新型固定化酶載體的制備與性能研究

新型固定化酶載體的制備與性能研究

甲基丙烯酸甘油三酯是一種含有多官能團(tuán)的丙烯酸酯衍生物。結(jié)構(gòu)中的不均勻二醇很容易形成共聚反應(yīng)。活性強(qiáng)的環(huán)氧樹(shù)脂可以水解成羥基，增加親水性，這很容易與氨基酸、胺基和其他官能團(tuán)產(chǎn)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)。這是一種新的基質(zhì)。它主要用于丙烯酸粉末涂料、乳膠涂料、紡織皮革整理劑、膠黏劑、醫(yī)藥等。Kramer等以甲基丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸縮水甘油酯和丙烯基縮水甘油醚等單體共聚化合得到一種具有環(huán)氧活性基的多孔球狀載體。這種載體固定化青霉素酰化酶具有許多優(yōu)良特性:多孔性特征為酶蛋白的固定提供了較大的空間和表面。Ding等制備了基于聚甲基丙烯酸鹽-二乙烯基苯樹(shù)脂載體的固定化木瓜蛋白酶,他們通過(guò)戊二醛的橫向交聯(lián)或重氮化合物共價(jià)結(jié)合的方法將木瓜蛋白酶固定在聚合物表面。研究結(jié)果表明,固定化木瓜蛋白酶顯示出了優(yōu)異的使用穩(wěn)定性能,良好的再使用能力和頑強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。目前,德國(guó)Rom公司生產(chǎn)的一種商品名為EupergitC的酶固定化載體,該載體富含環(huán)氧基團(tuán)。EupergitC對(duì)酶蛋白具有吸附能力,載體所具有的多孔性,為酶蛋白的固定提供了較大的空間和表面積。研究表明,含有環(huán)氧基團(tuán)的高分子聚合物,表面的環(huán)氧基團(tuán)可以在十分溫和的條件下與酶分子中的氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合,使酶分子固定于聚合物載體表面,從而一步實(shí)現(xiàn)酶的固定化。但由于酶經(jīng)傳統(tǒng)共價(jià)結(jié)合法固定后活力回收率較低,故采用在固定化酶載體上連接一定長(zhǎng)度的親水性分子鏈,通過(guò)戊二醛交聯(lián)吸附后再與酶結(jié)合,這樣的柔性載體在固定化過(guò)程中有足夠的緩沖作用,可以最大程度地保持酶的原有構(gòu)象和酶蛋白的自恢能力,基于這種認(rèn)識(shí),本實(shí)驗(yàn)采取有機(jī)胺與該新型載體發(fā)生胺解反應(yīng)。不少學(xué)者對(duì)GMA與二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)共聚體系進(jìn)行了深入而細(xì)致的研究。本工作采用傳統(tǒng)懸浮聚合法制備了GMA-EGDMA-DVB三元共聚物,對(duì)載體的孔結(jié)構(gòu)和載體在不同溶劑中的溶脹行為進(jìn)行了研究,并以有機(jī)胺對(duì)載體進(jìn)行胺解行為研究,最后對(duì)載體進(jìn)行固定化木瓜蛋白酶的實(shí)驗(yàn)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1化學(xué)試劑及試劑甲基丙烯酸縮水甘油酯、二乙烯基苯(DVB),藍(lán)曉公司提供,工業(yè)級(jí);二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA),合肥安邦化工有限公司,化學(xué)純;明膠,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,生化試劑;過(guò)氧化苯甲酰(BPO),上海山浦化工有限公司,化學(xué)純;甲苯,天津市富宇精細(xì)化工有限公司,分析純;聚丙二醇(PPG)系列,江蘇海安石油化工有限公司,工業(yè)級(jí);乙二胺,天津市天力化學(xué)試劑有限公司,分析純。1.2觀察聚合物的表征紅外吸收光譜在TENSOR27傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)BRUKER公司)上測(cè)定,用KBr壓片。