sz誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的建立及病理觀察

sz誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的建立及病理觀察

糖尿病性腎衰竭（dkd）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是腎衰竭（esr）的主要原因。近年來的研究表明,DKD的發(fā)病率呈上升趨勢,然而其發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明。因此建立理想的DM實(shí)驗(yàn)動物模型是研究DKD發(fā)病及防治機(jī)制的重要手段。然而,在建立DM模型過程中常常因大鼠的高死亡率而導(dǎo)致成模率低。為此,本實(shí)驗(yàn)通過客觀分析鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DM模型建立過程中存在的問題及注意事項,為造模率的提高提供借鑒。1材料和方法1.1許可證號、體質(zhì)量、濕度清潔級雄性SD大鼠100只,8周齡,購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心,生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2008-1B,體質(zhì)量(200±20)g。動物室溫度控制在21~25℃,濕度控制在65%~69%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),12h晝夜交替,自由進(jìn)水進(jìn)食,每籠5只,保持籠內(nèi)清潔。1.2檢測儀器及檢測STZ(Sigma公司,美國)規(guī)格:1g/瓶(滅菌裝),2~8℃保存,購自北京市博愛港商貿(mào)有限公司;苦味酸(2,4,6-三硝基酚,臺山市眾城化工有限公司);大鼠代謝籠(北京萊爾凈化設(shè)備有限公司);血糖儀及血糖試紙(長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司);高爾寶目測尿糖試紙(廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司);腎之寶微量尿白蛋白(MAU)檢測試劑盒(膠體金法)(上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司);肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒、甘油三酯試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司);總膽固醇檢測試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司);HITACHI全自動生化分析儀(日立儀器(蘇州)有限公司):儀器型號:7600-010。全自動尿液干化學(xué)分析儀(日本京都),儀器型號:AX-4280。1.3實(shí)驗(yàn)計劃1.3.1造模及檢測結(jié)果雄性SD大鼠100只,隨機(jī)分為兩組,正常對照組(10只),實(shí)驗(yàn)組(90只)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,造模前將大鼠禁食12h,將STZ用0.01mmol/L、pH為4.5的檸檬酸鈉緩沖液配成1%的濃度,按65mg/kg體質(zhì)量的劑量對實(shí)驗(yàn)組行一次性腹腔注射,正常對照組則用等量的檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射。DM造模標(biāo)準(zhǔn):注射72h后檢測空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG),FBG≥16.7mmol/L視為造模成功。根據(jù)造模標(biāo)準(zhǔn),將實(shí)驗(yàn)組分為模型組以及未成模組。1.3.2般資料及分析方法整個實(shí)驗(yàn)共觀察8周,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前24h,將大鼠放入代謝籠中,收集各組大鼠尿液,記錄尿量并送至我院檢驗(yàn)科做尿常規(guī)檢測。用10%的水合氯醛(3.5mL/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后,經(jīng)心臟采血,室溫放置,2500r/min,離心10min,分離血清,檢測肝功能、腎功能以及血脂。一般情況觀察:觀察各組大鼠的一般狀況,如體質(zhì)量、進(jìn)食、飲水的量、小便的量,色以及氣味等。血糖:采用血糖儀以及配套血糖試紙進(jìn)行血糖監(jiān)測,檢測血糖前禁食8h,各組大鼠經(jīng)剪尾尖放血法檢測FPG。尿糖:采用尿糖試紙對尿糖水平進(jìn)行半定量檢測。尿蛋白:采用膠體金法,檢測微量尿白蛋白(MAU)。肌酐、尿素氮:分別采用肌氨酸氧化酶法和紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測。白蛋白、總蛋白:分別采用溴甲酚綠法和雙縮脲比色法檢測。膽固醇、甘油三酯:分別采用酶比色法和甘油磷酸氧化酶法檢測。