-UV分析,量化分析了懷牛膝、尖葉牛膝、結(jié)球甘藍(lán)和川牛膝4種同屬藥材。結(jié)果表明,該方法是良好的評價(jià)牛膝質(zhì)量的方法。Dou等用LC-DAD和LC-ESI-MS-MS聯(lián)用方法對黃連解毒湯進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),由C18色譜柱分離得到25個(gè)色譜峰,其中對13個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行ESI-MS鑒定,7個(gè)成分進(jìn)行LC-DAD定量分析,用該方法能夠更充分、完整地監(jiān)測及評價(jià)黃連解毒湯的質(zhì)量。1.2.3藥物gc-ms鑒別氣相色譜指紋圖譜主要應(yīng)用于含揮發(fā)性成分較多的中藥材及中藥制劑的質(zhì)量鑒定和質(zhì)量控制,具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。沈振鐸等建立了評價(jià)五味子質(zhì)量的氣相色譜指紋圖譜分析和鑒定方法,根據(jù)聚類和相似度分析結(jié)果對南五味子、北五味子進(jìn)行了鑒別,確定了北五味子、南五味子揮發(fā)油類成分中各自的28個(gè)和16個(gè)共有峰。吳志成等提取了海南沉香揮發(fā)油并對其進(jìn)行GC-MS分析,建立了海南沉香藥材揮發(fā)油的GC指紋圖譜,并對10批海南沉香藥材進(jìn)行分析,相似度為0.913~0.997。該方法穩(wěn)定性好、特征性強(qiáng),可作為海南沉香藥材地道性鑒定的一種新手段。李紅梅等采用水蒸氣蒸餾和正己烷萃取藿香正氣水,以正十七烷為參照物經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜柱(含F(xiàn)ID檢測器)進(jìn)行了分析,對10批次藿香正氣水進(jìn)行檢測,建立了該藥品的GC指紋圖譜,并標(biāo)示了16個(gè)共有指紋峰。該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,為進(jìn)一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究和質(zhì)量控制提供依據(jù)。Jiao等建立了廣東海風(fēng)藤提取物GC-MS指紋圖譜,并對色譜圖中的23個(gè)主要特征峰進(jìn)行了鑒定,通過SPSS進(jìn)行分層聚類分析,10個(gè)批次的相似度值較低,該藥材可分為三大類。該方法重現(xiàn)性好,提供了一個(gè)有效控制海風(fēng)藤質(zhì)量的方法。1.2.4指紋圖譜的建立及研究分析毛細(xì)管電泳已被用于分析中藥中生物堿、黃酮(黃酮苷)、酚酸、香豆素、醌類、強(qiáng)心苷、皂苷、葡萄糖異硫氰酸鹽等成分,具有抗污染能力強(qiáng)、前處理簡單、分析運(yùn)行成本低、水溶性樣品的指紋特征強(qiáng)等特點(diǎn),而且在分析基質(zhì)復(fù)雜的樣品和運(yùn)行費(fèi)用方面比HPLC方法有著極為突出的優(yōu)越性,同時(shí)已有性能較好的國產(chǎn)儀器。王麗聰?shù)扔妹?xì)管電泳法研究運(yùn)行緩沖液的濃度和酸度、檢測波長及分離電壓對黃芩藥材指紋圖譜的影響,得到了優(yōu)化的測定條件(50mmol/L硼砂緩沖液,pH值7.94,分離電壓為20kV,柱上254nm紫外檢測),從而建立了不同產(chǎn)地黃芩藥材的指紋圖譜,通過對10批次藥材的測定,結(jié)果與實(shí)際樣品分類相符合,為黃芩藥材的質(zhì)量控制提供了新的參考。崔洋等建立了連翹的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜共有模式,確定了12個(gè)共有峰,并對不同產(chǎn)地、不同采收部位藥材進(jìn)行了比較和評價(jià)。結(jié)果顯示:河北產(chǎn)連翹藥材指紋圖譜較相似,山西、河南產(chǎn)與河北產(chǎn)質(zhì)量相近,不同部位連翹藥材化學(xué)成分差異較大。郭濤等采用高效毛細(xì)管電泳法建立以10批當(dāng)歸道地藥材、10批川芎道地藥材、10批紅花道地藥材、10批心舒口服液的指紋圖譜,分別建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,再分別對制劑、單味藥材水煎液、各藥材陰性對照液的指紋圖譜進(jìn)行在線紫外光譜和遷移時(shí)間的比較,初步確定了樣品制劑與原料藥材指紋圖譜之間的相關(guān)性,最終建立復(fù)方中藥制劑心舒口服液的質(zhì)量控制方法。