觀察聚合物形貌用DMM-330型電子顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)和JSM-6700F型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社JEOL)。孔結(jié)構(gòu)由Autopore9500壓汞儀表征。酶活性的測(cè)定方法通過(guò)UV751GD紫外分光光度計(jì)(上海儀器分析總廠)來(lái)完成。1.3樹(shù)脂顆粒的制備向裝有攪拌器、回流冷凝管和溫度計(jì)的1L三口瓶中加入360mL含1%明膠、15%NaCl的水溶液,升至一定溫度,攪拌30min后加入GMA18.9g、一定量的DVB和EGDMA、一定比例的甲苯和其它致孔劑、0.3gBPO、數(shù)滴次甲基藍(lán),控制一定的攪拌速度,使液滴分散至規(guī)定大小,之后繼續(xù)升溫至65℃,聚合2h,再升溫至85℃,聚合6h,停止反應(yīng),過(guò)濾得到固體球狀產(chǎn)物,再用熱水、縮甲醛和冷水洗滌,置于真空烘箱中干燥至恒重,得到有一定孔結(jié)構(gòu)的樹(shù)脂顆粒。1.4丙酮索氏的提取采用有機(jī)胺對(duì)載體樹(shù)脂進(jìn)行胺解反應(yīng)以引入活性胺基基團(tuán)。稱取一定量的載體和乙二醇,溶脹24h后,加入一定量的乙二胺或多乙烯多胺,在65℃反應(yīng)6h,冷卻,產(chǎn)物用大量去離子水沖洗至中性,丙酮索氏提取12h,真空干燥。1.5載體溶脹系數(shù)、溶膠率和弱堿交換量的測(cè)定失水率測(cè)定將樹(shù)脂離心去掉表面水分,用電子天平準(zhǔn)確稱取約1g到稱量瓶?jī)?nèi),(105±2)℃干燥2h再次稱重。X=[(m2-m3)/(m2-m1)]×100%,其中m1為空稱量瓶的質(zhì)量;m2為濕態(tài)樹(shù)脂加稱量瓶質(zhì)量;m3為烘干后樹(shù)脂加稱量瓶質(zhì)量。樹(shù)脂的失水率即為1-X。載體溶脹系數(shù)的測(cè)定選用不同溶度參數(shù)的溶劑包括水,浸泡一定量載體24h后,測(cè)定載體浸泡前后的體積變化,則可得到共聚物載體的溶脹率W=[(V1-V0)/V0]×100%,式中V0、V1分別為載體溶脹前后的體積。環(huán)氧基濃度的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12-13]。胺化樹(shù)脂弱堿交換量測(cè)定用減量法稱取mg樹(shù)脂,在錐形瓶中加入100mL濃度為C1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸,浸泡,振蕩過(guò)夜,反應(yīng)完全后準(zhǔn)確吸取25mL的上層清液于錐形瓶中,以酚酞為指示劑,用濃度為C2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至微紅色,消耗NaOH溶液為V2。用以下公式計(jì)算樹(shù)脂的弱堿交換量X(mmol/g)=(100C1-4C2V2)/m1.6固定化酶載體的制備稱取一定量酶粉,用pH值7.2的磷酸緩沖液(0.1mol/L)配成1g/L的酶液,向裝有0.5g經(jīng)由戊二醛交聯(lián)后的載體的錐形瓶中加入20mL配好的酶液,室溫下,在搖床中振蕩反應(yīng)12h,吸取上層酶液,用磷酸緩沖液清洗固定化酶載體。所得固定化酶放于4℃冰箱中保存。1.7酶活性的測(cè)定木瓜蛋白酶的一個(gè)活力單位(U)相當(dāng)于單位時(shí)間內(nèi)釋放1μg的酪氨酸。酶活力測(cè)定按文獻(xiàn)進(jìn)行。2結(jié)果與討論2.1gma-egda-dvb產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)表征圖1(1)是GMA單體的紅外譜圖,在1722cm-1處有酯基的羰基吸收峰,在908cm-1、844cm-1、815cm-1處有環(huán)氧基吸收峰。圖1(2)是GMA-EGDMA-DVB共聚物的紅外譜圖,可以看出在908cm-1、846cm-1處出現(xiàn)了環(huán)氧基的醚鍵(C—O—C)的伸縮振動(dòng)吸收。