KHI:大鼠處死后摘取左腎,用分析天平稱重,計算腎臟肥大指數(shù)(KHI),KHI(‰)=腎質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×1000‰。1.3.3中性甲醛法死亡大鼠先進(jìn)行大體解剖,后摘取左腎(稱重后去除被膜)和肺臟,浸泡于10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液固定,作常規(guī)石蠟包埋組織塊,5μm超薄切片,行HE染色,光鏡下觀察腎臟及肺臟的病理改變。1.4統(tǒng)計方法計量資料以ue0af±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率表示,采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1z誘導(dǎo)大鼠的噴灑行為實(shí)驗(yàn)過程中,正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好,動作自如,反應(yīng)靈敏,毛色光滑;腹腔注射STZ誘導(dǎo)后,實(shí)驗(yàn)組大鼠毛色粗糙,精神萎靡,反應(yīng)略遲鈍,弓背彎曲。由表1可見,與正常對照組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠的進(jìn)食量、尿量以及飲水量均增加,而且尿液出現(xiàn)泡沫增多的現(xiàn)象;與正常對照組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠的尿液酸臭味更加明顯。但未成模組大鼠進(jìn)食量、尿量及飲水量少于模型組。2.2未成對大鼠和未成模大鼠的死亡率比較整個實(shí)驗(yàn)過程中,正常對照組無大鼠死亡,模型組死亡25只(47.17%),未成模組死亡14只(37.83%)。與正常對照組相比,模型組大鼠以及未成模大鼠的死亡率均升高(P<0.05);而模型組大鼠的死亡率又高于未成模組(P<0.05)。2.3病理組織學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射STZ48h后開始出現(xiàn)大鼠的死亡,對死亡大鼠進(jìn)行解剖。解剖時可見部分大鼠出現(xiàn)肺水腫,肺臟與胸廓廣泛粘連,出現(xiàn)肺水腫的肺臟在病理上主要表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜明顯增厚,肺泡間隔增寬,間質(zhì)中膠原和彈性蛋白含量增多,部分肺泡腔萎縮甚至塌陷,部分肺泡腔內(nèi)有多量炎癥細(xì)胞浸潤,并可見片狀壞死。肺水腫外觀圖片及病理見圖1;部分大鼠出現(xiàn)腎膿腫,表現(xiàn)為腎臟與周圍組織廣泛粘連,表面凹凸不平,呈顆粒狀,切開時發(fā)現(xiàn)腎臟上下極常存在單個或多個膿腔,內(nèi)含乳白色液體,腎膿腫圖片及病理詳見圖2。實(shí)驗(yàn)組大鼠因各種病因死亡的只數(shù)和死亡時間,見表2。2.4血糖及尿量水平與正常對照組相比,模型組以及未成模組的血糖以及尿量均升高(P<0.05);與未成模組大鼠相比,模型組大鼠的血糖以及尿量水平均升高(P<0.05)。在模型組中,與未死亡大鼠相比,死亡大鼠的血糖以及尿量水平更高(P<0.05);在未成模組,死亡大鼠與未死亡大鼠在血糖水平相當(dāng),前者尿量更高(P<0.05),見表3。2.5模型大鼠與未成組裝大鼠的心肌尿素氮、khi水平的比較從表4可以看出,與正常對照組相比,模型組以及未成模組的體質(zhì)量、模型組死亡大鼠的總蛋白、模型組以及未成模組的白蛋白、模型組以及未成模組死亡大鼠的膽固醇及甘油三酯水平較低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組以及未成模組的肌酐、尿素氮水平更高(P<0.05)。在模型組,與未死亡大鼠相比,死亡大鼠的體質(zhì)量、總蛋白、白蛋白、膽固醇以及甘油三酯的水平更低(P<0.05)。肌酐、尿素氮以及KHI的水平更高(P<0.05);在未成模組,與未死亡大鼠相比,死亡大鼠的體質(zhì)量、白蛋白、膽固醇以及甘油三酯的水平更低(P<0.05)。而肌酐、尿素氮以及KHI的水平更高(P<0.05);與未成模組中死亡大鼠相比,模型組中死亡大鼠的體質(zhì)量、總蛋白以及白蛋白的水平更低,兩者相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與未成模組未死亡大鼠相比,模型組未死亡大鼠的體質(zhì)量以及白蛋白水平更低,肌酐水平更高(P<0.05)。2.6不同大鼠尿常規(guī)的紅細(xì)胞及紅細(xì)胞的水平及培養(yǎng)率與正常對照組的尿常規(guī)相比,模型組及未成模組的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和感染率較高(P<0.05);無論是模型組還是未成模組,與未死亡大鼠相比,死亡大鼠尿常規(guī)中紅細(xì)胞以及白細(xì)胞的水平及尿路感染率更高(P<0.05);在組間,與未成模組死亡大鼠以及未死亡大鼠的尿路感染率相比,模型組死亡大鼠以及未死亡大鼠的感染率更高(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表4。