1.2.5指紋圖譜檢測高速逆流色譜分離原理是利用螺旋柱產(chǎn)生巨大離心力,使螺旋柱中互不相溶的兩相不斷反復(fù)進(jìn)行混合和靜置這一頻率極高的分配過程,可使樣品在兩相之間不斷反復(fù)地進(jìn)行分配,由于樣品中各組分分配系數(shù)不同,導(dǎo)致在螺旋柱中的移動速度不同,因而能使樣品各組分依次得到分離。高速逆流色譜技術(shù)的特點(diǎn):操作簡單易行,應(yīng)用范圍廣,無需固體載體,產(chǎn)品純度高,使得其他色譜技術(shù)中可能出現(xiàn)的樣品吸附、損失、污染和色譜峰拖尾等問題得到解決。目前,該技術(shù)主要應(yīng)用于分離和提純方面,如果在各組分洗脫出口處串聯(lián)上適當(dāng)?shù)臋z測器,其檢測信號譜圖則為指紋圖譜,且具有分析成本底、易于操作、性能可靠、儀器價(jià)格低廉、分離和分析同時(shí)完成等優(yōu)點(diǎn)。Gu等用高速逆流色譜法研究丹參指紋圖譜,用高速逆流色譜儀分離純化丹參脂溶性成分,選用正己烷-乙醇-水(10∶5.5∶4.5)體系進(jìn)行分步洗脫,3個(gè)丹參樣品分別分離得到12個(gè)相同的洗脫組分,但相對量有較大差異,說明高速逆流色譜法可以體現(xiàn)中藥化學(xué)成分濃度分布的狀況,表明高速逆流色譜法作為指紋圖譜研究方法具有可行性。沈平孃等建立了五味子的高速逆流色譜指紋圖譜方法,得到的譜圖有13個(gè)特征峰,對分離得到的4種成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素)進(jìn)行檢測,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于97%,對建立五味子高速逆流色譜指紋圖譜質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了有益的探索。2生物遺傳檢測中藥生物指紋圖譜主要應(yīng)用于植物遺傳育種研究以及種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、假種辨別等方面,包括蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜和DNA(基因組學(xué))指紋圖譜。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì),是在空間和時(shí)間上動態(tài)變化的整體,其研究主要依賴三大技術(shù),即雙向電泳技術(shù)、電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)。中藥材DNA指紋圖譜多運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從不同生物樣品中人工合成DNA片段,這種DNA片段的大小、數(shù)目因不同生物而不同,所以直接分析的是生物遺傳因子,只能用于藥材種質(zhì)資源的考察。其分析技術(shù)目前主要有DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simplesequencerepeat,ISSR)和擴(kuò)增限制性片段多態(tài)性(amplifiedrestrictionfragmentpolymorphism,AFLP)。蔣軍富等用篩選出的兩條隨機(jī)引物對不同采集地絞股藍(lán)及烏蘞莓基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增樣品中的具有相同遷移率的1條DNA片段進(jìn)行克隆、測序、一致性分析,并在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上進(jìn)行Blastn比對檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該DNA序列為新發(fā)現(xiàn)序列,以上2條引物能分別擴(kuò)增得到絞股藍(lán)與烏蘞莓樣品基因組的差異性DNA片段,可以明確區(qū)別絞股藍(lán)與烏蘞莓,為絞股藍(lán)的品種鑒定、輔助選擇育種等研究奠定了基礎(chǔ)。高霞等利用RAPD標(biāo)記對膜莢黃芪(父本)和斜莖黃芪(母本)及其雜交種黃芪草進(jìn)行了指紋圖譜及遺傳相似度分析。結(jié)果表明,黃芪草在引物P3和P5的擴(kuò)增圖譜中分別具有l(wèi)條和2條特異帶,而父本與母本無此特異帶;在引物P4的擴(kuò)增下父本具有一條特異帶,而其余5份材料均未出現(xiàn)該特異帶;黃芪草與其父本遺傳相似系數(shù)較小,而與母本遺傳相似系數(shù)較大,其遺傳偏向母本。