從產(chǎn)物的紅外譜圖可以看出,合成的新型載體中含有反應(yīng)性環(huán)氧功能基。根據(jù)此基團(tuán)的特性可以研究載體的功能化反應(yīng)。利用掃描電子顯微鏡研究了三元共聚物的微觀結(jié)構(gòu),如圖2所示。從SEM照片可以看出,共聚物有很好的球形度和粒徑分布,粒徑分布較為狹窄,主要在0.105~0.211mm之間,共聚物內(nèi)部孔道分布均勻。2.2反應(yīng)時(shí)間時(shí)間失水率的測(cè)定樹(shù)脂的孔容對(duì)樹(shù)脂的固定化酶性能有非常大的影響。本文在制備樹(shù)脂時(shí),加入了甲苯及PPG系列作為致孔劑。樹(shù)脂的失水率在一定程度上可以反映樹(shù)脂孔容的大小,圖3為不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)失水率的大小,由此可以說(shuō)明所制備的樹(shù)脂具有比較大的孔容,能夠滿足后續(xù)固定化酶的需求。從圖3分析可知,曲線變化與共聚過(guò)程中相應(yīng)階段孔容的理論變化大致相同,聚合過(guò)程中交聯(lián)微球聚集,大孔結(jié)構(gòu)的微球逐漸生成,孔容不斷增加,聚合結(jié)束,水蒸氣蒸餾開(kāi)始,孔開(kāi)始收縮,孔容開(kāi)始減小。2.3交聯(lián)劑對(duì)聚合物支撐結(jié)構(gòu)和性能的影響2.3.1孔徑分布的變化其它條件不變情況下,只改變交聯(lián)劑的用量,用壓汞儀對(duì)不同交聯(lián)度的載體孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,結(jié)果見(jiàn)表1。交聯(lián)劑一般為多官能團(tuán)化合物。交聯(lián)度的增加使得共聚初期鏈內(nèi)交聯(lián)和共聚過(guò)程中鏈間交聯(lián)的程度加劇,微凝膠和微孔數(shù)量增多使平均孔徑和孔容減小,比表面積增大。當(dāng)交聯(lián)強(qiáng)度增加到一定值時(shí),比表面積不再增大。表1中的樣品4的孔徑分布曲線見(jiàn)圖4。由圖4可知,采用甲苯和PPG1000為致孔劑制備出的顆粒的孔徑在26nm以下分布的比較多,從壓汞儀數(shù)據(jù)可知,在26nm以下的孔區(qū)占總孔體積的85.1%,最小孔徑達(dá)到約5.84nm,總孔隙率為66.54%。2.3.2聯(lián)席會(huì)議度對(duì)dma活性的影響隨后對(duì)胺解反應(yīng)后的載體進(jìn)行了固定化木瓜蛋白酶的實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。木瓜蛋白酶與經(jīng)由戊二醛交聯(lián)吸附后的5種不同交聯(lián)劑用量的載體鍵合固定化后都能表現(xiàn)出較高的酶活性。當(dāng)致孔劑量一定時(shí),隨著載體交聯(lián)度的升高,固定化酶的活力均有一定提高,但達(dá)到一個(gè)最高值后又有下降現(xiàn)象。這是因?yàn)楫?dāng)交聯(lián)度逐漸增大,載體的孔結(jié)構(gòu)得到改善,比表面積增加,有利于孔脹大過(guò)程,因而溶脹性能改善,有利于酶活力的提高。但當(dāng)交聯(lián)度過(guò)高時(shí),由于交聯(lián)過(guò)于密集,孔徑減小,其不利酶活性的發(fā)揮而導(dǎo)致活力下降。當(dāng)交聯(lián)度為35%的時(shí)候,活性最大。從圖6可知,隨著載體交聯(lián)度的增長(zhǎng),測(cè)得的載體環(huán)氧基濃度呈下降趨勢(shì)。這是由于交聯(lián)劑用量的增加,也就意味著降低了單體GMA的投料量,因而環(huán)氧基的含量會(huì)減小,另外交聯(lián)劑用量越高,共聚物內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密,這樣就使得戊二醛交聯(lián)反應(yīng)的位點(diǎn)減少,進(jìn)而導(dǎo)致載酶量的減少,表現(xiàn)為固定化酶的酶活也隨之下降。但是交聯(lián)度太低會(huì)影響載體的機(jī)械強(qiáng)度,因此交聯(lián)度以確保載體合適機(jī)械強(qiáng)度為宜。