3stz分次注射糖尿病模型DM實(shí)驗(yàn)性動物模型的造模方法有許多種,如化學(xué)藥物誘導(dǎo)(主要指用STZ、四氧嘧啶誘導(dǎo)等)、胰腺切除、自發(fā)性模型以及轉(zhuǎn)基因模型等。其中,STZ誘導(dǎo)模型是最常用的模型,該模型通過利用STZ的選擇性毒性作用,導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷,從而造成胰島素分泌不足,產(chǎn)生DM,而對其他臟器如肝腎等的損害很輕。雖然STZ和四氧嘧啶都是通過引起β細(xì)胞損傷而導(dǎo)致DM的發(fā)生,但是四氧嘧啶在破壞胰島β細(xì)胞的同時,也可同時造成肝、腎等器官和組織的中毒性損害。因此,STZ誘發(fā)的DM動物模型常用于研究DKD。但是該方法動物的死亡率高,因此在建立模型時常存在較大的困難。本研究采用了經(jīng)典的STZ誘導(dǎo)DM大鼠模型的制作方案,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,我們的實(shí)驗(yàn)迅速地建立了1型DM模型,主要表現(xiàn)為血糖升高,尿糖陽性,尿蛋白陽性及多食、多飲、多尿以及體質(zhì)量下降的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)的成模率為58.89%,較報道的成模率(60%~65%)略低,考慮可能與STZ的純度、地域差別、環(huán)境條件、是否現(xiàn)配現(xiàn)用以及注射技巧等因素有關(guān)。王洪敏等研究發(fā)現(xiàn),以20mg/kg體質(zhì)量行單次腹腔注射STZ時,雄性SD大鼠均未成模,并且該組大鼠無死亡;STZ的劑量為30mg/kg時,大鼠的成模率為16.7%,死亡率為0;STZ的劑量為50mg/kg時,大鼠的成模率為91.7%,死亡率為0;然而,STZ的劑量為80mg/kg時,大鼠的成模率為58.3%,死亡率為33.4%。由此可以推斷:血糖的變化與STZ劑量有關(guān)。劑量過低,不足以造成胰島細(xì)胞的顯著破壞引起高血糖,只有胰島細(xì)胞大量損傷時才會導(dǎo)致糖尿病發(fā)生,而劑量過大,則會導(dǎo)致造模大鼠的急性死亡。DiLeo等采用60mg/kg的STZ單次腹腔注射劑量研究糖尿病大鼠模型,以血糖水平大于16mmol/L作為造模標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)大鼠飼料中補(bǔ)充?；撬峥梢越档痛笫蟮乃劳雎?同時發(fā)現(xiàn)較低的血糖水平與存活率的改善無相關(guān)性。由此可推斷,血糖因素并非是引起DM大鼠死亡的主要因素。因此,對STZ注射誘導(dǎo)DM大鼠模型死亡的原因加以分析并防范具有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)中觀察到了大鼠體質(zhì)量的顯著下降,原因可能與以下幾方面有關(guān):(1)DM本身的高分解代謝狀態(tài);(2)DM模型大鼠由于本身的多飲多尿以及外源性水分補(bǔ)充不足等,共同造成機(jī)體的脫水狀態(tài);(3)STZ本身的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)過程中,正常雄性SD大鼠無死亡。相對而言,模型組以及未模組的死亡率均顯著升高,注射STZ后的大鼠在48h后開始出現(xiàn)死亡,1周內(nèi)為死亡的高峰期,1~4周為死亡的集中期。針對死亡大鼠的解剖及病理結(jié)果,我們推測大鼠死亡的原因可能與以下幾個方面有關(guān):(1)感染。對注射STZ后1~4周的死亡大鼠進(jìn)行解剖,我們發(fā)現(xiàn)部分大鼠存在明顯的肺水腫以及腎膿腫的現(xiàn)象,病理結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了感染的存在。我們的研究表明,無論是模型組還是未成模組,死亡大鼠與未死亡大鼠相比,具有體質(zhì)量低、總蛋白和白蛋白及血脂低下的現(xiàn)象,由此我們推測,營養(yǎng)不良或許是大鼠易于感染的重要因素;另一方面,注射STZ后無論是模型組還是未模組大鼠,它們的抵抗力普遍降低,分析我們換墊料的次數(shù),我們推測勤換墊料可能是導(dǎo)致肺部感染的一個重要誘因。因?yàn)閴|料里面存在很多的碎屑以及粉末等,這些直徑微小的粉末可能會通過呼吸道吸入肺內(nèi),造成肺部的感染。(2)營養(yǎng)不良。注射STZ后,我們發(fā)現(xiàn)無論是模型組還是未模組的大鼠,毛色較正常均會更加粗糙,無光澤。體質(zhì)量下降明顯,身體呈現(xiàn)弓背樣彎曲,行走時四肢無力,精神欠佳。上述的變化估計與DM本身造成的高分解代謝有關(guān),由于未成模組部分大鼠也會表現(xiàn)為體質(zhì)量的下降,身體呈現(xiàn)弓背樣彎曲的現(xiàn)象,因此我們推測注射STZ后嚴(yán)重干擾了機(jī)體的代謝平衡,從而造成營養(yǎng)不良。這與死亡大鼠的低體重、低蛋白血癥、膽固醇以及血脂水平的降低相一致,同時也與鼠的高感染率相符合。(3)淋巴循環(huán)受阻。經(jīng)過對注射STZ后死亡的大鼠進(jìn)行解剖后,我們發(fā)現(xiàn)部分大鼠的肺臟以及腎臟與周圍組織廣泛粘連,病變器官較正常顯著增大,而且將病變器官縱行切開后會發(fā)現(xiàn)病變器官存在多個膿腔,內(nèi)含乳白色液體,疑似乳糜液,因此推測病變可能與淋巴循環(huán)受阻有關(guān)。(4)其他。對注射