Rana等把相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)標(biāo)記法用于31個(gè)品種的麻黃遺傳多樣性研究,43個(gè)引物對擴(kuò)增出394個(gè)條帶,其中89%的條帶覆蓋了所有31個(gè)品種,43個(gè)引物對其中24個(gè)品種可以唯一標(biāo)識,結(jié)果表明,SRAP標(biāo)記可以有效地用于黃麻遺傳多樣性分析,對于確定黃麻的種質(zhì)是非常有用的。3復(fù)配體的檢測方法代謝指紋圖譜的研究有2種:一種是植物和中藥的代謝組學(xué)研究,主要研究不同的處置方式(包括栽培、環(huán)境、病蟲害、采集、加工和貯存)對中藥材的影響,以及提取物的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制等;另一方面,研究中藥對動物、人體代謝組的影響,以進(jìn)行藥物安全性評價(jià)和發(fā)現(xiàn)生物活性化合物群及其作用機(jī)制研究等。后者目前見諸報(bào)道的較多。中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性決定其經(jīng)體內(nèi)代謝后的入血成分會更加復(fù)雜,而且量一般也很低,所以檢測體液的中藥代謝成分的方法應(yīng)該靈敏、準(zhǔn)確、快速。故代謝組學(xué)研究多以質(zhì)譜法為基礎(chǔ)技術(shù),其主要優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用范圍廣、選擇性和靈敏度高,能提供化合物的相對分子質(zhì)量、元素組成和結(jié)構(gòu)信息。與分離技術(shù)相結(jié)合,可減少代謝物質(zhì)譜的復(fù)雜性,減少離子抑制效應(yīng)并進(jìn)一步提供了代謝物的物理化學(xué)性質(zhì)。Tianniam等根據(jù)經(jīng)驗(yàn)豐富的藥工判斷采自不同氣候條件和不同加工方式的日本當(dāng)歸的品質(zhì)(分為高、中、低3個(gè)等級),然后利用GC-TOF/MS技術(shù)結(jié)合主成分分析其質(zhì)量的差異。結(jié)果表明,質(zhì)量差的當(dāng)歸果糖和葡萄糖的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中、高質(zhì)量的當(dāng)歸。Fang等在不同時(shí)間點(diǎn)采集舌下含服復(fù)方丹參滴丸后的人血漿樣品,通過微血管張力實(shí)驗(yàn)測試血管擴(kuò)張效果,采用柱切換系統(tǒng)對樣品進(jìn)行富集純化,再測定血漿中活性成分的代謝特征指紋圖譜。結(jié)果表明,1.5h采集的血漿擴(kuò)張血管能力最強(qiáng),在色譜圖中出現(xiàn)5個(gè)新的色譜峰,與復(fù)方丹參滴丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)關(guān)系密切。汪江山等運(yùn)用UPLC/TOF-MS測定尿液代謝物的變化,建立了大鼠iv人參皂苷Rg3后的尿液代謝指紋圖譜,且得到了其中2種發(fā)生顯著變化的代謝物的結(jié)構(gòu)信息。Wang等用結(jié)合LC-MS的代謝組學(xué)法對紅景天提取物的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià),共成功分離和檢測到紅景天提取物中131個(gè)峰,結(jié)果表明不同紅景天提取物的質(zhì)量差異主要體現(xiàn)在6個(gè)成分,絡(luò)賽維(rosavin)的量對其質(zhì)量影響較大。4化學(xué)信息的獲取與處理指紋圖譜方法結(jié)合現(xiàn)代化學(xué)測量儀器,給出的有關(guān)定性和定量的信息量遠(yuǎn)比任何單一成分的測量所得的信息量要多得多,如何提取、分析和處理所需要的有用的化學(xué)信息還要借助于化學(xué)信息學(xué)和計(jì)量學(xué)中有關(guān)數(shù)據(jù)的提取與處理、信息基礎(chǔ)理論等手段。在對中藥指紋圖譜進(jìn)行評價(jià)時(shí),只要好好把握中藥指紋圖譜整體性和模糊性這兩大特征,建立直觀而又全面、合理而又簡易、精確而又方便的中藥色譜指紋圖譜計(jì)算機(jī)處理方法,就可能對中藥指紋圖譜的質(zhì)量進(jìn)行合理評價(jià)。