此外本文還研究了重復(fù)反應(yīng)5次后的固定化酶,酶剩余活力保持在80.1%左右,說(shuō)明其具有較好的操作穩(wěn)定性。在該懸浮聚合體系中,交聯(lián)劑的用量對(duì)共聚物的表面性質(zhì)及孔結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,從而影響著聚合物對(duì)木瓜蛋白酶的固定化效果。2.4分子密度對(duì)活性物質(zhì)表達(dá)的影響載體的溶脹性能是影響其固定化酶等生物活性物質(zhì)的重要因素,適當(dāng)?shù)娜苊浛梢允馆d體骨架間的空隙增大,有利于提高酶等生物活性物質(zhì)分子在載體內(nèi)部的傳質(zhì)速度,并使載體分子鏈上的反應(yīng)性環(huán)氧基得以充分利用。載體在水、甲醇、乙二醇、DMF、丙酮、甲苯中的溶脹情況如表2所示。由表2可知,載體在DMF和乙二醇中溶脹情況最優(yōu),但又由于DMF毒性較大,故采用乙二醇溶脹。2.5gma-dvb-egda的胺化前后的譜圖分析基于引入親水性分子鏈,為了探討酶等生物活性物質(zhì)與環(huán)氧基載體之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的理論依據(jù),研究了載體與一些有機(jī)胺化合物的胺解反應(yīng)。圖7是載體與乙二胺發(fā)生胺解反應(yīng)所形成的共聚物的紅外譜圖,比較GMA-DVB-EGDMA樹(shù)脂胺化前后的譜圖發(fā)現(xiàn),3100~3500cm-1為—NH2的吸收峰,酯羰基的特征吸收峰有所移位,同時(shí)在1680cm-1處出現(xiàn)了酰胺羰基的特征吸收峰,胺化后樹(shù)脂譜圖中環(huán)氧基的吸收峰明顯減弱,而且3300cm-1左右的吸收峰加強(qiáng),而胺基的特征吸收峰剛好出現(xiàn)在這里。另外通過(guò)對(duì)載體元素分析,N、C、H元素含量分別為2.68%、56.91%、8.317%,可以得出產(chǎn)物中含有氮元素,由此可以說(shuō)明在共聚物上的環(huán)氧基與胺基發(fā)生胺解反應(yīng),從而為載體用于酶等含有胺基的生物活性物質(zhì)分子的固定化提供了依據(jù)。2.5.1胺化試劑種類對(duì)固定化酶活性的影響用乙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺等多乙烯多胺,于相同條件下對(duì)多孔樹(shù)脂進(jìn)行胺解。如圖8所示。從圖8可以看出,在胺化試劑過(guò)量的情況下,固定化酶的活性隨著胺化試劑種類的不同變化不大,其中四乙烯五胺所對(duì)應(yīng)的固定化酶的活性偏大。這主要是因?yàn)樗囊蚁┪灏诽峁┑陌妨看?能結(jié)合更多的環(huán)氧基團(tuán),這樣酶分子在物理吸附和化學(xué)共價(jià)結(jié)合的共同作用下更多地連接在載體上,顯示出更高的酶活性。2.5.2不同交聯(lián)度對(duì)樹(shù)脂胺化的影響樹(shù)脂被胺解過(guò)后,其含有伯、仲、叔胺基,這一類的陰離子交換樹(shù)脂稱為弱堿樹(shù)脂。以下討論交聯(lián)度和溶脹劑對(duì)胺基弱堿交換量E的影響。當(dāng)選擇試劑為乙二胺,交聯(lián)度對(duì)產(chǎn)物弱堿交換量的影響見(jiàn)表3。由表3可知,弱堿交換量隨著交聯(lián)度的增大而減小,當(dāng)交聯(lián)度由15%增大到55%,樹(shù)脂弱堿交換量由7.19mmol/g減小到4.95mmol/g。這種變化的原因如下:一由于交聯(lián)度的增加,樹(shù)脂表面可胺解的酯基數(shù)量減小;二是由于交聯(lián)度的增加,樹(shù)脂骨架結(jié)構(gòu)趨于緊密,反應(yīng)基團(tuán)的可接近性降低。溶脹劑對(duì)樹(shù)脂胺化有較大的影響,具體見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用正丙醇和異丙醇為溶脹劑,所得的樹(shù)脂有較大的交換容量,并不發(fā)生結(jié)塊,異丙醇來(lái)源較廣泛,價(jià)格較便宜,沸點(diǎn)較低,有