4.1化學(xué)識別方法4.1.1分析方法方法是根據(jù)物質(zhì)所含化學(xué)成分信息,用計(jì)算機(jī)對其進(jìn)行分類或描述,其能夠較好地迎合指紋圖譜整體性和模糊性的要求,分為無監(jiān)督方法和監(jiān)督方法。(1)無監(jiān)督的模式識別方法:用圖譜信息對樣本進(jìn)行歸類,特別適用于不利用或沒有樣本所屬類別信息的情況,其將復(fù)雜的數(shù)據(jù)以分類圖的形式顯示出來進(jìn)行系統(tǒng)分析。常用方法包括主成分分析(principlecomponentanalysis,PCA)和系統(tǒng)聚類分析(hierarchicalclusteringanalysis,HCA)等。(2)監(jiān)督模式識別方法:其基本思路是用一組已知類別的樣本作為訓(xùn)練集得到類別間判別模型,使各類樣品間達(dá)到最大的分離,并利用建立的多參數(shù)模型對未知的樣本進(jìn)行預(yù)測。常用方法包括:偏最小二乘法(partialleastsquares,PLS)、簇類獨(dú)立軟模式分類法(softindependentmodelingofclassanalogy,SIMCA)、線性判別分析(lineardiscriminantanalysis,LDA)、K鄰域判別法(K2nearestneighboranalysis,KNN)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)(artificialneuralnetworks,ANN)等。4.1.2系統(tǒng)的研究方法包括廣義夾角余弦法(cosineofgeneralizedangle,CGA)、星座圖技術(shù)(constellationgraphingtechnique)、典型相關(guān)分析(canonicalcorrelationanalysis,CCA)、模糊信息分析法(fuzzyinformationanalysis)、灰色關(guān)聯(lián)聚類法(grayrelationalgradecluster,GRGC)等。4.2對中藥指紋圖譜相似度評價(jià)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)其他相似度評價(jià)方法主要有相關(guān)系數(shù)法(correlationcoefficient)、夾角余弦法(inter-anglecosine;vectorcosine)、模糊尖T-分布法(fuzzydistribution)、總量統(tǒng)計(jì)矩相似度法(thetotalquantumstatisticalmomentsimilarity)、歐氏距離法(euclideandistanceanalysis)、相對熵方法(relativeentropy)、相似系統(tǒng)理論(similaritysystemtheory)、組合相似度評價(jià)方法(combinationsimilarity)、馬氏距離法(mahalanobisdistanceanalysis)、全定性全定量相似度法(overallqualitativesimilarityandoverallquantitativesimilaritymethod)、權(quán)值非均一性相似度法(similaritymethodofassigningthedifferentweightaccordingtodifferentsizeofthepeak)、乘方相似度和定量乘方相似度法(averageinvolutionsimilarityandthequantitativeinvolutionsimilarity)、假設(shè)檢驗(yàn)法(hypothesistest)等。以上任意一種方法在中藥指紋圖譜相似度評價(jià)中的應(yīng)用均非全部適用,需要科研工作者不斷實(shí)驗(yàn)和遴選,從而選擇最佳的評價(jià)方法,以期使指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制上能發(fā)揮其獨(dú)特的作用。另外,隨著各種相似度評價(jià)方法與計(jì)算機(jī)、可視化軟件的不斷深入結(jié)合,各種綜合性評價(jià)系統(tǒng)軟件和專家評價(jià)系統(tǒng)軟件也在不斷被研發(fā)出來,甚至應(yīng)用于中藥指紋圖譜相似度評價(jià)上,為使用者帶來了極大方便,很大程度地促進(jìn)了中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步,而指紋圖譜技術(shù)的進(jìn)步對于相似度評價(jià)方法的要求必定也會越來越苛刻,需要更多專業(yè)人才綜合多學(xué)科知識進(jìn)行相似度評價(jià)系統(tǒng)的研發(fā)和改進(jìn)。5指紋圖譜技術(shù)的研究與僅檢測若干種物質(zhì)的量相比,中藥指紋圖譜具有很多優(yōu)越性,可以最大程度地綜合評價(jià)中藥及其制劑的質(zhì)量。中藥指紋圖譜應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究已有20年左右時(shí)間,隨著越來越多的儀器和方法被用于指紋圖譜技術(shù)研究,越來越多的藥材及制劑的指紋圖譜方法被開發(fā)用于質(zhì)量控制,可以預(yù)見,距離其成為各種中藥及復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系中必備的一部分的時(shí)間已經(jīng)不遠(yuǎn)。但是,在研究過程中,中藥指紋圖譜應(yīng)該被擴(kuò)展應(yīng)用的空間還是很大,為求更好地控制中藥和中藥制劑的質(zhì)量、解決目前在中藥指紋圖譜研究中遇到的問題(如何劃定合適的相似度的界限以區(qū)分合格與不合格的藥材及各種中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品,如何判斷一種指紋圖譜方法能夠比較好地控制和評價(jià)中藥質(zhì)量的好壞等),今后應(yīng)該從以下幾個(gè)方面加大研究力度。5.1質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確立中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系從內(nèi)容上可以分為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、過程質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)3個(gè)部分;其中,藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是良好質(zhì)量的源頭,過程質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是良好質(zhì)量的保證,產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是良好質(zhì)量的最終體現(xiàn)。這3個(gè)部分可以體現(xiàn)中藥原料藥材在被加工制備成中藥制劑的過程中各種化學(xué)成分的綜合變遷,使質(zhì)量控制的技術(shù)和指標(biāo)得以深入和細(xì)化,更能保證制劑的均一和穩(wěn)定。中藥指紋圖譜由于其獨(dú)特的優(yōu)勢,如果加大研究力度,從中藥材到產(chǎn)品的整個(gè)提取分離制備過程中,根據(jù)不同工藝步驟的質(zhì)量控制水平建立不同層次的過程質(zhì)量控制指紋圖譜,實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性控制,從而建立制劑制備過程質(zhì)量控制指紋圖譜體系,那么會使得中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的建立不再是紙上談兵,迎來一個(gè)美好的前景。5.2中藥代謝指紋圖譜的應(yīng)用中藥代謝指紋圖譜是近些年來研究的熱點(diǎn),其通過監(jiān)測中藥的入血成分間接表征其藥理效應(yīng),比中藥化學(xué)指紋圖譜更直接地反映中藥的質(zhì)量,而且代謝指紋圖譜不僅將中藥質(zhì)量比較的著眼點(diǎn)放在共有的化學(xué)信息上面,還能顯著地體現(xiàn)出差異性成分的信息,因此,中藥代謝指紋圖譜對于中藥的質(zhì)量控制具有重要意義,甚至似乎更能反映中藥的質(zhì)量。所以,筆者認(rèn)為應(yīng)該把中藥化學(xué)指紋圖譜和中藥代謝指紋圖譜研究聯(lián)合起來進(jìn)行物質(zhì)追蹤和比較,在比較中藥化學(xué)指紋圖譜的相似度時(shí),可以考慮增加主要代謝物及其原形物質(zhì)的相似性的權(quán)重,這對于恰當(dāng)?shù)脑O(shè)定相似度、更好地評判中藥質(zhì)量,甚至深入的研究譜效學(xué)指紋圖譜與組效學(xué)指紋圖譜都具有重要的意義。5.3建立中藥質(zhì)量控制數(shù)據(jù)庫目前研究中藥指紋圖譜的技術(shù)和手段多種多樣,缺少系統(tǒng)的有機(jī)整合比較,筆者認(rèn)為很有必要建立各種手段的指紋圖譜的綜合數(shù)據(jù)庫,以求得到中藥質(zhì)量控制的網(wǎng)狀立體體系,使整個(gè)中藥質(zhì)量控制不再片面和偏頗,而變得完整